专利名称：裸子植物花粉管微丝骨架的荧光标记方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域中花粉管微丝骨架的荧光标记方法及其应用，特别是涉及一种对裸子植物花粉管微丝骨架进行荧光标记的方法以及用该方法对裸子植物花粉花粉管微丝骨架进行显微镜观测中的应用。
背景技术：
花粉管作为有花植物受精过程中雄性生殖单位的载体，具有典型的顶端生长特性，因而成为生物技术领域中研究细胞极性生长的理想模式系统。此外，花粉管系统对细胞间的相互作用研究以及信号传导研究也具有重要意义。细胞骨架是花粉管的基本组织结构，参与细胞形态建成、极性维持、细胞器及囊泡运动等重要的生理过程，特别是存在于花粉管顶端区域的微丝，对胞吞胞吐过程以及顶端细胞壁的构建具有极其重要的调节功能。
对于花粉管中微丝骨架的分布至今仍然存在争议。目前，花粉管微丝骨架的荧光标记方法主要有固定细胞荧光标记法、转基因荧光标记法以及显微注射荧光标记法等。固定细胞荧光标记法是使用最为广泛的标记方法，该方法主要采用Triton X-100等去垢剂或DMSO等有机溶剂作为渗透剂，这些试剂不仅对细胞结构具有破坏作用，而且对细胞内的蛋白具有抽提作用。迄今为止，对裸子植物花粉粒与花粉管中微丝骨架进行标记的有效方法和技术还未见报道，从而导致与裸子植物相关的生物学研究相对被子植物而言比较滞后。
发明内容
本发明的目的是提供一种较快速、有效的裸子植物花粉管微丝骨架的荧光标记方法。
本发明所提供的对裸子植物花粉管微丝骨架进行荧光标记的方法，包括以下步骤1)将裸子植物花粉管用含2-4％(质量百分浓度)多聚甲醛的40-60mM Pipes缓冲液固定30-60min；2)洗涤花粉管；3)将花粉管置于0.2-0.3％(V/V)甘油中渗透30-60min；4)洗涤花粉管；
5)将花粉管用150-250nM经荧光标记的鬼笔环肽(phalloidin)避光染色0.5-1.5h，微丝骨架被荧光标记。
在上述荧光标记方法中，步骤1)和步骤2)中40-60mM Pipes缓冲液的配方为40-60mM PIPES，0.5mM MgCl2，1mm EGTA，pH 6.8-7.0(优选为6.9)。
步骤1)中的固定剂优选为含3％多聚甲醛的50mM Pipes缓冲液，固定时间优选为30min。
步骤2)中的渗透剂优选为0.25％甘油，渗透时间优选为40min。
步骤1)和步骤2)中的洗涤液可为40-60mM Pipes缓冲液，优选为50mM Pipes缓冲液。
步骤3)中经荧光标记的鬼笔环肽的浓度优选为200nM，染色时间优选为1h。所述经荧光标记的鬼笔环肽可为市售的各种经荧光标记的鬼笔环肽，尤以TRITC-鬼笔环肽(Sigma公司，USA)效果最佳。
上述荧光标记方法特别适用于松杉纲、银杏纲以及苏铁纲的裸子植物；所述松杉纲中效果较突出的包括白杆、青杆、油松、云杉、冷杉等松科裸子植物，特别优选为白杆；所述银杏纲的代表植物为银杏；苏铁纲的代表植物为苏铁。
本发明的第二个目的是提供一种对裸子植物花粉管微丝骨架进行显微镜观测的方法。
本发明所提供的对裸子植物花粉管微丝骨架进行显微镜观测的方法，是先用上述方法对裸子植物花粉管微丝骨架荧光标记，然后滴加含0.15-0.25％(质量百分比浓度)抗荧光淬灭剂的40-60％(V/V)甘油，封片，用激光共聚焦显微镜进行观测，可清晰地观测到花粉管微丝骨架。
所述抗荧光淬灭剂的选择是多种多样的，如Propyl gallate、Vectashield(Vector公司)或Fenyleen diamine等。
本发明提供了一种对裸子植物花粉管微丝骨架进行荧光标记的方法。本发明的标记方法具有以下优点1)操作简单，快速省略了常规标记方法中对细胞壁进行酶解的步骤；2)用甘油作为渗透试剂，减少了对细胞的损伤；3)标记效果好可在激光共聚焦显微镜下清晰地观测到花粉管中沿与花粉管长轴平行方向连续分布的微丝骨架。本发明将在裸子植物花粉管细胞骨架的研究中发挥重要作用，实际应用价值高。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为在激光共聚焦显微镜下观察到的白杆花粉管微丝骨架的分布状态及其明场观测结果图2为在激光共聚焦显微镜下观察到的白皮松花粉管微丝骨架的分布状态及其明场观测结果
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量如无特别说明均为体积百分含量。
