专利名称：一种用于检测牙龈卟啉菌及其亚型鉴别的多重pcr试剂盒及使用方法
技术领域：
本发明属于口腔致病菌的检测领域，具体涉及一种用于检测牙龈卟啉菌及其亚型 鉴别的多重PCR试剂盒及使用方法。
背景技术：
牙周病是指发生在牙支持组织的疾病，包括仅累及牙龈组织的牙龈病和波及深层 牙周组织的牙周炎两大类。是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一，也是危害人类牙齿和 全身健康的主要口腔疾病之一。我国成年人中80 % 97 %患有不同程度的牙周疾病。近来 越来越多的研究表明，牙周病与许多系统性疾病如，血管疾病、糖尿病、低体质量早产儿、消 化系统疾病等存在着密切的相关性，成为许多系统性疾病的潜在危险因素。牙周病作为慢 性、非特异性、感染性疾病，其主要感染源为细菌。而牙龈卟啉菌(P. gingivalis)是牙周病 的重要致病菌，与慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、牙周脓肿和牙髓感染以及伴发性全身性系统 疾病密切相关。P. gingivalis是革兰阴性短杆菌，专性厌氧、无芽胞、无动力。基因组G+C 含量为40 52%。研究已证实P. gingivalis存在毒力株和无毒株，无毒株形成了 口腔正 常的微生态群，而毒力株则成为牙周病的重要致病菌。1999年Curtis等在对P. gingivalis W50菌株的研究中发现，其外膜上存在着一个由重组活化基因(recombination activation gene，rag) B编码的相对分子质量为5. 5 X IO4的免疫显性表面抗原。该基因位于ragA基因 的上游，两者为共转录基因，ragA基因编码假定的tonB依赖性受体，同时也发现rag基因座 (ragA和ragB)，仅存在于毒力株中，有利于P. gingivalis在牙周组织中的的定植与致病。 Hall等发现，rag基因座有4种等位基因型，存在遗传多态性，其中rag-Ι型为高毒力基因 型。然而，P. gingivalis遗传的多态性给该菌的诊断及清除带来了巨大的挑战，迄今为止， 临床并无有效地的诊断试剂盒问世。因此P. gingivalis诊断及亚型鉴别诊断试剂盒的发 明，对于防治牙周疾病的发生，提高人民生活质量具有重要意义。
发明内容
P. gingivalis是一种重要的口腔致病菌，存在着致病型与非致病型。非致病型 P. gingivalis构成了 口腔正常的微生物群，而致病型P. gingivalis存在rag基因座。Rag 基因座有四种不同的基因型，其致病能力不同。目前对该菌的诊断主要依靠培养，培养需时 常、步骤繁琐，不利于临床快速诊断的需求，同时培养出的细菌需要进行进一步的PCR鉴定 才能够区分出致病型与非致病型。本发明提供一种快速、简便的方法不仅能够鉴别出有无 P. gingivalis感染而且还能够同时鉴定出其亚型。本发明针对目前P. gingivalis诊断耗时长，步骤繁琐，不利于临床快速诊断的需 求。通过Clustral X比对设计出针对P. gingivalis以及四种不同rag基因型的特异性引 物，保证这些引物扩增片段大小具有明显不同、且具有相同的退火温度。把这五种不同的引 物与Taq酶、buffer, dNTP和ddH20混合做成mix (反应混合液)。2/3页 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种用于检测牙龈卟啉菌及其亚型 鉴别的多重PCR试剂盒，主要成分是下述5种针对牙龈卟啉菌16s rRNA的特异性引物，还 包括其他PCR试剂；针对牙龈卟啉菌16srRNA的特异性引物如下
Forward primer:5，-AGGCAGCTTGCCΑΤΑCTGCG-3，(SEQ ID NO. 1)
Reverse primer:5，-ACTGTTAGCAACTACCGATGT-3，(SEQ ID NO. 2)
ragl(W50)，
Forward primer:5，-CGCGACCCCGAAGGAAAAGAT T-3，(SEQ ID NO. 3)
Reverse primer:5，-CACGGCTCACATAAAGAACGC T-3，(SEQ ID NO. 4)
rag2 (Thai)，
Forward primer:5，-GCTTTGCCGCTTGTGACTTGG-3，(SEQ ID NO. 5)
Reverse primer:5，-CCACCGTCACCGTTCACCTTG-3，(SEQ ID NO. 6)
rag3 (QML)，
Forward primer:5，-CCGGAAGATAAGGCCAAGAAA GA-3，(SEQ ID NO. 7)
Reverse primer:5，-ACGCCAATT CGC CAAAGC T--3，(SEQ ID NO. 8)
rag4(381)，
Forward primer:5，-CCGGATGGAAGTGATGAACAG A-3，(SEQ ID NO. 9)
Reverse primer:5，-CGCGGTAAACCTCAGCAAATT-3，。(SEQ ID NO. 10)
上述所说的PCR试剂是Taq酶、buffer、dNTP和ddH20。
本发明的试剂盒:在使用时，先将5种引物按相同体积混合，制得反应1液；再将其
他PCR试剂混合制得反应2液，然后把反应1液与反应2液混合得到反应混合液。检测时取待检测样本放入到有双蒸水的Ependorf管中，加热煮沸后加入到反应 混合液中进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳，再根据电泳条带的位置确定有无牙龈 卟啉菌及其亚型。具体的操作是用口腔棉拭子，吸取龈沟液，放入到洁净的含有200 μ 1双蒸水的 Ependorf管中，加热煮沸后取4μ 1到6μ 1反应混合液中(10 μ 1反应体系)在任何一台 PCR仪器上进行扩增，然后采用12%的琼脂糖进行琼脂糖凝胶电泳，根据条带的位置不但 能够快速检测出样本中有无P. gingivalis存在，存在的P. gingivalis是致病型还是非致 病型而且能够同时鉴别出是那种致病型。本发明的有益效果是，步骤简便、快速、易于普查以及口腔疾病患者的筛查。
