专利名称：水稻花粉母细胞特异性表达基因的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及水稻花粉母细胞特异性表达基因。
背景技术：
减数分裂是所有真核生物有性生殖过程中的关键。所有真核生物的减数分裂过程是高度保守的。减数分裂与有丝分裂的不同在于，一轮DNA复制后它经过了两次连续的细胞分裂。减数分裂I时期的染色体行为，如同源染色体排列、联会、重组和交叉释放，是减数分裂所特有的，并且是进行遗传特性分类的基础。在酵母中，对于减数分裂的研究是广泛的，但是在植物中，对于减数分裂一系列事件的遗传控制的研究还是有限的。完全的减数分裂的特异性基因列表对于全面了解植物的减数分裂机制是非常有用的。有性生殖发育中的最关键点是在从有丝分裂细胞周期向减数分裂细胞周期的过渡中，所有的准备在减数分裂开始前完成。对于酵母、小鼠和玉米的研究指出控制减数分裂起始的信号级联通路存在显著的物种多样性，但相比之下，减数分裂的基本过程在进化上是保守的。芽殖酵母中，减数分裂特异转录因子IMEl通过正调节一个蛋白激酶编码基因的表达开始其减数分裂过程。裂殖酵母中，一个RNA结合蛋白Mei2成为了减数分裂起始的开关。在小鼠的生殖细胞中，一个脊椎动物特有基因StraS的特异性诱导对于向减数分裂过渡是必须的。而在玉米中，一个含有卷曲螺旋结构的植物特有蛋白Aml对于减数分裂的起始是必须的。因此研究水稻这种重要经济作物的减数分裂起始的控制有重要的意义。此外，基于基因对基因的研究手段，许多单独的减数分裂相关基因的成功鉴定之后，更加全面的工具的应用，如芯片，以及遗传学的和生物化学的路径的整合，将揭示新的在遗传学上控制减数分裂的基因的相互作用和路径。在植物中，只有花粉母细胞和大孢子母细胞通过减数分裂，由原来的二倍体细胞形成单倍体细胞，而所有其他细胞的分裂是通过有丝分裂实现的。相较于有丝分裂周期的细胞，花粉母细胞的转录组更全面地提供了减数分裂时期的特异基因，同时也提示了与减数分裂起始相关的路径。然而，由于花粉母细胞埋在雄蕊顶部的花药之内，收集均一的花粉母细胞群落在技术上存在困难。例如，有研究描述了处于发育第五阶段的水稻雄蕊富含花粉母细胞(Lu XC,Gong HQ, Huang ML,Bai SL, He YB, Mao X，Geng Ζ, Li SG, Wei L，Yuwen JS,Xu ZH, Bai SN(2006)Molecular analysis of early ricestamen development using organ-specific gene expression profiling. Plant Mol Biol61 :845-851)，他们不得不切取整个处于发育第五阶段的水稻雄蕊进行芯片分析。因此，本领域有必要找到有效的收集均一的花粉母细胞群落的方法，从而更有利于花粉母细胞的深入分析
发明内容
本发明的目的在于提供筛选水稻花粉母细胞特异性表达基因的方法。本发明的另一目的在于提供水稻花粉母细胞特异性表达基因。在本发明的第一方面，提供一种筛选水稻花粉母细胞特异性表达基因的方法，所述方法包括(1)利用激光捕获显微切割从水稻未成熟花序的切片(较佳地为石蜡切片)中分离出花粉母细胞；(2)对花粉母细胞进行表达谱分析，并与处于有丝分裂时期的三核花粉和/或幼苗的表达谱进行比较，找出特异性在花粉母细胞中表达而不在三核花粉和/或幼苗中表达的基因，所述基因即是水稻花粉母细胞特异性表达基因。在一个优选例中，所述的水稻未成熟花序是水稻发育时期第5期的未成熟花序。在另一优选例中，水稻未成熟花序的切片如下制备将水稻未成熟花序进行固定、 石蜡包埋、切片、脱蜡、干燥，得到用于分离水稻母细胞的水稻未成熟花序的切片。较佳地，采用微波辅助的丙酮固定法进行固定。较佳地，所述的切片的厚度为8-10 μ m。较佳地，如下制备将水稻未成熟花序经过微波辅助的丙酮法固定、石蜡渗透与包埋以及切片脱蜡，制成幼嫩花药横切片。在另一优选例中，步骤(1)包括在水稻未成熟花序的切片中将花粉母细胞标记出来，用紫外激光束将花粉母细胞与周围细胞分开，收集花粉母细胞。在另一优选例中，包括将水稻未成熟花序的切片置于激光捕获显微切割仪器中，从放大的显微图中辨别出处于花药室中的花粉母细胞/小孢子，并将部分切片分别通过染色确定花粉母细胞位置用作参照；根据参照将同批未经染色的幼嫩花药横切片在激光捕获显微切割仪显示屏上花粉母细胞标记出来，经过焦距和能量的精细调整后，用紫外激光束将花粉母细胞与周围细胞分开，再用近红外激光束收集花粉母细胞( 500个)。在另一优选例中，所述的染色如DAPI (4',6' - 二脒基_2_苯基吲哚，4’， 6，-diamidino-2-phenylindole)染色或苯氨蓝染色。在另一优选例中，步骤O)包括(a)对花粉母细胞进行RNA抽提，获得总RNA ；线性扩增总RNA，得到氨基-烯丙基 cRNA (互补 RNA)；(b)以荧光染料Cy3_，Cy5_偶联花粉母细胞的氨基-烯丙基cRNA，用于与水稻基因组芯片杂交，分析表达谱；将该表达谱与三核花粉和/或幼苗经相同处理得到的表达谱比较，建立基于杂交信号绝对值的芯片数据分析方法，结合生物统计学找出可重复性地在花粉母细胞中显著表达而不在三核花粉和/或幼苗中表达的基因，所述基因即是水稻花粉母细胞特异性表达基因。在另一优选例中，步骤(a)中，进行两轮线性扩增，从而实现放大倍数达100万倍以上；较佳地采用Epicentre TargetAmp-2-round试剂盒。在另一优选例中，步骤(a)还包括用Agilent 2100生物分析仪评估cRNA质量， 选择那些具有“钟形”曲线且峰值在200nts(较佳地300nts)以上的样品用于进一步的探针标记。
