专利名称：与花粉发育相关的非编码RNA的cDNA以及制备雄性不育植物的方法
技术领域：
本发明涉及植物分子育种领域，即利用基因工程手段创造雄性不育的育种技术，具体地说，涉及一种来自于玉米花粉cDNA文库的新的非编码RNA的cDNA，它与花粉发育相关。本发明还涉及利用所述cDNA制备雄性不育植物的方法，尤其是制备了显示典型的花粉败育的转基因玉米和烟草。
背景技术：
杂种优势作为一种提高作物产量，改善作物品质，提高作物抗虫、抗病、抗逆的手段已被广泛的应用，并取得令人瞩目的成就，以植物雄性不育为基础的杂种优势利用已成为许多作物的育种目标，在农业生产上发挥巨大的作用。但自然出现的雄性不育类型很少存在着周期长，不育基因来源单一等问题，而且恢复系的培育和后代的筛选上也存在着一定的不足。而利用基因工程创造雄性不育的策略为杂种优势的利用克服了上述缺陷，目前采用的方法有以下几个方面1.利用花粉或花药特异表达启动子，驱动核糖核酸酶基因在花粉中特异表达，获得雄性不育植株Mariani等(1990)利用烟草花药绒毡层特异启动子TA29将核糖核酸基因导入烟草，结果核糖核酸酶特异表达能够选择性地破坏与花粉发育相关的一些器官或组织，阻断花粉发育进程，导致植物雄性不育。Paul等(1992)利用拟南芥花药绒毡层特异性启动子A9特异表达核糖核酸酶基因同样获得了雄性不育烟草植株。
2.利用反义RNA技术获得雄性不育植株将Chs基因的反义基因与CaMV 35S启动子花药特异序列串联构建嵌合基因，导入矮牵牛，结果抑制了Chs合成，阻碍花粉的正常发育，从而得到了雄性不育的矮牵牛(Seymouret al.1993；Van der Krol et al，19990a，1990b；Hall et al.1993)。
3.通过提早降解胼胝质壁获得雄性不育植株Hird等(1993)将与抗病性相关的β-1，3葡聚糖酶基因分别与拟南芥花粉发育早期启动子A9，A3融合，转化矮牵牛后获得不同程度的雄性不育植株。
发明内容
本发明目的之一是提供一种新的与花粉发育相关的基因，具体地说提供了一种从玉米花粉中克隆获得的与花粉发育相关的非编码RNA的cDNA，称之为ZM401。
本发明的另一目的是提供一种利用所述基因制备雄性不育植物的新方法。本发明将上述基因转化植物获得了显示典型的花粉败育的转基因玉米和烟草。
发明详述本发明通过差异筛选从玉米花粉cDNA文库中筛选到一个花粉特异的cDNA片段命名为zm401，它与花粉发育相关，该cDNA的序列无长的阅读框架，长度1149bp，为双链核酸类型，线性。
本发明构建了含有所述cDNA的玉米表达载体。在一个优选的实施方式中，所述的载体包括一个表达盒，以潮霉素磷酸转移酶基因作为选择标记基因，编码氨基核糖苷4-磷酸转移酶APH(4)-1。所述的表达盒含有玉米花粉特异启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域。所述的表达载体优选的是重组质粒pZM401SH。
本发明还构建了含有所述cDNA的烟草表达载体，在一个优选的实施方式中，所述质粒含有35S启动子，驱动组成型表达，所述的表达载体优选的是重组质粒pBI401F。
本发明将上述含有所述cDNA的重组表达载体转化植物，获得了雄性不育转基因植物。
在一个优选的实施方式中，将含有所述cDNA的玉米表达载体转化玉米，获得了显示典型的花粉败育的转基因玉米。
在另一个优选的实施方式中，将含有所述cDNA的烟草表达载体转化烟草，获得了显示典型的花粉败育的转基因烟草。
有益效果本发明利用获得的来自于玉米花粉cDNA文库的新的非编码RNA的cDNA，制备了显示典型的花粉败育的转基因玉米和烟草。因此利用本发明的cDNA可制备更多种类的雄性不育植物，这为利用基因工程手段创造雄性不育的策略为杂种优势的利用开辟了一条崭新的途径。
附图简述
图1表示来自玉米的非编码RNA的cDNA序列，序列特征无长的阅读框架，长度1149，类型双链核酸，拓扑线性。
图2由zm401 cDNA核苷酸序列推导的氨基酸序列分析结果(*表示终止密码子)，含有多个终止子[Translation possibilities analysis ofZM401cDNA(*indicated termination codons)]。