下面结合附图和实施例对本实用新型进一步说明。图1是本发明中的引物设计原理图。图2是mix的制备过程示意图。图3是龈沟液的采集及PCR反应过程示意图。图4是琼脂糖凝胶电泳结果的判断示意图。①阳性对照、②口腔中有牙龈卟啉菌定居、③口腔中有牙龈卟啉菌定居且为ragl 致病型、④口腔中有牙龈卟啉菌定居且为rag2致病型、⑤口腔中有牙龈卟啉菌定居且为rag3致病型、⑥口腔中有牙龈卟啉菌定居且为rag4致病型、⑦阴性对照具体实施例方式在图1中，首先在PUBMED数据库中搜索P. gingivalis 16S rRNA，然后利用primer pick程序设计P. gingivalis引物，同时限定扩增片段的大小、退火温度，并判断该引物扩 增P. gingivalis的特异性；然后在PUBMED基因数据库中下载P. gingivalis rag基因座的 四种不同亚型，利用Clustral X比对四条基因序列，在四条基因高变区设计引物、限定退火 温度、并保证四对扩增引物扩增片段的长短不同，并把设计的引物放入到primer pick程序 中检验其扩增片段的特异性。在图2所示实施例中，首先将五对不同的引物稀释，每对引物按照 1:1:1:1: 1的体积比例混合在一起，做成反应1液。将Taq酶、PCR反应buffer、 dNTP和ddH20按照1 20 16 23体积比例混合，做成反应2液；按反应1液反应2液 为1 2的体积比将反应1液加入到反应2液中做成mix。如图3所示，用棉拭子蘸取就诊病人龈沟液，取出后放入到含有200 μ 1双蒸水的 洁净Ependorf管中，煮沸5分钟，取出4μ 1力口入到6μ 1的反应mix中；离心后进行PCR。 PCR反应条件为95°C预变性5min，95°C变性45s，60°C退火30s，72°C延伸45s，30个循环，最 后72°C延伸10分钟。在图4所示中为琼脂糖凝胶电泳后PCR结果示意图。16S rRNA扩增片段大小 为200bp、ragl扩增片段大小为628bp、rag2扩增片段大小为979bp、rag3扩增片段大小 为423bp、rag4扩增片段大小为738bp。如果仅有16S rRNA片段出现意味着检测样本有 P. gingivalis存在，并不一定意味着是致病型P. gingivalis。若16S rRNA片段与其他任 何一 rag片段(ragl-4)同时出现意味着检测样本中有致病型P. gingivalis存在(图4)。
权利要求
一种用于检测牙龈卟啉菌及其亚型鉴别的多重PCR试剂盒，包括特异性引物和PCR试剂，其特征在于，所说的特异性引物是下述5对针对牙龈卟啉菌16s rRNA的特异性引物，还包括其他；(1)Forward primer5’ AGG CAG CTT GCC ATA CTG CG 3’ Reverse primer5’ ACT GTT AGC AAC TAC CGA TGT 3’(2)Forward primer5’ CGC GAC CCC GAA GGA AAA GAT T 3’ Reverse primer5’ CAC GGC TCA CAT AAA GAA CGC T 3’(3)Forward primer5’ GCT TTG CCG CTT GTG ACT TGG 3’ Reverse frimer5’ CCA CCG TCA CCG TTC ACC TTG 3’(4)Forward primer5’ CCG GAA GAT AAG GCC AAG AAA GA 3’ Reverse primer5’ ACG CCA ATT CGC CAA AGC T 3’(5)Forward primer5’ CCG GAT GGAAGT GAT GAACAGA 3’ Reverse primer5’ CGC GGT AAA CCT CAG CAA ATT 3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中所说的PCR试剂是Taq酶、buffer、 dNTP 禾口 ddH20。
3.权利要求1所述的试剂盒的使用方法，是先将5种引物按相同体积混合，制得反应 1液；再将其他PCR试剂混合制得反应2液，然后把反应1液与反应2液混合得到反应混合 液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，其中所说的反应2液是Taq酶、buffer, dNTP和ddH20按1 20 16 23的体积比混合得到。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，按1 2的体积比将反应1液与反应2液 混合得到反应混合液。
6.根据权利要求3-5之一所述的方法，其特征在于，取待检测样本放入到有双蒸水的 Ependorf管中，加热煮沸后加入到反应混合液中进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳， 再根据电泳条带的位置确定有无牙龈卟啉菌及其亚型。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测牙龈卟啉菌及其亚型鉴别的多重PCR试剂盒及其使用方法。所说的试剂盒包括PCR试剂和5对针对牙龈卟啉菌16s rRNA的特异性引物特异性引物。使用时先将五对特异性检测引物和PCR试剂按照一定比例配成的反应混合液，再将采集的龈沟液煮沸后加入到反应混合液中通过PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带的位置即可确定有无牙龈卟啉菌感染及其感染牙龈卟啉菌的亚型。本发明具有步骤简便、快速的优点。
文档编号C12Q1/04GK101899510SQ20101022297
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月9日 优先权日2010年7月9日 公开号201010222973.发明者周成林, 孔凡芝, 王胜军, 苏兆亮, 许化溪, 郑冬, 陈建国 申请人:江苏大学