在另一优选例中，分析表达谱时，安排至少两个生物学重复。在本发明的另一方面，提供一种所述的方法筛选获得的水稻花粉母细胞特异性表达基因。在一个优选例中，所述基因是减数分裂特异基因。在本发明的另一方面，提供一种启动子，其指导基因在水稻花粉母细胞中特异性表达。在本发明的另一方面，提供一种收集花粉母细胞群落的方法，所述方法包括利用激光捕获显微切割从水稻未成熟花序的切片中分离出花粉母细胞。在一个优选例中，所述方法包括在水稻未成熟花序的切片中将花粉母细胞标记出来，用紫外激光束将花粉母细胞与周围细胞分开，收集花粉母细胞。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1A-F、DAPI染色粳稻品种日本晴不同发育阶段的花药、小孢子/花粉。其中， A-B显示从水稻发育时期第5期阶段的约2mm花序采集的花药的横截面的染色情况；C-D显示在减数分裂期从3-4mm花序采集的花药释放的小孢子的染色情况；E显示四分体期从约 5mm花序采集的花药释放的小孢子的染色情况；F显示从约6mm花序获得的三核花粉(TCP) 的染色情况。图1G-I、采用激光捕获显微切割系统分离的水稻发育时期第5期阶段的花药的横截面的花粉母细胞。图2、约2mm长的幼嫩花药的横截面的苯胺蓝染色。2mm长的未成熟花序中的花药切片用苯胺蓝染色以观察胼胝质，大多数花药处于减数分裂前阶段，PMC(花粉母细胞)中没有观察到胼胝质。其中，A、一些花药处于早期减数分裂阶段，胼胝质堆积在PMC周围。B、胼胝质堆积处显示亮黄荧光(箭头所示)。标尺表示50 μ m。图 3、用 Agilent Bioanalyzer 2100 检测 RNA 质量(即 RNA 完整度)。A、激光显微切割获得的水稻花粉母细胞抽提得到的总RNA样品。BioanalyzerflOO 检测结果显示185与^S核糖体RNA比例接近1 2，说明激光显微切割获得的水稻花粉母细胞抽提得到的总RNA保持完整，质量是好的。B、以激光显微切割获得的水稻花粉母细胞抽提得到的总RNA为模板，经两轮线性扩增得到的aRNA。BioanalyzerflOO检测结果显示谱线呈“钟”形且峰值大于200Nts，说明扩增质量良好。图4、对通过芯片筛选获得的部分基因进行实时PCR结果验证的结果比较。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，找到了一种收集均一的花粉母细胞群落的优选方法， 采用该方法可良好地分离出均一的花粉母细胞，获得的细胞可用于筛选水稻花粉母细胞特异性表达基因以及特异性表达启动子。如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。组织或器官特异型启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中。如本文所用，所述的“可操作(性)地连接”或“操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。如本文所用，所述的“目的基因”是指可由本发明的启动子指导表达的基因。“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如， 如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在特定的时间和/或特定的组织表达。“组织特异性”又称“器官特异性”，在一些调控元件的调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出其相关的发育调节的特性。本发明中，所述的“组织特异性表达”是指在植物花粉母细胞中特异表达。通常，如果在特定组织或器官中mRNA以比在其它组织或器官中高至少5倍，优选至少高10倍，更优选至少高100倍，最优选至少高1000 倍水平被表达，则认为相关基因的表达是组织或器官特异性的。如本文所用，所述的“植物”是禾本科植物，如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等。较佳地，所述的“植物”是水稻。激光显微切割以往本领域人员在分析花粉母细胞时，由于细胞分离困难，通常取整个处于发育第五阶段的水稻雄蕊进行分析。然而，这种方法获得的是多种细胞混合的组织，当用于细胞基因特异性表达分析时，无法获得准确的结果。基于以上现有技术的困难，本发明人经过了深入研究，尝试了多种细胞分离手段，最后找到了一种合适的收集均一的花粉母细胞群落的方法。即采用激光显微切割方法，该方法可获得高纯度的水稻花粉母细胞。可利用所述花粉母细胞进行特异性表达分析。因此，本发明提供了一种收集花粉母细胞群落的方法，所述方法包括利用激光捕获显微切割从包含花粉母细胞的水稻组织(优选水稻未成熟花序，或水稻未成熟花序中的花药)中分离出花粉母细胞。更特别地，所述方法包括在包含花粉母细胞的水稻组织中将花粉母细胞标记出来，用紫外激光束将花粉母细胞与周围细胞分开，收集花粉母细胞。较佳地，在收集时，将近红外激光束定位于刚好在花粉母细胞上的收集盖的热塑高分子膜的特定区域，使膜与花粉母细胞融合，从而花粉母细胞被收集盖收集。较佳的，在激光捕获显微切割之前，对包含花粉母细胞的水稻组织进行预处理，包括对包含花粉母细胞的水稻组织进行微波辅助的丙酮法固定，石蜡包埋，切片(较佳地切成8-10 μ m厚度切片)，对切片进行脱蜡和干燥。
