专利名称：检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的特异性扩增引物及其检测试剂盒和检测方法
技术领域：
-
本发明主要涉及动物生物技术领域中的绵羊分子标记辅助育种技术，具体涉及到藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的检测。
背景技术：
-
绵羊腐蹄病是由节瘤拟杆菌引起高度接触性传染病，其特征是蹄局部组织发炎、坏死。绵羊患病后生长不良、掉膘、羊毛品质下降，病情严重且得不到及时治疗时会引起羊只死亡。藏绵羊易患腐蹄病，于每年7-9月份的多雨季节爆发，如在甘肃和青海境内的藏绵羊发病率高达30%以上，死亡率最高可达10%，严重影响牧区养羊业发展。
动物主要组织相容性(基因)复合体(major histocompatibility complex ,MHC)与多种疾病有密切关系，是目前开展抗病育种的首选基因座或候选基因。绵羊主要组织相容性(基因)复合体也称为OLA (ovine lymphocyte antigen) ， OLA II区与人的相似，区域内的￡ 2和Di 2个基因家族表现丰富的多态性，但绵羊的多态性更集中在DQ家族。OLA-DQ基因家族有2个DQA基因座位，即DQA1和DQA2基因，都具有多态性。
目前国内绵羊腐蹄病主要采用药物防治措施，较难控制病情且有药物残留风险。在国外OLA-DQA2基因已经作为抗腐蹄病的遗传标记加以应用，并且该检测已商业化并用来开展抗病选育。藏绵羊腐蹄病抗性分子选种技术主要利用PCR-SSCP技术对待测绵羊的DQA2基因第2外显子进行多态性分析，然后根据检测结果确定携带不同等位基因的羊只对腐蹄病的抗性强弱，从而判断是否可以留作种用。
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的特异性扩增弓l物及其引物的扩增条件。
本发明的另一 目的是提供一种检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测试剂盒。本发明的还有一个目的是提供一种检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测试剂盒的使用方法。
以解决快速、敏感性高、成本低用于藏绵羊腐蹄病抗性分子选种技术。本发明利用PCR-SSCP对表型正常和患腐蹄病藏绵羊OLA-DQA2基因第2外显子进行遗传多态性分析，并克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列，结合表型观测资料，确定易感等位基因和抗性等位基因，并指导藏绵羊没有感染时的抗病选育。
本发明涉及一种藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测方法及检测试剂盒。通过PCR-SSCP对藏绵羊基因组DNA进行检测，分析羊只是否携带腐蹄病抗性等位基因，从而判断是否可以留作种用。
本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现 一种检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的特异性扩增引物，其主要特点是第一组引物上游长度为24bp的核苷酸，下游长度为22bp的核苷酸，第二组引物上游长度为23bp的核苷酸，下游长度为24bp的核苷酸，包括用于扩增OLA-DQA2基因第2外显子的特异性引物，序列如下上游弓I物24bp: DQA2-up: CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC;下游引物22bp: DQA2-dn: CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG;上游弓I物23bp: DQA2s-up: ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT;下游弓l物24bp: DQA2s-dn: GGAGTAGAATGGTG GACACTTACC;其中I^A或G， Y-C或T。
所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的特异性扩增引物，是所述的PCR-SSCP扩增引物的扩增条件为
第一次第一组引物PCR反应条件预变性94t:2 min ，变性94。C30s ，退火64。C30s，延伸72。C50s，共32个循环，最后72。C延伸5 min;
第二次第二组引物PCR反应条件预变性94'C2 min ，变性94'C30s ，退火67'C30s，延伸72'C30s，共32个循环,最后72'C延伸5 min。
所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测试剂盒，组成成分用量及浓度为四种引物各为0.5nL/10pmo1， dNTP为1.2nL/2.5mm， Taq DNA聚合酶为0.2pL/2.5U4iL，10xbuffer为2.0pL含Mg2+15nM，双纯水为14.6pL。
SSCP检测试剂去离子水，10%过硫酸铵，变性缓冲液，TEMED(四甲基乙二胺)，聚丙烯酰胺(Acr: Bis = 39:1)， OLA-DQA2*L的DNA标准样。
