一种利用细胞工厂制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗及其利用 细胞工厂制备所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的方法。
【背景技术】
[0002] 猪繁殖与呼吸综合征（PRRS，又称猪蓝耳病），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)引起的一种母猪繁殖障碍和各日龄猪呼吸疾病为特征的高度接触性传染病。蓝耳 病是目前影响世界养猪业最严重的疾病之一，自其被发现以来传播迅速，危害性大，仔猪发 病率可达100 %，死亡率可达50 %以上，母猪流产率可达30 %以上，育肥猪也可发病死亡。
[0003] 目前普遍使用的是用转瓶培养细胞的传统工艺，转瓶培养具有结构简单，投资少， 技术成熟，重复性好，容易扩大等优点；但也有其缺点：劳动强度大，占地空间大，单位体积 提供的细胞生长的面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件限制等缺点。
[0004] 因此，本领域需要新的猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗及其制备方法和生产工艺。
【发明内容】
[0005] 在本发明中，发明人提供了一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗及其利用细胞工厂 制备所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗的方法。
[0006] 在第一方面，本发明提供了一种猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗每20ml成品包括：
[0007] 白油佐剂：12~14ml
[0008] 病毒培养液：6~8ml
[0009] 其中每ml猪繁殖与呼吸综合征病毒含量不低于106' 5TCID50。
[0010] 在某些实施方案中，本发明的疫苗可以为油乳剂灭活疫苗
[0011] 在第二方面，本发明提供了制备第一方面所述的疫苗的方法，所述方法包括：
[0012] (a)复苏 MARC-145 细胞；
[0013] (b)将所述MARC-145细胞接种至细胞工厂进行单层培养；
[0014] (c)将猪繁殖与呼吸综合征病毒接种于所培养的MARC-145细胞；和
[0015] (d)收获接种后的MARC-145细胞；和
[0016] (e)将所收获的MARC-145细胞培养液灭活，加入适量白油佐剂乳化获得所述猪繁 殖与呼吸综合征灭活疫苗。
[0017] 在某些实施方案中，本发明的制备疫苗的方法可以包括：
[0018] (1)将MARC-145细胞悬浮于含5~8%牛血清的DMEM培养基中，之后再培养瓶中 培养至90%以上的细胞贴壁；
[0019] (2)将步骤（1)中所培养的细胞用胰酶消化后接种至细胞工厂中，每层 150ml-250ml细胞悬液，盖好进液口盖，放37°C温室中静止培养；
[0020] (3)细胞培养48~72小时后，弃去细胞工厂内培养基，接种所述的适量的猪繁殖 与呼吸综合征病毒，吸附1小时，吸附后加入维持液，将维持液分匀后放入37°C温室中继续 培养；和
[0021] (4)培养至70%及以上的细胞出现致细胞病变效应时收获所述MARC-145细胞，通 过反复冻融细胞2次，将所述MARC-145细胞从细胞工厂壁上摇下过滤去除细胞碎片后，收 集到无菌容器内；和
[0022] (5)加入适量的甲醛溶液，混匀，37°C灭活至少18个小时，获得所述猪繁殖与呼吸 综合征病毒抗原，在抗原中加入适量白油，经过乳化获得灭活疫苗。
[0023] 在某些实施方案中，所述猪繁殖与呼吸综合征病毒可以是NVDC-JXA1株。
[0024] 在某些实施方案中，将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒接种于所述MARC-145细胞 的方法可以是将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的工作毒种接种于所述细胞工厂中培养的 单层MARC-145细胞。
[0025] 在某些实施方案中，将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒接种于所述MARC-145细胞 的方法可以是将所述猪繁殖与呼吸综合征病毒的工作毒种接种于MARC-145细胞悬液中后 分装在所述细胞工厂中。
[0026] 在某些实施方案中，可以按3%~5%接种所述猪繁殖与呼吸综合征病毒。
[0027] 在某些实施方案中，灭活时可以按终浓度为0. 1%~0.2%比例加入所述甲醛溶 液。
