专利名称：Hpse基因作为猪免疫性状相关的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于猪的分子标记辅助选择技术领域，具体涉及一种作为猪标记辅助选择 的与免疫性状相关的分子标记的克隆及应用。本发明的分子标记与HPSE基因有关。
背景技术：
近10年以来，现代育种技术使猪的生产性能(生长，胴体与肉质性状)得到了显 著的改良，而对猪健康及抵抗疾病能力的遗传改良却重视不够。疾病一直是畜牧业生产中 的一项重要环节。提高管理水平、改善卫生环境、注射药物和疫苗等预防性措施，在预防疾 病发生中确实起了重要的作用。但它们都不能从根本上解决预防疾病这个难题。提高机体 的自然抗病力成了目前研究的重点，尤其是抗病育种。在抗病育种中，抗病基因的寻找是关键。目前国内外已鉴定出的主要抗病候选基 因有以下几个(1)肠毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起仔猪 泻痢的主要病原体之一，它可引发仔猪黄痢、白痢、猪水肿病等多种大肠杆菌病。目前研究 的热点主要集中在 K88 (F4)、K99 (F5)、987P、1741 (F6)、F17 (FY、Att25)、F18、F42、F165 等 ETEC的受体基因上(施启顺，猪肠毒素大肠杆菌抗性基因及抗病育种。第11次全国动物 遗传育种学术会议论文集，中国农业出版社，2001，229-333)。研究表明动物体内如果缺乏 大肠杆菌K88受体或F18受体，就会对相应的血清型大肠杆菌引起的腹泻产生抗性，目前在 猪ETEC菌株已鉴定的K88突变型有三种K88ab、K88ac和K88ad(Mooi等，1985. Molecular biology of fimbriae of enterotoxigenic Escherichia coli. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 118 :119-138.)。目前编码大肠杆菌K88受体(K88abR和K88acR)的基因已经定位 在猪13号染色体上靠近转铁蛋白基因的位置(Edfors-LiIja等，The porcine intestinal receptor for Escherichia coliK88ab. K88ac :regional localization on chromosome 13and influenve of IgG response to the K88antigen. Anim Genet, 1997, 26 :237_242), α-(1，2)-海藻糖转移酶 1 (a (1,2) fucosyltransferase, FUT1)基因是 F18 受体(ECF18R) 的候选基因，位于猪 6 号染色体上(Meijerink 等，Two α (1，2) fucosyltransferase genes on porcine chromosome 6qll are closely linked to the blood groupinhibitor(s)and Escherichia coli F18 receptor(ECF18R)loci. Mamm Genome, 1997,8 :736_741)。(2)NRAMPl(natural resistance associatedmacrophage protein 1， 天然 抗性相关的巨噬蛋白)基因最初发现小鼠对细胞内病原微生物侵染所具有的抗性或 敏感性是受1号染色体上显性基因Beg、Ity或Ish控制的，由此将该类基因命名为 NRAMPl0 NRAMPl编码具有完整膜的磷酸糖蛋白，含有10-12个推定的转膜区域，具有离 子通道禾口转运功能的特征(Cellier 等，Resistance to intracellular infections comparative genomic analysis of NRAMP1. Trends Genet. 1996Jun ； 12 (6) 201-4 ；Vidal 等’ Naturalresistance to intracellular infections Nrampl encodes a membrane phosphoglycoprotein absentin macrophages from susceptible(Nrampl D169)mouse
3strains. J Immunol. 19960ct 15 ；157 (8) :3559_68· 1996)。NRAMPl 蛋白可抵抗分枝杆菌、 沙门氏菌等多种胞内寄生病原菌的侵染而发挥重要的免疫功能，对畜禽机体抗病力影响 较大(吴宏梅等，NRAMPl基因研究进展及其在抗病育种中的应用.中国畜牧兽医，2005， 32(4) 26 28.)。此外，MHC已经被证明与抗体对多种抗原的应答、细菌的噬菌作用、对螺旋旋毛 虫和恶性黑素瘤的易感性等性状有相关(Peelman等，A detail physical map of the porcine major histocompatibilitycomplex(MHC) class III region :comparison with human and mouse MHC class III regions. Mamm Genome, 1996,7 :363_367),其它有石if究的 与抗病力有关的基因是MXl (Myxovirus (influenza) resistance 1，粘液病毒(流感)抗性