图3表示含有玉米非编码RNA的cDNA构建过程。
图4pBI401F表达载体(含0.7Kb正向cDNA)的构建方案(Constructionof expression vector pBI401F)表示含有玉米非编码RNA的cDNA的烟草表达载体构建过程。
图5R0代转基因玉米(RS60.ZSg0)的Southern杂交，表型变化及花粉育性和组织学分析。
A)部分转化玉米的hyg和zm401 Southern杂交结果B)转基因玉米(RS60、RS62)花药的表型分析C)转基因玉米(RS60、ZS90)花粉活力的测定D)转基因玉米(RS60、ZS90)花粉育性的观察E)转基因玉米(RS60、ZS90)花药横切—示花粉形态异常F)转基因玉米(RS60、ZS90)花药横切—示花粉发育异常、绒毡层退化延迟G)转基因玉米(RS60、ZS90)花药横切—示花粉囊发育异常左边未转化植物中间转基因植物(RS60)右边转基因植物(ZS90)图6烟草花蕾期形态学分析和双核雄配子体时期组织分析A)非转化烟草B)非转化植株双核雄配子体期绒毡层退化消失C)转ZM401正义基因的烟草D)转ZM401正义基因的烟草在双核雄配子体时期绒毡层退化延迟R0代转基因烟草的花蕾期的形态分析和双核雄配子体时期的组织学分析。
具体实施例方式
下面是实现本发明的具体实施方式
。
实施例1通过差异筛选从玉米花粉cDNA文库中筛选到一个花粉特异的cDNA片段，命名为zm401，用3′RACE(购自GIBCOBRL公司)和5′RACE(购自GIBCOBRL公司)获得了全长cDNA。
3’RACE中所用引物
P1(21nt)5’--ATCGGGAGCGAGGAGTGGTGC--3’，NGSP2(22nt)5’--GGTGAAGCGTCAATTTATAGGG--3’，5’RACE中所用引物GSP1(18nt)5’-TAGCCATACTCCGGTGAC-3’.
GSP4(25nt)5’--CTCACCGCCGTAAGCTCAATCTTGC--3’，将5′RACE和3′RACE扩增产物分别克隆到pMD18-T(购自Tatara公司)载体上，测序。用重叠PCR将分布在不同载体上的cDNA片段进行拼接。扩增产物克隆到pMD18-T载体上，测序。得到的cDNA全长为1149bp。含有poly(A)尾部，但无完整的阅读框架。该序列示于
图1中，称之为zm401。
重叠PCR中所用引物ZCF1(24nt)ZCF15′-TTGCGAGCACATGGACGGAGGCGC--3′ZCF2(32nt)5′--TTTTTTTTTTTTTTTTTTGATCACGAACCTTATAATAAAGTTGAAGCTGG--3′实施例2用于玉米中表达zm401的表达载体的构建根据已报道的玉米花粉特异表达zm13启动子的序列(Hanson DD等人(1989)，Plant Cell 1173-178，1989)设计引物ZM13PF(21nt)5′-CCAACTCAGTCCCGTTCAATC-3′；ZM13PR(21nt)5′-CGCCGGGTGAATGTACGTGTT-3′，以玉米基因组DNA为模板，进行PCR扩增，将得到的片段连接到pUC-T载体(Promega公司)上，得到重组质粒pUCZM13，进行序列测定，得到ZM13启动子。
表达盒是由玉米花粉特异启动子和来自胭脂碱合成酶(nos)基因的转录终止区域(Depickere等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1561-570)组成，选择标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因，编码氨基核糖苷4-磷酸转移酶APH(4)-1。具体构建过程示于图3将0.6Kb的ZM13启动子采用HindIII和KpnI双酶切从pUCZM13载体上切下来，回收，用HindIII和KpnI从pROK401S载体(其制备见下文)上切下0.8Kb35S启动子，回收大片段，将zm13启动子与大片段进行连接，得到重组质粒pZM401S。用HindIII将潮霉素磷酸转移酶基因2.0Kb从pUChyg(Gritz，Land Davies J.1983)载体上端下来，然后用HindIII单切pZM401S载体，将潮霉素磷酸转移酶基因与经HindIII单切的pZM401S片段连接得到重组质粒pZM401SH。