筛选特异性表达基因的方法目前，水稻等作物的全基因组顺序已经公布，全基因组芯片为全基因组规模的基因表达研究提供了可能；但以往的研究受限于取用样品多为多种细胞混合的组织、器官，而植物各种生命活动的基本单元是细胞，不同类型的细胞甚至同类细胞处于不同环境下，其基因表达可以存在很大差异，取用混合样品的基因芯片结果只能反映多种细胞基因表达的平均值或优势细胞类型中的基因表达情况，一般不能筛选细胞类型特异性表达的基因，激光显微切割可以从混和的细胞群中挑选出特定类型的细胞供DNA、RNA分析，解决取样的精准度问题。具体而言，以往的研究取材是整个花序或整个花药，在此基础上得到的基因芯片结果反映的是花序或花药中多种不同组织、细胞表达的平均值，无法区分基因是在花粉母细胞中表达，还是在花粉周围的花药壁、维管束或花丝中表达的，得不到花粉母细胞特异性表达谱。而本发明采用激光显微切割技术，在显微镜下专一选取花粉母细胞，用激光切下取得，不含有其他类型的细胞或组织，所以能够得到花粉母细胞特异性的表达谱。因此，本发明提供了一种筛选水稻花粉母细胞特异性表达基因的方法，所述方法包括(1)利用激光捕获显微切割从包含花粉母细胞的水稻幼嫩花药组织中分离出花粉母细胞；(2)对花粉母细胞进行表达谱分析，并与处于有丝分裂时期的三核花粉和/或幼苗的表达谱进行比较，找出特异性在花粉母细胞中表达而不在三核花粉和/或幼苗中表达的基因，所述基因即是水稻花粉母细胞特异性表达基因。较佳地，所述的包含花粉母细胞的水稻组织是水稻的花序。更佳地，所述的水稻的花序是水稻发育时期第5期的未成熟花序。处于这一时期的植株具有以下特点1)水稻植株生长大约两个月，未开花；2)最后两片叶环的距离小于2cm ；3)未成熟花序长度大约3cm 左右；4)小花长度约为2mm(1.5mm至2. 5mm之间)。可通过做切片进行显微观察以进一步确定水稻花药的发育时期。水稻花药发育时期按Lu XC, Gong HQ, Huang ML, Bai SL, He YB, Mao X,Geng Ζ,LiSG,Wei L,Yuwen JS,Xu ZH,Bai SN(2006)Molecular analysis of early ricestamen development using organ-specific gene expression profiling. Plant Mol Biol61 :845-851中所划分，本领域熟练人员可以通过观察判定大致时期。对花粉母细胞进行表达谱分析的方法较佳地如下(a)将收集到的花粉母细胞转移到微量离心管中，进行微量RNA抽提(例如picopure试剂盒)，获得总RNA(pg级)； 用微量凝胶毛细管电泳(如Agilent Bioanalyer 2100和RNAPico-chip)的方法监测总 RNA完整度(如图3A)。完整度符合要求的总RNA作为模板，经过基于T7RNA聚合酶的两轮线性扩增(例如用EpicentreTargetAmp-2-round试剂盒，参考文献Van Gelder，R. N.， yon Zastrow, Μ. Ε. , Yool, Α. , Dement, W. C. , Barchas, J. D. , and Eberwine, J. H. (1990). Amplified RNAsynthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87，1663-1667)，得到 amino-allyl (氨基-烯丙基)cRNA (互补 RNA) 20 微克每样品，再经微量凝胶毛细管电泳检测cRNA扩增质量(如图;3B)，质量良好的用于下步；(b)标记花粉母细胞的氨基-烯丙基(amino-allyl) cRNA，用于与水稻基因组芯片杂交，，并安排至少两个生物学重复；将该表达谱与三核花粉和/或幼苗经相同处理得到的表达谱比较，建立基于杂交信号绝对值的芯片数据分析方法，结合生物统计学找出可重复性地在花粉母细胞中显著表达而不在三核花粉或幼苗中表达的基因，所述基因即是水稻花粉母细胞特异性表达基因。