实施例1、白杆花粉管微丝骨架的荧光标记及其显微镜观测首先用本发明的方法对白杆花粉管微丝骨架进行荧光标记，包括以下步骤1)收集待标记的白杆花粉管样品，在新鲜配制的含质量百分浓度为3％的多聚甲醛的50mM Pipes缓冲液(50mM PIPES，0.5mM MgCl2，1mM EGTA，pH 6.9)中快速抽气固定30min；2)用50mM Pipes缓冲液洗涤3次，以去除残余的多聚甲醛；3)将花粉管置于0.25％甘油中，在室温下渗透40min；4)用50mM Pipes缓冲液洗涤3次；5)将花粉管与200nM TRITC-鬼笔环肽(Sigma公司，USA)在室温下暗孵育1h。然后，向经过荧光标记的花粉管样品中滴入含0.2％Propyl gallate(Sigma公司，USA)的50％甘油中，用指甲油封片，最后在激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 510，Ar/Kr激光，激光波长515nm)下进行观测，沿Z轴进行连续光学切片，并将所有光学切片进行三维重构，观测结果如图1所示(小图在明场下的观测结果，对照)，与对照相比，用本发明的方法对白杆花粉管微丝骨架进行荧光标记可在激光共聚焦显微镜下清晰地观测到微丝骨架在花粉管中的分布状况。
实施例2、白皮松花粉管微丝骨架的荧光标记及其显微镜观测首先用本发明的方法对白皮松花粉管微丝骨架进行荧光标记，包括以下步骤1)收集待标记的白皮松花粉管样品，在新鲜配制的含4％多聚甲醛的60mM Pipes缓冲液(60mM PIPES，0.5mM MgCl2，1mM EGTA，pH 6.9)中快速抽气固定50min；2)用60mM Pipes缓冲液洗涤4次，以去除残余的多聚甲醛；3)将花粉管置于0.2％甘油中，在室温下渗透60min；4)用60mM Pipes缓冲液洗涤4次；5)将花粉管与250nM TRITC-鬼笔环肽在室温下暗孵育1.5h。然后，向经过荧光标记的花粉管样品中滴入含0.2％Propyl gallate的60％甘油中，用指甲油封片，最后在激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 510，Ar/Kr激光，激光波长515nm)下进行观测，沿Z轴进行连续光学切片，并将所有光学切片进行三维重构，观测结果如图2(小图在明场下的观测结果，对照)所示，与对照相比，用本发明的方法对白皮松花粉管微丝骨架进行荧光标记可在激光共聚焦显微镜下清晰地观测到微丝骨架在花粉管中的分布状况。
权利要求
1.一种裸子植物花粉管微丝骨架的荧光标记方法，包括以下步骤1)将裸子植物花粉管用含质量百分浓度为2-4％多聚甲醛的40-60mM Pipes缓冲液固定30-60min；2)洗涤花粉管；3)将花粉管置于体积百分比浓度为0.2-0.3％甘油中渗透30-60min；4)洗涤花粉管；5)将花粉管用150-250nM经荧光标记的鬼笔环肽避光染色0.5-1.5h，微丝骨架被荧光标记。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中的固定剂为含3％多聚甲醛的50mM Pipes缓冲液，固定时间为30min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤3)中的渗透剂为0.25％甘油，渗透时间为40min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)和步骤4)中的洗涤液均为40-60mM Pipes缓冲液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤5)中经荧光标记的鬼笔环肽的浓度为200nM，染色时间为1h；所述经荧光标记的鬼笔环肽为TRITC-鬼笔环肽。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述裸子植物为松杉纲、银杏纲以及苏铁纲的植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述松杉纲植物为松科的白杆、青杆、油松、云杉和冷杉；银杏纲植物为银杏；苏铁纲植物为苏铁。
8.一种对裸子植物花粉管微丝骨架进行显微镜观测的方法，是先用权利要求1所述的方法对裸子植物花粉管微丝骨架荧光标记，然后滴加含质量百分比浓度为0.15-0.25％抗荧光淬灭剂的40-60％甘油，封片，最后用激光共聚焦显微镜对花粉管微丝骨架进行观测。
9.根据权利要求8所述的观测方法，其特征在于所述抗荧光淬灭剂为Propylgallate、Vectashield或Fenyleen diamine。
全文摘要
本发明公开了一种对裸子植物花粉管微丝骨架进行荧光标记的方法及其应用。其目的是提供一种对裸子植物花粉管微丝骨架进行荧光标记的方法以及该方法在裸子植物花粉花粉管微丝骨架的显微镜观测中的应用。该标记方法包括以下步骤1)将裸子植物花粉管用含2－4％多聚甲醛的40－60mM Pipes缓冲液固定30－60min；2)洗涤花粉管；3)将花粉管置于0.2－0.3％甘油中渗透30－60min；4)洗涤花粉管；5)将花粉管用150－250nM经荧光标记的鬼笔环肽避光染色0.5－1.5h，微丝骨架被荧光标记。本发明具有操作简单，快速，对细胞的损伤小，标记效果好的优点，将在裸子植物花粉管细胞骨架的研究中发挥重要作用，实际应用价值高。
文档编号C12N5/04GK1884486SQ200610012238
公开日2006年12月27日 申请日期2006年6月14日 优先权日2006年6月14日
发明者林金星, 陈彤, 王玉花 申请人:中国科学院植物研究所