pROK401S制备过程质粒pB401用KpnI/Sad双酶切，将得到的片段即zm401片段插入到质粒Rok219的KpnI/Sad位点，得到重组质粒pROK401S。
pROK219制备过程质粒pBI121(购自Clontech公司)用HindIII/XbaI双酶切，将得到的片段即35S启动子插入到质粒pUC19(Messing J.1983)HindIII/XbaI位点，得到质粒pUC35S，将pBI121用Sad/EcoRI双酶切，将得到的片段插入到质粒pUC35S的Sad/EcoRI位点，得到质粒Rok219。
pB401制备过程zm401 cDNA首先克隆在pGEM-7zf(+)(购自Promega公司)载体的EcoRI位点，确定插入方向后，将该质粒用XbaI/BamHI双酶切，将得到的片段即zm401插入到质粒pBluscript(购自Promega公司)的XbaI/BamHI位点，得到重组质粒pB401。
实施例3用zm13启动子/zm401表达载体转化玉米取灭菌的玉米授粉后10-12天的雌穗，剥取幼胚，放于培养基A上(N6培养基，含2mg/L 2，4-D，0.69g/L L-脯氨酸，100mg/L酪蛋白水解物，2％蔗糖)，27-28℃，黑暗培养，使之脱分化，形成愈伤组织，用于基因枪转化。基因枪轰击采用BioRad Biolistic PDS-1000/Helium系统。在基因枪轰击前4小时，将愈伤切成小块，转移到含0.4M甘露醇的培养基A上，将实施例2获得的重组质粒pZM401SH载体用于轰击，然后，使愈伤组织在该培养基上继续培养过夜，然后转移到培养基A上培养4-6天，转移至含潮霉素(20mg/L)抗性培养基A上，每周继代一次，2个月后，转化至分化培养基上(N6培养基，含5％蔗糖)。
实施例4用于烟草中表达zm401的表达载体的构建利用BamHI和Sad双酶切pB401，将ZM401cDNA切下并回收纯化，农杆菌双元表达载体pBI121进行同样酶切处理，将GUS报告基因删除；zm401 cDNA正向插入到载体pBI121中的35S启动子下游，在35S启动子驱动下组成型表达，得到重组质粒pBI401F。该载体构建过程见图4。
实施例5用35S启动子/zm401表达载体(pBI401F)转化烟草pBI401F向农杆菌转化农杆菌感受态细胞的制备挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基(含链霉素Sm 125μg/ml)中，28℃振荡培养过夜；取过夜培养菌液500μl接种于50ml YEB(Sm 125μg/ml)液体培养基中，28℃振荡培养至OD600为0.5；5000rpm，离心5min；加10ml 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞，5000rpm，离心5min；1ml预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，24小时内使用，或分装成每管200μl，液氮中速冻1分钟，置-70℃保存备用。
pBI401F向农杆菌感受态细胞的转化取200μl感受态细胞，加入1μg质粒DNA，液氮中速冻1分钟，37℃水浴5分钟，然后加入1ml YEB培养基，28℃慢速振荡培养4小时；1000rpm离心30sec，弃上清，加入0.1ml YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100μg/ml Kan和125μg/ml Sm的YEB平板上，28℃培养约48小时。
pBI401F向烟草的转化取温室生长的烟草叶片，流水下冲洗掉表面杂物，再用蒸馏水洗涤；70％的乙醇灭菌30秒后，无菌水冲洗一次；2.5％次氯酸钠处理8～10分钟；无菌水冲洗三次；将灭菌的烟草叶片切去边缘和主要叶脉，切成0.4×0.6cm2大小；切好的外植体在已转化了pBI401F质粒的农杆菌菌液中浸泡10分钟；用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液，转入上铺一层滤纸的MS基本培养基，28℃暗培养；三天后，将材料转到含有抗生素的分化培养基(MS+3mg/L 6-BA+0.2mg/LNAA+Kan 75～100μg/ml+Cb 500μg/ml)中进行培养；待抗性芽生长至2～3cm高时，切下小芽转入生根培养基中诱导生根(MS基本培养基+Kan 100μg/ml+Carbenicillin(Cb购自欣经科公司)500μg/ml)。