1) >IL1 (Interleukins 1，^MMiYMD >PPARG(Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma，过氧化物酶体增殖激活受体γ)等基因。上述基因基本上都是根据流行病学和经济选择尺度选择目标疾病而鉴定出的 抗病候选基因。2006年被称为“高热病”的猪高致病性蓝耳病在中国大面积暴发，疫情 波及10多个省(市、区)。这场疫情对大约212万头猪造成影响并导致至少40万头猪 死亡。蓝耳病已成为制约养猪业健康发展的头号传染病。蓝耳病是由高致病性蓝耳病 病毒引起的，该病毒是由受体介导进入宿主细胞的，目前已鉴定出的受体有四个，分别 是硫酸乙酰肝素(ifeparan sulfate，HS) (Delputte 等，Involvement of the matrix protein in attachmentof porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on poreinealveoIar macrophages. J Virol. 2002,76 (9) 4312-20·)、唾液酸黏附素(sialoadhesin, SN) (Delputte 等，Analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus attachment andinternalization distinctive roles for heparan sulphate and sialoadhesin. J Gen Virol. 2005, 86 (Pt 5) :1441-5), CD151(Shanmukhappa 等，Role of CD151, A tetraspanin,in porcine reproductiveand respiratory syndrome virus infection. Virol. 2007,4 62.)禾口 CD163(Calvert,等CD163expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome viruses. JVirol. 2007. 81 (14) :7371_7379)。其中 HS 能将游 离于细胞膜表面的病毒吸附并固定于细胞膜上，起到吸附病毒的作用。该过程决定了病毒 的感染量，在病毒进入细胞的过程中起到至关重要的作用。HS在机体内是以一种蛋白多糖 (Heparan sulfate proteoglycan,HSPG)的形式存在并起作用的，HSPG是由核心蛋白和HS 侧链组成的。而乙酰肝素酶(h印aranase，HPSE)是目前发现的哺乳动物细胞中唯一能切割 细胞外基质中硫酸肝素蛋白多糖侧链一硫酸乙酰肝素Ofeparan sulfate,HS)的内源性糖 苷酶，是抗肿瘤，抗炎症的理想靶点(Vlodavsky等Mammalian heparanase :gene cloning, expression and function intumor progression and metastasis. Nat med. 1999,5 193)。该酶是由基因HPSE编码的，人HPSE基因定位于HAS4q21. 3，其cDNA包含一个1629bp 的开放阅读框，编码一条由543个氨基酸残基组成的多肽链，其相对分子质量为61200。 HSPG多种重要的生理病理作用均与其多糖侧链硫酸乙酰肝素(HS)的酶解有关。类肝素酶 对HS的切割不仅可以破坏组织的完整性，而且可以释放并激活各种与HS结合的活性分子， 从而影响各种生理及病理过程。通过以上资料我们可以得出HPSE基因参与多种生理病理过程并发挥着重要的作用。寻找基因中的变异位点，通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基 因功能的一个重要手段，也是进行标记辅助选择的基础。为此开展了猪HPSE基因的克隆、 表达差异的检测和SNP筛查、检测及与性状关联分析。
发明内容
本发明的目的在于克隆猪HPSE基因的完整CDS序列，寻找HPSE基因的突变位点 以及基因的多态性的检测方法，建立适用于猪免疫性状的分子标记的方法。本发明通过以下技术方案实现从猪HPSE基因片段中克隆得到一种作为猪标记辅助选择的与免疫性状相关的分 子标记，它的完整的编码区序列如序列表SEQ ID NO :1和图2所示，它的部分DNA序列如序 列表SEQ ID NO :2和附图3所述。在SEQ ID NO :1所示序列的第782位碱基处有一个A/ G碱基突变，即在序列表SEQ ID NO 2所示序列的第80位碱基处有一个A80-G80的碱基突 变，该突变位于第5外显子内，导致Alu I-RFLP多态性。申请人:设计了一对克隆猪HPSE基因的CDS引物序列，该引物扩增的CDS序列如 SEQ ID N0:1所述。同时申请人设计了一对包含第5外显子的用于扩增猪HPSE基因组序 列的引物，该引物扩增的序列如SEQID NO 2所述。