花粉母细胞特异性表达基因本发明还提供了采用所述的筛选特异性表达基因的方法获得的水稻花粉母细胞特异性表达基因。花粉母细胞代表了在植物雄性有性生殖中雄性减数分裂前的最后阶段，所以阐明其转录组对完全了解这一关键过程是重要的。尽管减数分裂过程中和之后的发育阶段转录组已经有报道，但是对于减数分裂前转录组的报道并没有。本发明采用激光显微切割技术获得高纯度的水稻花粉母细胞，并在水稻全基因组芯片上筛选到151个在水稻花粉母细胞中表达，而在幼苗、花粉等其他组织不表达的基因， 该筛选涵盖了几乎所有水稻基因，29010个中只筛到151个，几率为0.051%。该151个基因是潜在的减数分裂特异基因。本发明人在基因分析的同时，还用实时PCR对部分基因表达进行了验证，两者结果相符。可见，本发明准确地获得了水稻花粉母细胞特异性表达基因。启动子基于以上筛选获得的基因，可获得花粉母细胞特异性表达启动子，所述的启动子可以目的基因(可以是外源基因)操作性相连，从而驱动目的基因(可以是外源基因)在花粉母细胞中特异性表达。花粉母细胞特异性表达基因的启动子比一般花粉特异性表达基因的启动子优越的地方在于一般花粉特异性表达基因的启动子在杂合子状态下只在50%花粉中表达；而花粉母细胞特异性表达基因的启动子在杂合子状态下也在100%花粉中表达。目前已报道的水稻花粉母细胞特异性启动子仅有OsMELl (Plant Cell2007,19 2583-2594)。基于本发明在水稻花粉母细胞分离技术上的改进，本发明可以得到比OsMELl 启动子更特异的水稻花粉母细胞。以下证据证明了这一点(1)基于激光显微切割所得样品的基因芯片结果显示，OsMELl在三核花粉、幼苗等其他阶段表达也有中-轻度表达，而本发明所得到的水稻花粉母细胞特异性表达基因在三核花粉、幼苗等其它阶段无表达。(2)以OsMEL启动子驱动⑶S报告基因的转基因水稻，经⑶S染色显示在幼苗等有可见表达。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。I.材料与方法植物材料及组织收集7jCfS (Oryza stativa L. ssp. Japonica cv· Nipponbare ；曰本日青)植株在温室中培养，生长条件为^±1°C，1 光照/Ilh黑暗。
本发明人取发育时期第5期的未成熟花序获得花粉母细胞。此时期的雄蕊切片开始显示蝴蝶的形状，可见包括一层表皮细胞及来源于壁细胞的三层细胞(内层，中层和绒毡层)在内的四层细胞从外而内包裹着花粉母细胞。花粉母细胞的DAPI染色显示细胞核没有可见的染色体(图1A-B)，而在稍后的时期中(花序长度2. 5-3. 5mm)，细胞进入减数分裂，染色体可见(图1C-D)。花粉母细胞的细胞壁上几乎没有胼胝质，而性母细胞在细胞壁上积累胼胝质。本发明人用苯胺蓝(0.1%) 对雄蕊切片进行染色，发现大部分发育中的小孢子没有明显可见的胼胝质，只有小部分细胞显示在性母细胞之间会有胼胝质出现，基于以上观察可知本发明人所选取的细胞处于减数分裂前期到早期的阶段。为了分离三核花粉，本发明人从正开花的花序中收集花药，在40%蔗糖溶液中孵育并振荡以释放花粉，40C，300g离心沉淀花粉。水稻种子浸泡在水中J6士 l°C，14h光照/IOh黑暗中培养1周，取整株苗为材料。激光显微切割样品的准备利用微波渗透丙酮固定、石蜡包埋的方法处理包含花粉母细胞的未成熟花序以进行激光捕获显微切割(Tang WH, Coughlan S, Crane Ε, Beatty Μ, Duvick J (2006) The application of laser microdissection to in planta gene expressionprofi1ing of the maize anthracnose stalk rot fungus Colletotrichum graminicola. Mol Plant Microbe Interact 19:1240—1250)。 >t 丰几(Leica Microtome, Germany) ^htEW ^ 8-10 μ m厚度切片。利用石蜡胶带转移装置(Instrumedics, Hackensack, NJ, USA)展片。 切片在纯二甲苯中脱蜡两次，每次5分钟，并在通风橱中吹干，即可用于激光显微切割。激光捕获显微切割用Veritas显微切割系统(Arcturus/Molecular Devices)分离获得均质的花粉母细胞。在选定时期的水稻花序切片中将花粉母细胞挑出。在监视屏上将靶细胞标记出来。首先用一束很细的紫外-激光束将靶细胞与周围细胞分开，然后，将红外激光束定位于刚好在花粉母细胞上的收集盖的热塑高分子膜的特定区域，使膜与靶细胞融合。为此，靶细胞被收集盖收集，并转入RNA抽提液中。两个花粉母细胞的生物学重复，每个约有1000个细胞被收集下来用于RNA抽提。RNA抽提及扩增用Picopure RNA 提取试剂盒(Arcturus/Molecular Devices)抽提 LCM 切割得到的花粉母细胞及收集的三核花粉的总RNA。由于极其微量，且前面步骤繁多，为保证顺利实施，需要用微量凝胶毛细管电泳进行质量监测，完整度符合要求的总RNA作为模板；因此， 用RNA-6000Pico芯片(Agilent Technologies)在安捷伦2100生物分析仪上检测总RNA 的完整性(图3A)。只有那些核糖体RNA 28S :18S > 1的RNA样品被用来进行进一步的扩增。幼苗的总 RNA 用 TrizolReagent (Chomczynski and Sacchi, 1987)直接抽提。所有总RNA 样品都用 iTargetAmp aminoallyl-aRNA 二轮扩增试剂盒(Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, U. S. A.)