所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测方法，是藏绵羊易感等位基因和抗性较强等位基因的确定步骤为
(1)收集表型正常和患腐蹄病藏绵羊基因组DNA;(2) 用上述特异性引物DQA2-up和DQA2-dn扩增步骤(1 )中的DNA特异性片 段；
(3) 用上述特异性引物DQA2s-up和DQA2s-dn扩增步骤(2)中的的PCR产物；
(4) 用步骤(3)中的的PCR产物进行SSCP检测；
(5) 克隆、测序步骤(4)中产生的各等位基因序列；
(6) 根据(4)的基因型判别结果，结合表型观测资料，确定藏绵羊腐蹄病易感等 位基因和抗性等位基因；
(7)确定藏绵羊腐蹄病易感等位基因为OLA-DQA2*H，抗性等位基因为
OLA-DQA2*L。
所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测方法，具体的检测步骤如下
(1 )样品采集采集表型正常和患腐啼病的藏绵羊，颈静脉采血10ml， ACD抗凝-20
'C冻存；
(2) 基因组DNA的提取用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA;
(3) 聚合酶链式反应
20pL的反应体系，其成分用量及浓度为四种引物各为0.5pL/10pmol， dNTP为 1.2nL/2.5腿，TaqDNA聚合酶为0.2nL/2.5U/pL， 10xbuffer为2.0^iL含Mg2+15pM，模 板DNA为ljiL/50ng，双纯水为14.6pL;
第一次第一组引物PCR反应条件预变性94。C2min ，变性94。C30s ，退火64。C30s， 延伸72'C50s，共32个循环，最后72'C延伸5 min;
第二次第二组引物PCR反应条件预变性94。C2min ，变性94。C30s ，退火67。C30s， 延伸72'C30s，共32个循环，最后72'C延伸5min;
DQA2-up和DQA2也的扩增产物大小为828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的扩增产物为模板的扩增产物大小为242bp。
(4) PCR产物的SSCP检测
取2^d的PCR产物加入^l的上样变性缓冲液,包括98。/。去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、 0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTApH8.0 ， 98 。C变性10min ，立即冰浴10min; 12% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶，140V电压条件下，4'C电泳19h ，银染法显色后拍照；
(5) 结果判断
在藏绵羊DQA2基因第2外显子上共发现16个(OLA-DQA2*A-OLA-DQA2*P) 等位基因，藏绵羊腐蹄病易感等位基因为OLA-DQA2*H，抗性等位基因为 OLA-DQA2*L。所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测试剂盒的使用方法，具体的步骤为
(1) 试剂盒中各组分与待检测基因组DNAlnL/50ng混合，进行PCR扩增； 所述的PCR-SSCP扩增引物的扩增条件为
第一次第一组引物PCR反应条件预变性94'C2 min ，变性94'C30s ，退火 64'C30s，延伸72'C50s，共32个循环，最后72'C延伸5 min;
第二次第二组引物PCR反应条件预变性94'C2 min ，变性94'C30s ，退火 67。C30s，延伸72'C30s，共32个循环,最后72。C延伸5 min。
(2) 用步骤(1)中扩增的PCR产物和OLA-DQA2化标准样与试剂盒中SCCP检 测试剂各组分混合进行SSCP检测；
(3) 步骤(2)中检测到的带型与试剂盒中OLA-DQA2*L的DNA标准样带型一致 的样品为携带腐蹄病抗性等位基因的个体。
本发明的有益效果本发明利用PCR-SSCP对表型正常和患腐蹄病藏绵羊的 OLA-DQA2基因第2外显子进行遗传多态性分析，并克隆、测序群体内变异产生的各等 位基因序列，结合表型观测资料，确定易感等位基因和抗性较强的等位基因，为藏绵羊 没有感染时的抗病选育进行指导。本发明通过对试验羊只OLA-DQA2基因第2外显子的 SSCP检测，发现了16个等位基因，其中14个等位基因(OLA-DQA2*A、 OLA-DQA2*B、 OLA-DQA2*C、 OLA-DQA2*D 、 OLA-DQA2*E 、 OLA-DQA2*F 、 OLA-DQA2*G 、 OLA-DQA2*I、 OLA-DQA2*J、 OLA-DQA2*K 、 OLA-DQA2*M 、 OLA-DQA2*N 、 OLA-DQA2*0、 OLA-DQA2*P )在正常和患病群体中都存在，l个等位基因 (OLA-DQA2*L)只在正常群体中存在，另有l个等位基因(OLA-DQA2*H)只在患病 群体中存在。将等位基因OLA-DQA2+L作为藏绵羊腐蹄病抗病相关MHC基因标记，建立 了抗病相关基因标记辅助选种技术。本发明对藏绵羊抗腐蹄病的分子标记选种具有快速、 敏感性高、成本低等特点。
图i是藏绵羊OLA-DQA2基因第2外显子PCR-SSCP检测凝胶图。
具体实施例方式
以下对所示之最佳实施例作进一步详述