制备上述分子标记的方法，按照以下步骤从猪血液基因组中提取DNA，用人HPSE基因mRNA为信息探针，作同源序列筛选， 获得同源性80%以上的表达序列标签(EST)；然后拼接猪EST-重叠群，与人同源比对，根 据表达序列标签_重叠群设计引物；用成年大白猪组织样提取总RNA为模板，作RT-PCR扩 增、PCR产物纯化和克隆测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID N0:1所述的cDNA序列 (包括全部CDS)；提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增、PCR产物纯化和测序，获得如序列表 SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。应用常规的PCR-RFLP的方法对序列表SEQ ID NO 2的第80位碱基突变进行了检 测，并初步进行其基因型与猪免疫性状之间的关联分析的应用，为猪的分子标记辅助选择 提供了一个新的分子标记。
序列表SEQ ID NO 1是本发明克隆的猪免疫性状相关基因HPSE的⑶S序列；序列表SEQ ID NO :2是本发明克隆的猪免疫性状相关基因HPSE用于PCR-RFLP部 分DNA序列；图1 是本发明HPSE基因制备的流程图；图2:是本发明中猪HPSE基因用于克隆的CDS片段。所用的引物序列用下划线标 注；图3 是本发明中猪HPSE基因用于PCR-RFLP检测的DNA片段。所用的引物序列 用下划线标注；图4 是本发明中猪HPSE基因Alu I-RFLP的三种基因型(AA AG GG)电泳结果。 图中M =DNA分子量标准(DL2000 ladder)。
具体实施例方式实施例1、HPSE基因的克隆(1)引物设计用人HPSE基因cDNA (GenBank收录号NM_006665. 3)为信息探针，利用NCBI中的 BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列同源性为80%以上的 ESTs (片段长度大于IOObp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/ffeb/Search/index. html)查询相应序列，然后用 GeneTool 中的 ASSEMBLY 程 序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计一对引物M-F和M-R，序列如下HPSE =M-F 5' -AGCCAGGTGAGCCCGAGATG-3‘，M-R 5' -GCATCTGCTCGTGTTCCTAC-3‘。(2)、PCR产物的克隆和测序将纯化后的PCR产物与pMD-18T载体(购自Takara)在4°C水浴过夜连接；无菌状 态下取100 120 μ 1感受态细胞于1. 5ml Ependorff管中，将5 μ 1的连接产物加入混勻， 在冰上放置30min，42°C热激90s，后冰浴3 4min，加入400 μ 1无抗生素的LB液体培养 基，37°C振荡培养45min。取100 μ 1涂布于异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG) Χ-gal的琼 脂平板上，37°C平放Ih后倒置培养。挑取平板上的单菌落，接种于2-3ml LB中，37°C 300r/ min培养过夜。用1.5ml EP管12000r/min离心数秒收集菌体进行制备少量的质粒。验证 后的重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由北京奥科 生物技术有限公司完成。用GeneTooll.O软件中的ASSEMBLY程序进行拼接，得到一条长度 为1735bp的CDS序列(见SEQ ID NO 1所述)。DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information, http://www. ncbi. nlm. nih. gov)网立占 StJ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基 因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。检索结果表明所测序列与 人HPSE基因DNA (GenBank收录号NM_006665. 3)的部分序列同源性达83%。 实施例2、PCR-RFLP诊断方法的建立(1)、引物序列HPSEP-SF 5' -GGATGAAGGCTGGTATTT-3‘(对应于 SEQ ID NO :3)P-SR 5' -TGGGATAAGGCAATACAG-3‘(对应于 SEQ ID NO :4)(2) PCR扩增条件PCR反应总体积20 μ 1，其中猪基因组DNA约lOOng，含1倍的缓冲液(购自 Promega 公司)，1. 5mmol/LMgCl2, dNTP 终浓度为 150 μ mol/L，引物终浓度为 0. 4 μ mol/L, 2U Taq DNA 聚合酶(Promega)。PCR 扩增程序是94°C 3min，循环 35 次 94°C 30s,54°C 30s，然 后72°C 25s，最后72°C延伸5min。PCR反应产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。得到374bp 特异扩增片段，该片段位于第4-5内含子内(如图2)。