及 Superscript III 禾口 SuperScriptII 反转录酶 (Invitrogen，Carlsbad, CA, U. S. Α.)进行两轮线性扩增。对于每个样品，用约Ing总RNA 起始(在一个2- μ 1体系中)，大约可得到8 μ g amino-allylcRNA。扩增后的RNA质量用 Agilent 2100生物分析仪进行评估，只有那些具有“钟形”曲线且峰值在300nts以上的样品用于进一步的探针标记。amino-allyl cRNA的标记及基因芯片的杂交根据Ambion的染料偶合实验方法(Amino-Allyl MessageAmp II试剂盒， Ambion), amino-allyl cRNA在黑暗条件下与Cy3或Cy5单-反应NHS酯反应30分钟。用 4M盐酸羟胺终止反应。用RNeasy柱(Qiagen, Valencia, CA, U. S. Α.)将标记的RNA从未偶合的染料分子中分离出来。用水将样品洗脱下来，并用分光光度计确定样品浓度及染料的强度。将Cy3和 Cy5标记cRNA混合，在旋转杂交炉中65°C条件下杂交17小时(60-mer01igo Microarray Processing Protocol ν 4. 1，Agilent Technologies)。芯片在室温条件下洗涤并用安捷伦芯片扫描仪扫描，扫描分辨率为5 μ m, PMT 100 %，10 %。芯片和实验设计7jc M 4x44K S 片(chip code 251524111447) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)有45，152个点，包含1283个负对照和43，734个根据Rice AnnotationProject (RAP)的核酸序列及全长cDNA序列合成的寡核苷酸。Shimono等U007) 和Suwabe等Q008)用过同样的芯片。总共43734个60mer的探针代表了 29，008个不同的水稻基因，包含28，840个推测的蛋白编码基因及168个miRNA编码基因。在28，840个基因中，22，532个基因有单一的探针，4619个基因有2个序列探针，1235个基因有3个探针，330个基因有4个探针，92个基因有5个探针，16个基因有6个探针，11个基因有7个探针，3个基因有8个探针，2个基因有9个探针。四张双标芯片做了杂交。每种样品有两个独立的生物学重复，花粉母细胞和三核花粉用Cy3标记。幼苗表达了水稻基因组的大部分基因，用Cy5进行标记，并在所有杂交中作为参照。公共参照一次制样，在所有实验中均勻取样。芯片特征抽出及前处理通过TIFF图像的观察以确保每组饱和点的数量在2到10之间，并使用Agilent’ s Feature Extraction (Feature Extraction software 9. 5. 3)以^ % 的SSSi (Protocol for use with Agilent Gene Expression oligo microarraysVersion 5. 7, March 2008)对探针特征进行提取。芯片数据的质量通过以下几点来保证1)生物学重复必须有r > = 0. 9的相关性；2)具有芯片数据过滤器。当它们的中值强度低于背景强度或者重复探针具有较大差异时，不规则的点必须进一步移除。例如中值强度在重复探针中的差异大于3倍方差。数据归一化和统计分析在没有扣除背景的情况下考虑数据的归一化。本发明人没有扣除背景强度的原因有两点1)当背景被扣除后，低强度探针有高的信噪比；2)当背景噪声被扣除后，重复间的相关系数降低。虽然loess归一化在很多的双标芯片中应用的很好，但是本发明人认为它不适用于本发明人的研究。Loess归一化需要假设大多数基因超出强度范围内表达或超出强度范围上调和下调表达的基因数量是相同的。因为只有少量基因在PMC、TCP和幼苗中具有相似的表达水平，而大部分基因是有表达差异的。因此在本发明人的研究中使用了另外一种归
一化方法。
为满足对组织中基因差异表达进行描述，本发明人应用了两步芯片间刻度归一化。第一步，根据负对照探针进行基线转换；第二步，基于组织中稳定表达的看家基因进行刻度归一化。PMC、TCP和幼苗具有相似的基线。常规的看家基因例如肌动蛋白、微管蛋白或者组蛋白很可能有差异。但是101个在氧化磷酸化路径中编码酶的基因的总强度类似。为了评估阳性表达的基因，本发明人定义了负对照95%的强度作为基因表达的阈值。这一阈值是根据平衡假阳性和遗漏真实表达的基因的数量来确定的。对至少存在一个表达强度超过阈值的基因重复用Mudent’ s T-test进行检测，ρ < 0. 001被认为是显著表达的。在显著表达基因中，前25%被认为是高表达的，中间50% 被认为是中度表达的，后25%被认为是低表达的。GeneSpring GX9. 0 (Agilent)用于分析芯片数据。微软excel 2003和R软件用于统计检验。在线基因组分析工具KEGG Pattway数据库用于路径的富集分析。本发明人的数据将存放于GEO数据库。定量RT-PCR验证芯片数据本发明人依据Tang等Q006)的方法运用反转录RNA结合STOR绿检测在iCycler 仪(Bio-Rad)上进行定量实时PCR反应。II.