下面以藏绵羊腐蹄病抗性分子选种技术的建立为例，对本发明的内容进行详细的说明。
实施例h 试验材料
藏绵羊选自甘肃省甘南藏族自治州大水种畜场104只，甘南州碌曲县牧民羊群羊791 只(患腐蹄病223只)，青海省海晏县哈里乡哈里村牧民羊群72只(患腐蹄病22只)，颈 静脉采血10ml， ACD抗凝,-20 。C冻存。用酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA， 溶于TE， 4'C保存。 试验方法
l.引物设计和PCR扩增
采用巢式PCR进行基因扩增。DQA2-up和DQA2-dn的扩增产物大小为828bp ， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up和DQA2-dn的扩增产物为模板的扩增产物大小为 242bp，引物序列为
上游弓I物24bp: DQA2-up. CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC;
下游引物22bp: DQA2-dn: CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG;
上游引物23bp: DQA2s-up: ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT;
下游弓I物24bp: DQA2s-dn: GGAGTAGAATGGTGGACACTTACC;
其中R=A,Y=C。
PCR反应体系2(HiL的反应体系，其成分用量及浓度为四种引物各为0.5pL/10pmd， dNTP为1.2)^L/2.5mm， TaqDNA聚合酶为0.2^iL/2.5U/pL， 10xbuffer为2.0ijL含Mg2+15pM， 模板DNA为lpL/50ng，双纯水为14.6pL。
PCR反应条件第一次第一组引物PCR反应条件预变性94'C2 min ，变性94'C 30s ，退火64。C30s，延伸72。C50s，共32个循环,最后72'C延伸5 min。
第二次第二组引物PCR反应条件预变性94'C2 min ，变性94'C30s ，退火67'C 30s，延伸72。C30s，共32个循环,最后72。C延伸5min。
DQA2-up和DQA2-dn的扩增产物大小为828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的扩增产物为模板的扩增产物大小为242bp。
得到242bp的特异性扩增产物，可直接进行SSCP检测。
2.SSCP检测
取步骤l中2nl的PCR产物加入8til的变性上样缓冲液[包括98。/。去离子甲酰胺、0. 025% 溴酚蓝、0. 025%二甲苯青、10mmol/LEDTA (pH 8. 0) ]， 98 。C变性10min ,立即冰浴10min。 12 。/。的非变性聚丙烯酰胺凝胶(Arc: Bis = 39:1)140V电压条件下,4 。C电泳19h ，银染法显色后拍照。
其中，对PCR扩增产物进行SSCP分析，在所检测的967只藏绵羊中共发现16个等位 基因，分别指定为01^-0(5^*八、*B、 ......*0和叩。各等位基因的电泳条带从1条到4
条不等，结果见图l。
3. 不同等位基因的克隆测序
经SSCP分析后,利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收不同等位基因的PCR产物。回收后 的片段用载体连接，构建重组质粒,并转化大肠杆菌DH5a菌株，菌落PCR鉴定后送上海 桑尼生物工程有限公司进行测序。
4. 藏绵羊DQA2基因第2外显子等位基因频率
表1藏绵羊DQA2基因第2外显子的等位基因频率
￥^""" 观察值 等位基因频率 一
基因 ~~~患病羊 健康羊 患病羊 健康羊
合计 245 722
5.结果分析
禾,PCR-SSCP方法检测了967只表型正常和患病藏绵羊OLA-DQA2基因第2外显子 的多态性后，发现了16个等位基因，其中14个等位基因(OLA-DQA2*A、 OLA-DQA2*B、 OLA-DQA2*C、 OLA-DQA2*D 、 OLA-DQA2*E 、 OLA-DQA2*F 、 OLA-DQA2*G、 OLA-DQA2*I、 OLA-DQA2*J、 OLA-DQA2*K 、 OLA-DQA2*M 、 OLA-DQA2*N 、 OLA-DQA2*0、 OLA-DQA2*P )在正常和患病群体中都存在，l个等位基因 (OLA-DQA2*L)只在正常群体中存在，另有l个等位基因(OLA-DQA2*H)只在患病 群体中存在。
94 0.1673 0.1302
79 0.0653 O.麵
23 0.0245 0.0319
26 0.0204 0.0360
27 0.0245 0,0374 87 0.1469 0.1205 56 0.0857 0.0776 0 0.0204 0.0000 58 0.0898 0.0803 48 0.0653 0.0665 54 0.0857 0.0748 7 O遍O 0.0097 56 0.0571 0,0776 18 0.0490 0.0249 36 0.0163 0.0499 53 0.0816 0.0734
6 1 2 6 1: >
3 2 5 2 1 2 o
o
2