测序的结果发现在该374bp片段中 存在一个Alu I酶切位点(AG丨CT)，其中第80bp处为多态性切点，位于外显子5中。(3)、PCR-RFLP 检测条件PCR产物酶切反应体积是10 μ 1，其中IXbuffer 1 μ 1，PCR产物3 5 μ 1，限制性内切酶Alu I为0. 3 μ 1 (IOU)，用H2O补足10 μ 1，将样品混勻后离心，37°C水浴4h，用2%琼 脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。对该位点两个纯合子的测序结 果显示，当第80bp位置是G时，则该Alu I酶切位点不存在，Alu I酶切后检测结果只有1 个片段，长度是374bp (定为等位基因G)；但存在G80 — A80的替换时，其结果导致第80bp 处一个Alu I酶切位点的产生，得到2个片段，长度分别为294bp和SObp (定为等位基因 A)，三种基因型AA, AG, GG如图5所述。(4)、本发明的分子标记在猪免疫性状标记性状关联分析中的应用试验共检测了 189头大白猪的多态，确定其基因型，并进行基因型与免疫性状(白 细胞计数(WBC)，红细胞计数(RBC)，血红蛋白(HGB)，红细胞压积(HCT)，红细胞平均体积 (MCV)，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)，免疫球蛋白G(IgG))的关联分析。建立如下所述的 最小二乘模型yiJk = μ +Gi+Cj+P.+Bj+ ε iJk其中，yijk是性状观察值，μ为总体均数，Gi为基因型效应,Cj为品种效应，Pk为父 本效应化为批次效应，为随机误差，假定^k相互独立，服从Ν(0，σ2)分布。基因型 检测结果表明在189个个体中AA基因型，有13个，AG基因型有84个个体，GG基因型有92 个个体。基因型与性状关联分析的结果是HPSE基因与红细胞计数和白细胞计数呈显著相关。由表1可知，HPSE基因SNP位点对红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)和红细胞 压积(HCT)有显著影响(P <0.05)，其中AG基因型个体的红细胞计数、白细胞计数和红细 胞压积都显著高于GG基因个体的对应值，AA基因型个体居中。因此可以看出GG基因型个 体的红细胞计数和白细胞计数较低。表1 猪HPSE基因Alu I-RFLP酶切位点的多态性对血液指标及部分免疫性状的 影响
湖北省武汉市黄陂实验群体(大白猪纯种群体) 注* 表示 P < 0.05，** 表示 P < 0.01,
表中性状值为平均数士标准差。
权利要求
一种作为分子标记应用的与猪免疫性状相关的HPSE基因，它的部分核苷酸序列如序列表SEQ ID NO2所示，在序列表SEQ ID NO2的80bp处有一个A80 G80的碱基替换，导致Alu I RFLP多态性。
2.根据权利要求1所述的基因，其中扩增HPSE基因第5外显子所用的引物对的DNA序 列如下所示正向引物5 ‘ -GGATGAAGGCTGGTATTT-3 ‘，反向引物5 ‘ -TGGGATAAGGCAATACAG-3 ‘。
3.一种制备与猪免疫性状相关的分子标记的方法，其方法包括以下步骤(1)用人HPSE基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得同源性80%以上的表达 序列标签(EST)，然后对EST进行拼接；提取猪肺脏组织总RNA并做cDNA第一链反转录； 设计引物对，其中所述引物对的正向引物为5 ’ -AGCCAGGTGAGCCCGAGATG-3 ’，反向引物为 5，-GCATCTGCTCGTGTTCCTAC-3，，用 RT-PCR 方法扩增猪 HPSE 基因的 cDNA 片段，PCR 产物纯 化克隆和测序，通过序列分析获得如序列表SEQ ID NO :1所述的序列；(2)根据SEQID N0:1所述的序列设计引物对，所述的引物对的正向引物为 5' -GGATGAAGGCTGGTATTT-3 ‘，反向引物为 5' -TGGGATAAGGCAATACAG-3 ‘扩增猪基因组 DNA;将PCR产物纯化克隆和测序、通过序列分析获得如序列表SEQ ID NO :2所述的核苷酸 序列。
4.权利要求1所述的基因在猪分子标记辅助育种中的应用。
5.权利要求2所述的引物对在猪分子标记辅助育种中的应用。
全文摘要
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种猪分子标记的制备与应用，从人源HPSE基因中克隆获得一种作为分子标记应用的与猪免疫性状相关的基因片段，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No2所示，在SEQ ID NO2的80bp处有一个A80-G80的碱基替换，导致Alu I-RFLP多态性。本发明还公开了制备与猪免疫性状相关分子标记的方法以及制备的分子标记在猪免疫性状多态性检测中的应用，为猪的标记辅助选择提供了一个新的标记。
文档编号C12N15/11GK101892225SQ20101022306
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者刘榜, 彭中镇, 李文献, 杨华威, 王振华, 王维民, 韩雪蕾 申请人:华中农业大学