实施例实施例1、水稻花粉母细胞的激光显微切割粳稻品种日本晴未成熟花序中的雄蕊富含刚好进入减数分裂时期前的花粉母细胞(也称小孢子母细胞)(图1A，B)。对花药进行染色体染色，胼胝质染色和周边细胞层染色帮助判定这一特定发育时期(图1C-E，图2)。通过对材料准备方法的优化，本发明人运用激光捕获显微切割从这些花序的横切面上分离了均一的花粉母细胞群落(图1G-I)。从两个独立的花粉母细胞样本中抽提出高质量的总RNA (约800个细胞/样本) (图 3A)。mRNA经线性扩增用于水稻基因组芯片杂交(图;3B)。实施例2、水稻花粉母细胞的芯片分析本发明人使用Agilent公司的44k水稻基因组芯片，以三核花粉和一周幼苗作为对照，检测花粉母细胞的基因表达谱。芯片上的探针(每个探针具有60bp长度)可检测 29008个不同的水稻基因，其中包括观840个已知的蛋白质编码基因和168个miRNA编码基因。而目前，NCBI库中有四343个粳稻品种的基因记录。因此本发明人使用的芯片涵盖了目前已注释基因的95%。在考虑了特定细胞类型的转录组分析结果基础上进行芯片数据的处理。花粉母细胞的转录组数据和三核花粉的一起进行分析以便每一个探针表达值在统计学上确保数据质量的可靠。总的来说，生物学重复之间的相关系数高于0. 9。芯片数据的验证本发明人运用定量RT-PCR以0s03g0268000，一个在花粉母细胞，三核花粉和幼苗中都高表达的磷酸酯酶编码基因为对照，检测了 13个基因的表达情况。检测中，有两个基因(0s06g04^900和0s04g0208600)属于151个花粉母细胞特异表达基因之列，实时PCR 结果验证了芯片数据是正确的(图4)。
本发明人还用原位杂交的方法检测了两个基因(MSP1和SPL-like)，其结果证实了芯片数据。实施例3、在花粉母细胞中明显表达的基因的数量有多少基因在花粉母细胞中确实进行了表达？从两个花粉母细胞生物学重复的所有基因的杂交信号的密度分布图，以及负对照探针的信号分布来看，本发明人判定至少59%的基因(17196Λ9008)在花粉母细胞中表达。其百分率高于三核华粉的41 % (11867Λ9008)，但低于幼苗的 72% (20783/29008)。另外，同时在花粉母细胞和幼苗中表达的基因数量(15902/17196,92. 5% )多于同时在三核花粉中表达的基因数量(10201/17196，59%)。结合减数分裂小孢子，四分体期，单核期花粉，二核期花粉，三核花粉和处于减数分裂时期的绒毡层细胞的转录组数据， 其中四分体期，单核期花粉的结果来自Hobo等的工作Q008) ；2008年，Suwabe等的主成分分析结果显示花粉母细胞的转录组更接近幼苗的，而不同于减数分裂后的花粉/小孢子 (图幻。分级的聚类系统图显示幼苗和减数分裂前的花粉母细胞，雄性性细胞和减数分裂进行期的细胞，四分体期的细胞聚集在一起，而稍后的单核期，二核期和三核花粉在一起。 这些结果进一步提示减数分裂完成后的细胞转录组存在显著的变化。花粉母细胞中一些已知的减数分裂相关基因的表达方式与预期相符，说明芯片结果可靠。Agilent公司的60mer芯片在五个数量级的范围内解析了基因表达的差异(信号分布范围47到661955，图4A中取对数值后5. 57到19. 34)，并且显示了 mRNA浓度(也可代表表达水平)与信号强度线性相关，由此形成多于五个的数量级直到强度值接近饱和 (LeProust,2008)o 25%表达基因的对数值低于11，另外25%高于15。因此本发明人将对数值9到11，11到15和15以上分为表达水平低，中和高。从一些已知的水稻减数分裂相关基因和与已知的其它物种减数分裂相关基因同源的水稻基因在芯片结果中表达数据，本发明人看到这些基因中的大多数在花粉母细胞中表达，这和它们在减数分裂中预期作用一致。比如，基因PA^l，据报道作用于同源染色体的排列，其在花粉母细胞中的表达显著升高，而在三核花粉或幼苗中没有明显表达。 Ameiotic 1的水稻同源基因(0s03g0650400)在花粉母细胞中的表达明显高于在其它样品中，这可能释放了将蛋白表达水平归结为mRNA表达的一些担忧。据报道，玉米的ami基因在很多组织中高表达，但它只在减数分裂起始和进行中具有功能(Pawlowski WP, Wang CR, Golubovskaya IN, Szymaniak JM, Shid L, Hamant 0, Zhu Τ, Harper L, Sheridan WF, Cande WZ(2009)Maize AMEI0TIC1 is essential for multiple earlymeiotic processes and likely required for the initiation of meiosis. Proc Natl AcadSci USA 106(9) 3603-3608)。对于属于多基因家族的基因来说，根据芯片数据可以找出某个成员更可能作用于减数分裂。