[0028] 在某些实施方案中，所述方法还可以包括将所述猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗以 冷冻水循环的方式进行冷却，并于4°C保存。
[0029] 本发明的有益效果：
[0030] 本发明采用NVDC-JXA1病毒株作为接种病毒株，并采用细胞工厂制备的猪繁殖与 呼吸综合症灭活疫苗，所获得的疫苗质量优良，免疫效力高，免疫效果稳定。
【具体实施方式】
[0031] 下列实施例皆在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背 离本发明的精神及原则的前提下，对本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将 本发明的待批权利要求范围之内。
[0032] 本发明实施例中，选用美国CORNING公司出品的Cell STACK 10层（636CM2/层） 或更多层数细胞工厂，采用同步感染法制备猪繁殖与呼吸综合症灭活疫苗；MARC-145细胞 和猪繁殖与呼吸综合征病毒株NVDC-JXA1，由北京市兽医生物药品厂质管部保管和供应。
[0033] 实施例1 :
[0034] 制备工艺主要步骤如下：
[0035] 1)复苏细胞
[0036] 从液氮罐中取出细胞管置37°C水浴中融化，将细胞移入装有10ml无血清培养基 的离心管中，1，OOOrpm/分，离心5分钟。用含8 %牛血清的DMEM培养基悬浮细胞，接种T175 培养瓶中培养，37°C培养，当长成良好单层时，用0. 25%胰酶消化细胞，按1:4传代培养。
[0037] 2)细胞单层培养
[0038] 将以扩大并长成良好单层的细胞，用0.25%胰酶消化，接种到细胞工厂中，每层 150ml-250ml细胞悬液，盖好进液口盖，放37°C温室中静止培养。
[0039] 3)接种及更换维持液
[0040] 细胞培养48小时后，弃去细胞工厂内培养基，按4.0%接种NVDC-JXA1病毒株，吸 附1小时（每层分匀），吸附后加入维持液，将维持液分匀，拧紧口帽，放入37°C温室中继续 培养
[0041] 4)培养与观察
[0042] 接毒后24h后每天观察一次，待70%以上细胞出现CPE时，即可收获。
[0043] 5)收获
[0044] 接毒后随时观察病变情况，培养至70%及以上的细胞出现致细胞病变效应（CPE) 时，即可收获。反复冻融细胞2次，将细胞从细胞工厂壁上摇下，经180目絹布过滤去除细 胞碎片，收集到无菌容器内，取样，做无菌检验，将收获的抗原放置于_20°C冷库中保存。 [0045] 6)灭活
[0046] 将已解冻好的抗原通过管道进入已灭菌的灭活罐中，混合完毕后搅拌10分钟，通 过取样阀取灭前样20ml，检验和计算病毒液含量，按终浓度为0. 2 %比例加入一定量的甲 醛溶液，并以120转/分搅拌10分钟，混匀，37°C (待罐内温度升至37°C开始计时）灭活 18个小时，灭活结束后取样20ml，并做好记录放4°C冰箱保存待检。取样后加入适量吐温， 搅拌10分钟，通过冷冻水循环的方式对抗原进行冷却。通过使用压缩空气把灭活罐内抗原 打到灭菌白桶内放4°C库保存。
[0047] 7)乳化
[0048] 取油相（MARC52) 2份放入胶体磨中，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1 份，加完后再以10, 〇〇〇r/min，搅拌3-5分钟，在终止搅拌前加入终浓度为0. 01 %硫柳汞溶 液。
[0049] 8)分装
[0050] 将乳化好的疫苗打入灌装间，疫苗瓶、胶塞分别灭菌后移入灌装车间，按产品规格 定量灌装、加塞、乳盖。
[0051] 9)贴标保存
[0052] 将灌装好的疫苗瓶贴上标签，连同说明书装箱。抽取样品，挂待检牌入成品库待检 区。
[0053] 10)检验结果：
[0054]
[0055] 实施例2 :
[0056] 制备工艺主要步骤如下：
[0057] 1)复苏细胞
[0058] 本生产用细胞为MARC-145细胞，由北京市兽医生物药品厂质管部保管和供应。
[0059] 从液氮罐中取出细胞管置37°C水浴中融化，将细胞移入装有10ml无血清培养基 的离心管中，1，000印111/分，离心5分钟。用含7%牛血清的01^11培养基悬浮细胞，接种1'175 培养瓶中培养，37°C培养，当长成良好单层时，用0. 25%胰酶消化细胞，按1:4传代培养。
[0060] 2)细胞单层培养
[0061] 将以扩大并长成良好单层的细胞，用0.25%胰酶消化，接种到细胞工厂中，每层 150ml-250ml细胞悬液，盖好进液口盖，放37°C温室中静止培养。
[0062] 3)接种及更换维持液：
[0063] 细胞培养48小时后，弃去细胞工厂内培养基，按4.