从福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中检测基因表达的方法
【专利说明】从福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中检测基因表达的方法发明领域
[0001]本发明涉及检测基因表达的方法，特别涉及从福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法。
【背景技术】
[0002]人类基因组DNA全序列数据的公布标志着生命科学发展已逐步进入基因组学时代。随着分子生物学的充分发展，以核酸为主要研究对象的分子生物学技术越来越广泛地被人类用于疾病诊断的领域，为疾病的预防、预测、诊断和治疗提供信息和决策依据。
[0003]福尔马林固定石醋包埋组织(formalinfixed and paraffin embedded tissues,简称FFPE)作为医疗机构最常用的保存病理组织的方法，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。由于新鲜标本难以得到，为进行实体肿瘤分子生物学研究，对已有病例进行回顾性研究时，只能从石蜡包埋组织中进行基因提取，因此石蜡包埋组织就成为来源最丰富的珍贵资源。目前检测FFPE样品中的基因表达需要从FFPE样品中分离出高质量的RNA。但是，由于FFPE样品中RNA已经部分降解了，并且往往与组蛋白紧密交联，因此想要提取其中的核酸信息相当有难度。目前常用的从FFPE样品中提取总RNA的方法耗时长，并且繁杂的纯化步骤造成RNA样品的大量损失，当样品含量有限时，则可能影响下游检测的进行。因此，需要开发一种简单，快速，准确的方法从FFPE样品中检测基因的表达情况。
[0004]发明概沭
[0005]本申请的一个方面特别涉及从福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法，包括:(a)将福尔马林固定石蜡包埋的组织样品用脱蜡液处理以获得脱蜡的组织样品；(b)将所述脱蜡的组织样品裂解以获得组织样品裂解液；和(C)直接检测所述裂解液中的基因表达。
[0006]在某些实施方式中，步骤(C)包括直接检测所述裂解液中的所述基因的mRNA。
[0007]在某些实施方式中，步骤(C)包括:提供由报告探针和捕获探针组成的探针对，其中所述报告探针包含(I)与所述基因的mRNA杂交的第一核酸序列；(2)连接在所述第一核酸序列上的荧光标记条形码；其中所述捕获探针包含(I)与所述基因的mRNA杂交的第二核酸序列；(2)连接在所述第二核酸序列上的生物素；将所述探针对与所述基因的mRNA杂交形成复合物；将所述复合物以延伸的状态固定在具有亲和素的基板上；检测荧光标记条形码的信号计数。
[0008]在某些实施方式中，在步骤(C)中使用nCounter分析系统检测所述裂解液的基因表达。
[0009]在某些实施方式中，所述福尔马林固定石蜡包埋的组织样品为微量组织样品。在某些实施例中，所述福尔马林固定石蜡包埋的组织样品为细针穿刺活检样品。在某些实施例中，所述福尔马林固定石蜡包埋的样品的体积大于0.75X10 W0在某些实施例中，所述福尔马林固定石蜡包埋的样品的体积大于1.5X 10 W0在某些实施例中，所述福尔马林固定石蜡包埋的样品的体积大于3X10 W0在某些实施例中，所述福尔马林固定石蜡包埋的样品的体积大于6X 10 W0在某些实施例中，所述福尔马林固定石蜡包埋的样品的体积大于 12X10 2mm3。
[0010]在某些实施方式中，所述脱蜡液包含二甲苯。
[0011]在某些实施方式中，在步骤(b)中使用蛋白酶k将所述脱蜡的组织样品裂解。
[0012]在某些实施方式中，将所述裂解液在步骤(C)之前用脱氧核酸酶处理。