实施例6转基因玉米和烟草花粉中RNA的检测RNA的提取及点杂交采用现有技术公知的技术，以32P-标记的zm401作为探针进行杂交，结果参见图5，6，图中结果表明外源基因在玉米和烟草花粉中得到正常转录，转基因玉米和烟草出现典型的花粉败育情况。如花药退化，花粉形态异常，花粉发育不同步，花粉囊合并不同步，绒毡层退化延迟现象。
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序列表纸件(1)序列表<110>中国农业大学<120>与花粉发育相关的非编码RNA的cDNA以及制备雄性不育植物的方法<130>PCT8-2<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1149<212>DNA<213>maize<400>1ttgcgagcac atggacggag gcgcaaatcc atgccggcgg ttacgtgcta cggtggtgtt60gagcatgcgg acacccttac ggatgcaacc caaacacatt cacgtgctca attcggccag120agcgcggtta ccacatagct gctcgcgata gcggcgaaac cggatcaccg gcgtgccctt180accggtctac ctaagctggt cgagtttaat ccagggatgc ggaatgactc agtgacctac240tagggttata gtgctcacgc aaacttggac ggagactacc aggatcggcc ggtcgtcgcg300agctatgtct gcggcggcat tcccggacaa taacgcaacg ttctctaagc tatggtgcag360tagtgcttaa tcggccgaga ccaagagctt cactagcatc agaggatgtg gaatcgtaga420cccgagggat atgaacggac ttgtggatgg ctgaccacgg cgcgatgtct cacggtggtg480ttcttggccg atttggggaa aaaagaaatt cgcgagctat ggtggataat cgggagcgag540gagtggtgct ctgggtgcgt aacaagaagg cggaacaggg tgaggcgtca atttataggg600attgaccact ggtgctacga atttgggcaa gattgagctt acggcggtga gtgggtgagt660caccggagta tggctaccgt ggtgcacgat tgagcaaggt ctcgggtggt aactggctat720cactcacgac tcattgtgac gtggtaacac ggtcgatggt gtggcgcgac cgaggtaaac780ggcggccacc atggcgacgg tcgcacggcc acggcgccgg gcaagtgggt acgacgaggc840agacccaatc caaccccctt ctgatctttt cactcctgcg gtaatatcct tcctgaacca900agcacgaatc acagcggcca gcgcgaatcc tcatgcggag attaccgacg gcaaggtgca960ctgcatctac gatcttcttc agacactgtt cattttgaat agctcattta ccagcctgac1020agagcaattt gaggagcttt gttcttcggt tttcatgtga cgaactgcta atccgactac1080atcaaagttg ttgccctata taccagcttc aactttatta taaggttcgt gatcaaaaaa1140aaaaaaaaa1149