比如，RAD21家族的四个基因中，只有0sRAD21-4在花粉母细胞中表达值明显高于三核花粉和幼苗，而0sRAD21-3在三核花粉中高于其它两组样品；这和报道的 0sRad21-4，酵母Rec8的一个同源蛋白，对减数分裂是必须的结论是一致的(Siang LR, Tao JY, Wang SX, Chong K, Wang T (2006) The Rice 0sRad21_4, an orthologue of yeast Rec8 protein, is required for efficientmeiosis. Plant Mol Biol 60 :533-554),而0sRAD21-3，酵母RAD21的一个同源蛋白，对花粉发育是必须的(Tao JY, Zhang LR, Chong K, Wang T(2007)0sRAD21_3, an orthologue of yeast RAD21, is required for pollen development inOryza sativa. Plant J 51:919-930)。细胞周期蛋白可能在减数分裂进 'if^WM^Mi^^ (Hamant 0， Ma H, Cande WZ (2006) Genetics of meiotic prophase I inplants. Annu Rev Plant Biol 57:267-302)。芯片可检测44个细胞周期相关的同源基因，本发明人的数据显示了其中3个(0sllg0157100, 0s02g0438200和0s03g0203800), 另外还有已报道的可能作用于雄性减数分裂的OsSDS。S期激酶相关蛋白I(SKPl)是泛素介导蛋白水解路径中SCF复合体的一个连接蛋白。拟南芥的SKPl-Iikel (ASKl)作用于交叉的解除和姐妹染色体的粘连(Yang Μ, Hu Y, Lodhi Μ, McCombie WR, Ma H (1999) The Arabidopsis SKP1—LIKE1 geneis essential for male meiosis and may control homologue separation. Proc NatlAcad Sci USA 96:11416—11421)。 ￠1 禾g 中 #￠17 个拟南芥SKPl-Iike基因的同源基因。本发明人的结果显示其中两个(0s07g0409500， 0s07g0624900)很可能作用于雄性减数分裂。对于一些在序列上有限相似的基因，表达谱数据提供了功能相似的一些信息。拟南芥的AGAM0US，一个MADS-box转录因子，诱导另一个对花粉原基L2细胞中孢子细胞专一性必须的 MADS-Iike 转录因子 SP0R0CYTELESS/N0ZZLE(Schiefthaler et al.，1999 ；Yang et al.，1999 ；Ito etal. ,2004) 水稻的 SP0R0CYTELESS(SPL)同源蛋白还没有鉴定出。但本发明人的芯片数据和原位杂交结果显示与拟南芥SPL弱相似的0s01g0212500可能和SPL 一样作用于减数分裂。至今报道了沈个在早期雄蕊发育中优先上调表达的基因，因此暗示它们参与了水稻雄蕊发育的调控(Lu XC, Gong HQ, Huang ML, Bai SL, He YB，MaoX，Geng Ζ, Li SG, Wei L,Yuwen JS,Xu ZH,Bai SN(2006)Molecular analysis ofearly rice stamen development using organ-specific gene expression profiling. PlantMol Biol 61。芯片数据显示所有这沈个基因在花粉母细胞中都表达，并且多数在花粉母细胞中表达值高于随后的三核花粉时期。这和以前的报道相一致。实施例4、151个基因在花粉母细胞中表达，而在三核花粉或幼苗中不表达本发明人得到了三组芯片数据，其中两组是两种不同的细胞，一组是混合的组织。 这三种样品代表了显花植物生长周期中的重要阶段孢子体时期(双倍体，幼苗)，配子体时期(单倍体，三核花粉)和过渡时期(花粉母细胞，双倍体细胞即将减数分裂期而产生单倍体)。由于对DNA模板的争夺，减数分裂期间，转录不可能发生，而DNA只进行复制，配对和联会，因此在花粉母细胞中，可能已经转录并积累了减数分裂过程所必须的mRNA。幼苗中的许多细胞只进行有丝分裂。由于三核花粉比两个精细胞大，它的转录组主要反映营养细胞的基因表达情况。因此三核花粉代表了有丝分裂的期。花粉母细胞与幼苗和三核花粉的比较可看作减数分裂与有丝分裂的比较。在花粉母细胞中表达，而在幼苗或三核细胞中不表达的基因可能是减数分裂相关基因。经检测，151个基因在花粉母细胞中表达，而在另两种样品中不表达。运用类似 KEGG路径的方法对它们进行了归类。其中，具有F-box的蛋白明显富集(21个)。21个类F-box蛋白中的11个属于水稻 F-box 蛋白超级家族(Xu G, Ma H, Nei M, Kong H(2009) Evolution ofF-box genesin plants !different modes of sequence divergence and theirrelationships with functional diversification. Proc Natl Acad Sci USA 106(3) :835-840)，其中 4个除了含有N端保守F-box外还含有FBD结构域。