[0013]在某些实施方式中，所述福尔马林固定石蜡包埋的组织样品是人组织样品。在某些实施方式中，所述人组织样品是来源于病人的病理组织样品。在某些实施方式中，所述病理组织样品是肿瘤组织样品。在某些实施方式中，所述肿瘤组织来源于选自下组的肿瘤:小细胞或非小细胞性肺癌、胃癌、肠癌、食道癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、泌尿道癌、肾癌、膀胱癌、恶性黑素瘤、肝癌、子宫癌、胰腺癌、骨髓瘤癌、子宫内膜癌、头颈癌、小儿肿瘤、肉瘤。
[0014]在某些实施方式中，所述基因为ALK。
_5] 附图的简要i兑明
[0016]图1.从异种移植FFPE组织样品中快速检测基因表达情况。针对同一组织样品的同一基因(ALK)，用裂解液直接检测得到的计数信号约为用纯化的总RNA检测得到的信号的2倍。
[0017]图2.用裂解液检测基因表达情况。在肺癌腺癌临床样品上大量重复裂解液制备实验，并与500ng纯化的总RNA实验结果进行比对，结果显示两者一致性非常高(R2 =
0.946)ο
[0018]图3.用裂解液检测微量组织样品中的基因表达情况。从相同面积、相同样品的FFPE组织中制备裂解液和纯化的总RNA (使用RNeasy FFPE Kit (Qiagen))。当组织样品体积约为6 X 10 W时，使用纯化的总RNA得到的信号接近背景信号的阈值(60)，无法得出准确的测量信息。当组织样品体积小于3 X 10 W,使用纯化的总RNA得到的信号低于背景信号的阈值。而用裂解液可以准确检测体积为1.5X 10 W的FFPE组织样品。
[0019]发明详沭
[0020]本申请公开了一种从福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中快速检测基因表达的方法，包括以下步骤:
[0021](a)将福尔马林固定石蜡包埋的组织样品用脱蜡液处理以获得脱蜡的组织样品；
[0022](b)将所述脱蜡的组织样品裂解以获得组织样品裂解液；和
[0023](c)直接检测所述裂解液中的基因表达。
[0024]在本申请中，检测基因表达是指探测由基因的DNA序列广生的对应的基因广物的量，例如mRNA的量。在某些实施方式中，检测基因表达包括检测基因的DNA序列转录得到的mRNA的量。由于RNA转录后的剪切过程可能有所不同，同一个基因可能对应一种或多种不同的mRNA转录子。在某些实施方式中，检测基因表达是检测基因对应的某一种或几种具有特定序列的mRNA转录子的量。
[0025]在本申请中，“福尔马林固定石蜡包埋”是指用适当的化学试剂固定，脱水并被石蜡侵染的生物样品。在固定过程中，生物样品中的细胞组份迅速凝固和交联，从而得以长期保存。用于固定的化学试剂包括但不限于福尔马林(甲醛)、乙醇、醋酸、升汞、锇酸(四氧化锇)、重铬酸钾及苦味酸或其组合。脱水过程可以包括依次用不同浓度的乙醇(如30%、50%、70%、80%、90%到100% )进行逐级脱水。其他的脱水剂包括但不限于正丁醇、叔丁醇、丙酮。石蜡侵染和包埋的过程为本领域公知。
[0026]在本申请中，用于检测的组织样品可以包括动物组织样品和植物组织样品。在某些实施方式中，组织样品是人组织样品，优选的是来源于病人的病理组织样品。根据某些实施例，组织样品是肿瘤组织样品。根据某些实施例，肿瘤组织来源于选自下组的肿瘤:小细胞或非小细胞性肺癌、胃癌、肠癌、食道癌、结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、脑癌、泌尿道癌、肾癌、膀胱癌、恶性黑素瘤、肝癌、子宫癌、胰腺癌、骨髓瘤癌、子宫内膜癌、头颈癌、小儿肿瘤、肉瘤。
[0027]在本申请中，基因表达的检测是指通过探测由特定DNA序列编码的RNA的数量检测该DNA序列在组织样品中产生有生物活性的产物，包括mRNA和蛋白分子的量。在某些实施方式中，基因表达的检测是指测定特定基因的mRNA片段。