ABCDEFGHIJKLMN9T实施例2:所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测方法，是藏绵羊易感等位基 因和抗性较强等位基因的确定步骤为
(1) 收集表型正常和患腐蹄病藏绵羊基因组DNA;
(2) 用上述特异性引物DQA2-up和DQA2-dn扩增步骤(1)中的DNA特异性片 段；
(3) 用上述特异性引物DQA2s-up和DQA2s-dn扩增步骤(2)中的的PCR产物；
(4) 用步骤(3)中的的PCR产物进行SSCP检测；
(5) 克隆、测序步骤(4)中产生的各等位基因序列；
(6) 根据(4)的基因型判别结果，结合表型观测资料，确定藏绵羊腐蹄病易感等 位基因和抗性等位基因；
(7)确定藏绵羊腐蹄病易感等位基因为OLA-DQA2*H，抗性等位基因为
OLA-DQA2*L。
实施例3:所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测方法，具体的检测步骤如下
(1) 样品采集:采集表型正常和患腐啼病的藏绵羊，颈静脉采血10ml， ACD抗凝,-20
'C冻存；
(2) 基因组DNA的提取用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA;
(3) 聚合酶链式反应
20pL的反应体系，其成分用量及浓度为四种引物各为0.5pL/10pmol， dNTP为 1.2pL/2.5mm， Taq DNA聚合酶为0.2mL/2.5U/mL， 10xbuffer为2.0pL含Mg2+15jiM，模 板DNA为lnL/50ng，双纯水为14.6pL;
第一次第一组引物PCR反应条件预变性94。C2min ，变性94。C30s ，退火64。C30s， 延伸72。C50s，共32个循环,最后72。C延伸5 min;
第二次第二组引物PCR反应条件预变性94'C2min ，变性94'C30s ，退火67'C30s， 延伸72。C30s，共32个循环，最后72'C延伸5 min;
DQA2-up和DQA2-dn的扩增产物大小为828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的扩增产物为模板的扩增产物大小为242bp。
(4) PCR产物的SSCP检测
取2pl的PCR产物加入^l的上样变性缓冲液,包括98。/。去离子甲酰胺、0. 025%溴酚蓝、 0.025。/。二甲苯青、10醒ol/LEDTApH8.0 ， 98 。C变性10min ，立即冰浴10min; 12% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶，140V电压条件下，4'C电泳19h ，银染法显色后拍照；
(5) 结果判断在藏绵羊DQA2基因第2外显子上共发现16个(OLA-DQA2*A-OLA-DQA2*P) 等位基因，藏绵羊腐蹄病易感等位基因为OLA-DQA2*H，抗性等位基因为 OLA-DQA2*L。
实施例4:试剂准备
(1) 基因组DNA提取所必需的试剂蛋白酶K(20mg/ml)， PBS (8gNaCl、 0.2gKCl、 1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4用HCl调节pH值至7.4，加水定容至1L)，苯酚，氯仿，异 戊醇，DNA提取液(10mMTris.Cl(pH 8.0)， 0.1 MEDTA(pH=8.0)， 0.5%SDS，调节pH二8.0， 定容到100ml)，无水乙醇，TE (lOmMTris'Cl (pH8.0)， lmMEDTA (pH8.0))。
(2) 进行PCR扩增所必须的试剂20pL的反应体系，其成分用量及浓度为四种引 物各为0.5pL/10pmo1， dNTP为1.2^L/2.5腿，Taq DNA聚合酶为0.2nL/2.5U/pL， 10xbuffer 为2.(^L含Mg2+15pM,模板DNA为lnL/50ng，双纯水为14.6pL。。
(3) SSCP检测所必须的试齐U:上样变性缓冲液[包括98%去离子甲酰胺、0. 025% 溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH8.0)]， 10%过硫酸铵，TEMED (四甲 基乙二胺)，12。/。的非变性聚丙烯酰胺凝胶(Arc:Bis-39:l)， OLA-DQA2^的DNA标准 样、去离子水。
实施例5:所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测方法，所述的待检物DNA的 提取有如下步骤
(1) 冷冻血液在室温融化以后，取500^1移至1.5ml离心管中，加入等体积PBS缓 冲液，混合，充分摇动，12000rpm离心10min，弃上清液。
(2) 再取500^il血液移至离心管中，加入等体积PBS缓冲液，混合，充分摇动， 12000rpm离心10min，弃上清液。
(3) 加入500(^1 DNA抽提缓冲液，重悬沉淀物。
(4) 加入蛋白酶K至终浓度为100pg/ml，混匀，用封口膜封住，55'C水浴过夜。
(5) 将溶液冷却至室温，加入等体积苯酚，缓慢的颠倒离心管10分钟，直至两相 混合形成乳浊液，12000rpm离心10min。
(6) 取上清，再加入等体积苯酚氯仿异戊醇(25: 24: 1)，缓慢的颠倒离心管 10min， 12000rpm离心10min。