考虑到776个水稻F_box蛋白中只有31个含有另外的FBD结构域(不含LRR)，那么F-box蛋白的FBD亚家族在花粉母细胞中是富集的。 另一种F-box蛋白包含一个DUF295结构域，有两个含DUF295结构域的蛋白在花粉母细胞中表达，而在三核花粉或幼苗中不表达。F-box蛋白是SkpI-RbxI-Cu 11-F-box蛋白(SCF) 泛素连接酶的底物识别组分。其余的3个基因包括0sl0g0141400 (可能编码一个RPWO蛋白，26S蛋白水解酶复合体中非ATP酶调节亚基，据推测是负责多聚泛素链结合的复合体的一个组分)，0s07g0624900 (可能编码一个S期激酶相关蛋白1 (SKPl)，可能是多亚基环指类 E3复合体中的连接蛋白)和0s05g0352700(—个含有环型域的蛋白，最接近拟南芥MEE12 的水稻同源蛋白)，它们也参与了泛素介导的蛋白质水解。Ds插入导致MEE12突变引起自交中遗传比例的混乱(1. 01)，这M个SCF复合体基因的表达特异性的程度显示了控制雄性减数分裂的机制可能是通过应用特异的组分包括一个环指蛋白，一个SKP和20个以上的 F-box蛋白进行泛素介导的蛋白质水解来改变大量的关键调控因子。在151个基因列中包括8个含有Pentatricop印tide r印eat (PPR)结构域的蛋白编码基因。这8个基因占到151个花粉母细胞特异性表达基因的5.3%。而含有 Pentatricop印tide repeat (PPR)结构域的蛋白总数在水稻蛋白总数中只占0. 88%。因此这类蛋白在花粉母细胞特异性表达基因体也是富集的。这151个花粉母细胞特异性表达基因的具体分类和基因数见表1。表1
类型基因数1.代谢酶类脂酶类5蛋白酶类4查尔酮及二苯乙烯合酶类2细胞色素P4502分泌型过氧化物酶1纤维素合成酶51其他酶类82.遗传信息加工类泛素介导的蛋白降解复合物成员F-box蛋白2权利要求
1.一种筛选水稻花粉母细胞特异性表达基因的方法，其特征在于，所述方法包括(1)利用激光捕获显微切割从水稻未成熟花序的切片中分离出花粉母细胞；(2)对花粉母细胞进行表达谱分析，并与处于有丝分裂时期的三核花粉和/或幼苗的表达谱进行比较，找出特异性在花粉母细胞中表达而不在三核花粉和/或幼苗中表达的基因，所述基因即是水稻花粉母细胞特异性表达基因。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水稻未成熟花序是水稻发育时期第5 期的未成熟花序。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，水稻未成熟花序的切片如下制备将水稻未成熟花序进行固定、石蜡包埋、切片、脱蜡、干燥，得到用于分离水稻母细胞的水稻未成熟花序的切片。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括在水稻未成熟花序的切片中将花粉母细胞标记出来，用紫外激光束将花粉母细胞与周围细胞分开，收集花粉母细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，包括将水稻未成熟花序的切片置于激光捕获显微切割仪器中，从放大的显微图中辨别出处于花药室中的花粉母细胞/小孢子，并将部分切片分别通过染色确定花粉母细胞位置用作参照；根据参照将同批未经染色的幼嫩花药横切片在激光捕获显微切割仪显示屏上花粉母细胞标记出来，经过焦距和能量的精细调整后，用紫外激光束将花粉母细胞与周围细胞分开，再用近红外激光束收集花粉母细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括(a)对花粉母细胞进行RNA抽提，获得总RNA；线性扩增总RNA，得到氨基-烯丙基 cRNA ；(b)以荧光染料Cy3-，Cy5-偶联花粉母细胞的氨基-烯丙基cRNA，用于与水稻基因组芯片杂交，分析表达谱；将该表达谱与三核花粉和/或幼苗经相同处理得到的表达谱比较， 建立基于杂交信号绝对值的芯片数据分析方法，结合生物统计学找出可重复性地在花粉母细胞中显著表达而不在三核花粉和/或幼苗中表达的基因，所述基因即是水稻花粉母细胞特异性表达基因。
7.—种权利要求1所述的方法筛选获得的水稻花粉母细胞特异性表达基因。
8.一种启动子，其指导基因在水稻花粉母细胞中特异性表达。
9.一种收集花粉母细胞群落的方法，其特征在于，所述方法包括利用激光捕获显微切割从水稻未成熟花序的切片中分离出花粉母细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括在水稻未成熟花序的切片中将花粉母细胞标记出来，用紫外激光束将花粉母细胞与周围细胞分开，收集花粉母细胞。
全文摘要
本发明涉及水稻花粉母细胞特异性表达基因。本发明找到了一种收集均一的花粉母细胞群落的优选方法，采用该方法可良好地分离出均一的花粉母细胞，获得的细胞可用于筛选水稻花粉母细胞特异性表达基因以及特异性表达启动子。
文档编号C12N15/29GK102242113SQ20101017487
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者唐威华, 张栋, 汤湘, 赵仕兰 申请人:中国科学院上海生命科学研究院