[0028]在本申请中，脱蜡液是指能将福尔马林固定石蜡包埋的组织样品中的石蜡去除同时并不损伤组织样品的化学试剂或溶液。在某些实施方式中，脱蜡液包含二甲苯。在某些实施方式中，脱醋液可以是市场上购买的试剂，例如凯杰公司(Qiagen)的Deparaffinizat1nSolut1n。
[0029]在本申请中，用脱蜡液“处理”FFPE组织样品是指用脱蜡液使FFPE组织样品脱蜡的步骤和过程，包括将脱蜡液和FFPE组织样品混合。根据某些实施方式，“处理”还可以包括将脱蜡液和脱蜡后的组织样品分离。根据某些实施例，用脱蜡液处理FFPE组织样品包括将脱蜡液和FFPE组织样品在试管中混合，离心分离脱蜡液和脱蜡的组织样品，移除脱蜡液，在试管中加入乙醇清洗组织样品以除去残留的脱蜡液，通过离心和蒸发除去乙醇，从而得到脱蜡的组织样品。
[0030]在本申请中，“脱蜡的组织样品”是指福尔马林固定石蜡包埋的组织样品在经过脱蜡液处理后去除了大于60 %、70 %、80 %、90 %到100 %的石蜡后得到的组织样品。
[0031]在本申请中，“裂解”是指组织样品中的细胞膜结构的完整性被破坏，使细胞内部组份，如蛋白、DNA和RNA等游离出来的过程。根据某些实施方式，通过用蛋白酶K处理组织样品使得组织样品裂解。
[0032]“裂解液”是指组织样品被裂解后得到的游离细胞组份的原始混合物。裂解液可以被进一步处理以分离、纯化或扩增其中的某种组分。在某些实施方式中，本申请所述的方法中使用的组织样品裂解液没有经过任何以分离、纯化或扩增其中某种组分为目的而进行的处理，或者没有经过对其中的RNA进行的分离、纯化或扩增的处理。在某些实施方式中，可选地，裂解液用脱氧核酸酶处理以除去裂解液中的DNA。在本申请中，用脱氧核酸酶处理不影响对基因表达的直接检测。
[0033]在本申请中，“直接”是指在检测基因表达时，裂解液中的组份没有经过分离，纯化或扩增。例如，裂解液中的RNA没有被分离、纯化或扩增，例如没有使用二氧化硅柱纯化，也没有用例如PCR等方法将RNA逆转录成cDNA和/或扩增。用现有技术检测石蜡包埋样品中的基因表达，一般都需要从样品中分离纯化RNA，并把纯化的RNA逆转录成cDNA并用PCR扩增。这样的方法手续繁琐，耗时长，而且不够精确。尤其是在样品量较少的情况下，由于分离纯化RNA的过程中不可避免的样品损失，导致现有技术无法准确检测样品中的基因表达。通过直接检测裂解液中的基因表达,本方法可以减少对裂解液的处理步骤从而减少RNA的损失，还可以避免因PCR等扩增方法处理带来的误差，从而在更短的时间里准确测定组织样品的基因表达情况。
[0034]在某些实施方式中，直接检测裂解液中的基因表达可以通过使用数字多基因表达分析(Digital multiplexed gene express1n analysis)的方法进行分析。数字多基因表达分析是指一种利用分子条形码和单分子成像来检测及统计每一个反应体系中特定转录本的数量的方法，其原理可参见Geiss等，Direct multiplexed measurement of geneexpress1n with color-coded probe pairs, Nature B1technology, 26:317-325 ;美国专利申请US20100015607A1。该方法包括提供由报告探针和捕获探针组成的探针对，其中所述报告探针包含(I)与所述基因的mRNA杂交的第一核酸序列；(2)连接在所述第一核酸序列5’端的荧光标记条形码；其中所述捕获探针包含(I)与所述基因的mRNA杂交的第二核酸序列；(2)连接在所述第二核酸序列3’端的生物素；将所述探针对与所述基因的mRNA杂交形成复合物；将所述复合物以延伸的状态固定在具有亲和素的基板上；检测荧光标记条形