(7) 取上清，加入等体积氯仿异戊醇(24: 1)，缓慢的颠倒离心管10min， 12000rpm 离心10min。
(8) 取上清，加入2倍体积的无水冰乙醇沉淀DNA，缓慢的转动离心管，可见白色DNA沉淀。
(9) 12000rpm离心10min;弃上清，然后加4'C预冷的70%乙醇洗两次，12000rpm 离心10min，弃上清。
(10) 将DNA干燥(室温放置2h)。
(11) 加5(^LTE溶解，-20°。冷冻保存备用。
实施例6:所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测试剂盒，包括
组成成分用量及浓度为四种引物各为0.5^171 Opmol， dNTP为1.2nL/2.5mm， Taq DNA聚合酶为0.2pL/2.5U/nL， 10xbuffer为2,0pL含Mg2+15nM，双纯水为14.6^L。
SSCP检测试剂去离子水，10%过硫酸铵，变性缓冲液，TEMED(四甲基乙二胺)， 聚丙烯酰胺(Acr: Bis = 39:1) ， 0LA-DQA2*L的DNA标准样。
实施例7:所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测试剂盒的使用方法，其步骤
为
(1)试剂盒中各组分与待检测基因组DNAlnL/50ng混合，进行PCR扩增； 所述的PCR-SSCP扩增引物的扩增条件为
第一次第一组引物PCR反应条件预变性94。C2 min ，变性94'C30s ，退火 64。C30s，延伸72。C50s，共32个循环，最后72。C延伸5 min;
第二次第二组引物PCR反应条件预变性94。C2 min ,变性94。C30s ，退火 67。C30s，延伸72。C30s，共32个循环,最后72。C延伸5 min。
(2) 用步骤(1)中扩增的PCR产物和OLA-DQA2化标准样与试剂盒中SCCP检 测试剂各组分混合进行SSCP检测；
(3) 步骤(2)中检测到的带型与试剂盒中OLA-DQA2化的DNA标准样带型一致
的样品为携带腐蹄病抗性等位基因的个体。 实施例8:
一种检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的扩增引物，第一组引物上游长度为24bp的 核苷酸，下游长度为22bp的核苷酸，第二组引物上游长度为23bp的核苷酸，下游长度 为24bp的核苷酸，包括用于扩增OLA-DQA2基因第2外显子的特异性引物，序列如下: 上游引物24bp: DQA2-up: CACATGTTACAGTGCAAAARCAGC 下游引物22bp: DQA2-dn CCCTCYCACCAACGTTTCCCAG 上游引物23bp: DQA2s陽up: ACTACCAATCTCATGGTCCCTCT 下游引物24bp: DQA2s-dn: GGAGTAGAATGGTG GACACTTACC 其中R=G，Y=T。其余步骤与实施例l相同。
序 歹U 表 SEQUENCE LISTING
<110>甘肃农业大学
<120>检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的特异性扩增引物及其检测试剂盒和检测方法
<130>
<160> 16
< 170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*A
<400> 1
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acacccagga atttgacgaa gacgagctgc 60
tttatgtgga cctggagaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg 120
caggttttca cattcaagtt gcactgagta acatagctac agagaaacac aacttggatg 180
tcatgactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240
cc 242
<210> 2
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*B
<400> 2
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt tcacccagga atttgacgga gatgagctgt 60
tttatgtgga cctggaaaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt agccagtttg 120
caggttttga ccctcaaggt gcactgagta acatagctgc agcgaaacac aacttggata 180
tcctgactaa acgctccaac tctaccccag ttatcaacgg taagtgtcca ccattctact 240
cc 242<210> 3
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*C
<400> 3