权利要求
1.一种与花粉发育相关的非编码RNA的cDNA，其序列如下所示1 TTGCGAGCACATGGACGGAGGCGCAAATCCATGCCGGCGGTTACGTGCTACGGTGGTGTT61 GAGCATGCGGACACCCTTACGGATGCAACCCAAACACATTCACGTGCTCAATTCGGCCAG121AGCGCGGTTACCACATAGCTGCTCGCGATAGCGGCGAAACCGGATCACCGGCGTGCCCTT181ACCGGTCTACCTAAGCTGGTCGAGTTTAATCCAGGGATGCGGAATGACTCAGTGACCTAC241TAGGGTTATAGTGCTCACGCAAACTTGGACGGAGACTACCAGGATCGGCCGGTCGTCGCG301AGCTATGTCTGCGGCGGCATTCCCGGACAATAACGCAACGTTCTCTAAGCTATGGTGCAG361TAGTGCTTAATCGGCCGAGACCAAGAGCTTCACTAGCATCAGAGGATGTGGAATCGTAGA421CCCGAGGGATATGAACGGACTTGTGGATGGCTGACCACGGCGCGATGTCTCACGGTGGTG481TTCTTGGCCGATTTGGGGAAAAAAGAAATTCGCGAGCTATGGTGGATAATCGGGAGCGAG541GAGTGGTGCTCTGGGTGCGTAACAAGAAGGCGGAACAGGGTGAGGCGTCAATTTATAGGG601ATTGACCACTGGTGCTACGAATTTGGGCAAGATTGAGCTTACGGCGGTGAGTGGGTGAGT661CACCGGAGTATGGCTACCGTGGTGCACGATTGAGCAAGGTCTCGGGTGGTAACTGGCTAT721CACTCACGACTCATTGTGACGTGGTAACACGGTCGATGGTGTGGCGCGACCGAGGTAAAC781GGCGGCCACCATGGCGACGGTCGCACGGCCACGGCGCCGGGCAAGTGGGTACGACGAGGC841AGACCCAATCCAACCCCCTTCTGATCTTTTCACTCCTGCGGTAATATCCTTCCTGAACCA901AGCACGAATCACAGCGGCCAGCGCGAATCCTCATGCGGAGATTACCGACGGCAAGGTGCA961CTGCATCTACGATCTTCTTCAGACACTGTTCATTTTGAATAGCTCATTTACCAGCCTGAC1021 AGAGCAATTTGAGGAGCTTTGTTCTTCGGTTTTCATGTGACGAACTGCTAATCCGACTAC1081 ATCAAAGTTGTTGCCCTATATACCAGCTTCAACTTTATTATAAGGTTCGTGATCAAAAAA1141 AAAAAAAAA。
2.一种表达载体，含有权利要求1所述基因和一种启动子。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其中所述启动子是植物花粉特异启动子。
4.一种制备雄性不育的植物的方法，包括将权利要求2所述的表达载体转化植物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于其中所述的植物是双子叶和单子叶植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于其中所述的植物是烟草和玉米。
全文摘要
本发明公开了一种新的与花粉发育相关的非编码RNA的cDNA，该cDNA是从玉米花粉cDNA文库中筛选得到。本发明利用转基因技术将所述基因转化到植物中制备雄性不育植物如雄性不育的烟草和玉米。本发明为利用基因工程手段创造雄性不育的策略为杂种优势的利用开辟了一条崭新的途径。
文档编号A01H1/00GK1523108SQ0315663
公开日2004年8月25日 申请日期2003年9月5日 优先权日2003年9月5日
发明者敖光明, 于静娟, 赵倩, 戴晓燕, 李成霞 申请人:中国农业大学