actaccaatc tcatggtccc tetggccagt acacccacga atttgatggg gacgagctgt tttatgtgga cctggggaag aaggagactg tctggcggct gcctatgttt ggtgaattca caagttttga cccgcaaggt gcactgagtg aaatagctaa agcaaaacaa accttggata tcatgattaa acgttccaac tttacccctg ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact cc
<210> 4
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*D
<400> 4
actaccaatc tcatggtccc tetggccagt acacccagga atttgatgga gacgagctgt tttatgtgga cctggggaag aaggagactg tctggaggct gcctatgttt agccagtttg caggttttga tccacagggt gcactgagtg aaatagctac agcaaaacaa aacttggata tcctgactaa acgctccaac tttacccctg ctatcaatgg taagtgtcca ccattctact cc
<210> 5
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*E
<400> 5
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acacccagga atttgacgaa gaegagctge tttatgtgga cctggagaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg caggttttca cattcaagtt gcactgagta acatagctac agcgaaacac aacttggatg tcatgactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact<210> 6
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*F
<400> 6
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt tcacccatga atttgatgga gacgagttgc tttatgtgga ccttgagaag aaggagactg tctggcggct gcctattttt ggtgaattaa caagttttga cccgcaaggt gcactgagta acatagctac agcgaaacac aacttggata tcctgactaa atgctccaat tgtaccccag ttatcaacgg taagtgtcca ccattctact cc
<210> 7
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*G
<400> 7
actaccaatc tcatggtccc tctagccagt acacccagga atttgatgga gacgaactgt tttatgtgga cctggagaag aaggagaccg tctggcggct gcctatgttt agccagtttg caggttttaa cattcaagat gcactgaata acatacctgc agcgaaacac aacttgggta tcctgactaa acgctccaac tttaccccag ttatcaacgg taagtgtcca ccattctact cc
<210> 8
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*H
<400> 8
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt acacccacga atttgatggg gacgagctgt tttatgtgga cctggggaag aaggagactg tctggcggct gcctatgttt ggtgaattcacaagttttga cccgcaaggt gcactgagtg aaatagctac agcgaaacaa aacttggata 180
tcatgattaa acgttccaac tttacccctg ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210> 9 <211> 242 <212〉 DNA <213> OLA-DQA2*I <400> 9
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acacccagga atttgacgaa gacgagctgc 60 tttatgtgga cctggagaag aaagagactg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg 120
caggttttca catccaagtt gcactgagta acatagctac agcgaaacac aacttggatg 180
tcaagactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210> 10
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*J
<400> 10
actaccaatc tcatggtccc tctagcgagt acacccagga atttgacgaa gacgagctgc 60 tttatgtgga cctggagaag aaagaggctg tctggcggct gcctatgttt ggccagtttg 120
caggttttca cattcaagtt gcactgagta acatagctac agcgaaacac aacttggatg 180
tcatgactaa atggtacaac tttaccccag ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210〉 11
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*K
<400> 11<image>image see original document page 18</image><212〉 DNA
<213〉 OLA-DQA2*N
<400〉 14
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt atatccactt atttgatgga gacgagcggt 60 tttatgtgga cctggagaag aaggagactg tctggcggct gcccatgtct ggtgaattaa 120
taagttttga cccacaaggt gcactgagta acgtagctgc atcgaaacac aacttggata 180
tcctgactaa acgctccaac tctaccccag ttatcaacgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210> 15
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2+0
<400> 15
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt acacccacga atttgatggg gacgagctgt 60 tttatgtgga cctggggaag aaggggactg tctggcggct gccaatgtct ggtgaattca120 caagttttga cccgcaaggt gcactgagtg aaatagctac agcgaaacaa aacttggata180 tcatgattaa acgttccaac tttacccctg ttatcaatgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 242
<210> 16
<211> 242
<212> DNA
<213> OLA-DQA2*P
<400> 16
actaccaatc tcatggtccc tctggccagt tcacccagga atttgacgga gatgagctgt 60 tttatgtgga cctggaaaag aaagagactg tctgtcggct gcctatgttt agccagtttg 120
caggttttga ccctcaaggt gcactgagta acatagctgc agcgaaacac aacttggata 180
tcctgactaa acgctccaac tctaccccag ttaccaacgg taagtgtcca ccattctact 240 cc 24权利要求
1. 一种检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的特异性扩增引物，其特征是第一组引物上游长度为24bp的核苷酸，下游长度为22bp的核苷酸，第二组引物上游长度为23bp的核苷酸，下游长度为24bp的核苷酸，包括用于扩增OLA-DQA2基因第2外显子的特异性引物，序列如下上游引物24bpDQA2-upCACATGTTACAGTGCAAAARCAGC；下游引物22bpDQA2-dnCCCTCYCACCAACGTTTCCCAG；上游引物23bpDQA2s-upACTACCAATCTCATGGTCCCTCT；下游引物24bpDQA2s-dnGGAGTAGAATGGTGGACACTTACC；其中R＝A或G，Y＝C或T。
2. 如权利要求1所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的特异性扩增引物，其特征是 所述的PCR-SSCP扩增引物的扩增条件为第一次第一组引物PCR反应条件预变性94"C2 min ，变性94'C30s ，退火 64°C30s，延伸72。C50s,共32个循环，最后72'C延伸5 min;第二次第二组引物PCR反应条件预变性94'C2 min ，变性94'C30s ，退火 67°C30s，延伸72。C30s，共32个循环，最后72。C延伸5 min。
3. 如权利要求1所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测试剂盒，其特征是组成成分用量及浓度为四种引物各为0.5tiL/10pmo1， dNTP为1.2pL/2.5mm， T叫 DNA聚合酶为0.2nL/2.5U^iL， 10xbuffer为2.0^L含Mg2+15pM，双纯水为14.6pL。SSCP检测试剂去离子水，10%过硫酸铵，变性缓冲液，TEMED，聚丙烯酰胺， OLA-DQA2*L的DNA标准样。
4. 如权利要求1所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测方法，其特征是藏绵羊易感等位基因和抗性较强等位基因的确定步骤为(1) 收集表型正常和患腐蹄病藏绵羊基因组DNA;(2) 用上述特异性引物DQA2-up和DQA2-dn扩增步骤(1)中的DNA特异性片 段；(3) 用上述特异性引物DQA2s-up和DQA2s-dn扩增步骤(2)中的的PCR产物；(4) 用步骤(3)中的的PCR产物进行SSCP检测；(5) 克隆、测序步骤(4)中产生的各等位基因序列；(6) 根据(4)的基因型判别结果，结合表型观测资料，确定藏绵羊腐蹄病易感等位基因和抗性等位基因； (7)确定藏绵羊腐蹄病易感等位基因为OLA-DQA2*H，抗性等位基因为OLA-DQA2*L。
5. 如权利要求1所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测方法，其特征在于，具体的 检测步骤如下.-(1) 样品采集采集表型正常和患腐啼病的藏绵羊，颈静脉采血10ml， ACD抗凝，-20 'C冻存；(2) 基因组DNA的提取用常规的酚-氯仿抽提法从冻存血样中提取基因组DNA;(3) 聚合酶链式反应20^L的反应体系，其成分用量及浓度为四种引物各为0.5^171 Opmol， dNTP为 1.2pL/2.5mm， TaqDNA聚合酶为0.2pL/2.5U4iL， 10xbuffer为2.0pL含Mg2+15nM，模 板DNA为lpL/50ng，双纯水为14.6pL;第一次第一组引物PCR反应条件预变性94。C2min ，变性94。C30s ，退火64。C30s， 延伸72。C50s，共32个循环,最后72'C延伸5 min;第二次第二组引物PCR反应条件预变性94'C2min ，变性94。C30s ，退火67。C30s， 延伸72'C30s，共32个循环，最后72。C延伸5min;DQA2-up和DQA2-dn的扩增产物大小为828bp， DQA2s-up和DQA2s-dn以DQA2-up 和DQA2-dn的扩增产物为模板的扩增产物大小为242bp。(4) PCR产物的SSCP检测 取2^il的PCR产物加入8nI的上样变性缓冲液，包括98。/。去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯青、10mmol/LEDTApH8.0 ， 98 。C变性10min ，立即冰浴10min; 12% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶，140V电压条件下，4'C电泳19h ，银染法显色后拍照；(5) 结果判断在藏绵羊DQA2基因第2外显子上共发现16个(OLA-DQA2*A-OLA-DQA2*P) 等位基因，藏绵羊腐蹄病易感等位基因为0LA-DQA2*H，抗性等位基因为 0LA-DQA2*L。
6. 如权利要求1所述的检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因检测试剂盒的使用方法，其特征是具体的步骤为(1)试剂盒中各组分与待检测基因组DNAl^L/50ng混合，进行PCR扩增； 所述的PCR-SSCP扩增引物的扩增条件为.-第一次第一组引物PCR反应条件预变性94'C2 min ，变性94'C30s ，退火64'C30s，延伸72'C50s，共32个循环，最后72。C延伸5 min;第二次第二组引物PCR反应条件预变性94。C2 min ，变性94i:30s ，退火67。C30s，延伸72。C30s，共32个循环,最后72'C延伸5 min。(2) 用步骤(1)中扩增的PCR产物和OLA-DQA2*L标准样与试剂盒中SCCP检测试剂各组分混合进行SSCP检测；(3) 步骤(2)中检测到的带型与试剂盒中OLA-DQA2*L的DNA标准样带型一致的样品为携带腐蹄病抗性等位基因的个体。
全文摘要
本发明主要涉及动物生物技术领域中的绵羊分子标记辅助育种技术，具体涉及到藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的检测。一种用于检测藏绵羊腐蹄病抗性等位基因的特异性扩增引物，其特征是第一组引物上游长度为24bp的核苷酸，下游长度为22bp的核苷酸，第二组引物上游长度为23bp的核苷酸，下游长度为24bp的核苷酸，上游引物24bpDQA2-upCACATGTTACAGTGCAAAARCAGC；下游引物22bpDQA2-dnCCCTCYCACCAACGTTTCCCAG；上游引物23bpDQA2s-upACTACCAATCTCATGGTCCCTCT；下游引物24bpDQA2s-dnGGAGTAGAATGGTGGACACTTACC。本发明对藏绵羊腐蹄病的分子标记选种具有快速、敏感性高、成本低等特点。
文档编号C12N15/11GK101532061SQ20091013486
公开日2009年9月16日 申请日期2009年4月10日 优先权日2009年4月10日
发明者秀 刘, 王继卿, 罗玉柱, 江 胡, 马小军 申请人:甘肃农业大学