基于lps糖基转移酶突变体的改进的抗百日咳博德特氏菌疫苗的制作方法

专利名称：：基于lps糖基转移酶突变体的改进的抗百日咳博德特氏菌疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及改进的百日咳疫苗，其包含具有改变的LPS分子的百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)的突变体和/或可获自这些突变体的LPS分子。这些突变体和/或所述可获得的LPS分子可进一步用作佐剂。
背景技术：
：LPS是一种位于革兰氏阴性细菌外膜的外小叶中的两性分子。LPS具有内毒素活性和佐剂活性。两种性质都基于其被宿主TLR4/MD-2受体复合物识别(在P^sson-McDermott和O'Neill，2004；0’Neill，2006中综述)。LPS由三个不同的结构域组成月旨质A、核和菌体抗原(0抗原)。脂质A起疏水性膜锚着点的作用并形成所述分子的生物活性成分(Takada和Kotani，1989)。核区由复合寡糖组成，与菌体抗原相比，其仅仅显示出有限的结构可变性。在一些细菌例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)中，核心寡糖(核心OS)可以被分成内核和外核。外核主要由吡喃糖苷己糖组成，例如D-葡萄糖、D-半乳糖和D-葡糖胺，而内核主要由辛酮糖酸和吡喃庚糖组成。在大多数革兰氏阴性菌中，核结构域通过特殊的糖——2-酮基-3-脱氧辛酮糖酸(Kdo)——连接到脂质A结构域(Raetz和Whitfield，2002)。菌体抗原包含LPS的最可变的部分并且赋予细菌血清型特异性。它由具有一至八个糖的重复糖亚基组成。每一0-链可以包含多达50个的这些亚基。菌体抗原与细菌免疫逃逸有关，尤其是与逃避血清补体介导的溶菌作用有关(Raetz和Whitfield，2002)。与支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchis印tica)和副百日咳博德特氏菌(Bordetellaparapertussis)的LPS不同，百日咳博德特氏菌的LPS从不包含菌体抗原结构域(P印pler，1984;DiFabioetal.，1992)。因此，百日咳博德特氏菌LPS通常被称为脂寡糖。百日咳博德特氏菌产生两个主要的LPS形式，带A和带BLPS(Peppier,1984).带BLPS由脂质A和核心寡糖组成，该核心寡糖由9个糖组成(Caroffetal.，2000)。向带BLPS添加末端三糖，形成称为带A的LPS，该末端三糖由N-乙酰基氨基葡萄糖、2，3-二乙酰氨基_2，3-双脱氧-甘露糖醛酸和2-乙酰氨基-4-N-甲基-2，4-双脱氧-岩藻糖组成。在大肠杆菌(Escherichiacoli)和鼠伤寒肠炎沙门菌血清变型(SalmonellaentericaserovarTyphimurium)OS^^^j^SSMfi^^JgmhD>waaQ和WaaA操纵子的三个操纵子组成。gmhD操纵子由四个基因组成，即gmhD和waaFCL，它们参与内核的合成(Schnaitman和Klena，1993)。gmhD、waaF和waaC基因编码参与庚糖I和II的生物合成并将它们转运至Kdo2-脂质A的蛋白质(Schnaitman和Klena，1993)，而waaL基因产物是参与菌体抗原连接的连接酶(MacLachlanetal.，1991)。waaQ操纵子是该三个操纵子中最大的并且编码参与外核的生物合成和核心OS的修饰/装饰的蛋白质。waaQ操纵子中存在的基因的数目和类型在每个链中有所不同，这解释了在核组成方面的链特异性差异(Heinrichsetal.，1998)。waaA操纵子通常仅编码一种蛋白质，KdtA。另外的非LPS-相关开放阅读框(ORF)仅在大肠杆菌K-12中存在(Raetz和Whitfield，2002)。肠杆菌科的kdtA基因编码双功能Kdo转移酶，其将两个Kdo残基添加在Kdo2-脂质A生物合成中(Clementz和Raetz,1991)。尽管博德特氏菌和大肠杆菌核心OS显示出一定的相似性，但是残基的确切组成和结构显示出显著的区别。例如，博德特氏菌核心OS仅仅包含一个Kdo残基，而不是在大多数其它革兰氏阴性菌(包括大肠杆菌)中发现的两个或三个残基。最近，这被证明是由于博德特氏菌KdtA作为单功能Kdo转移酶而不是双功能Kdo转移酶而发挥功能(Isobeetal.，1999)。负责博德特氏菌核心OS的剩余部分的合成的酶目前是未知的并且有待进一步鉴别。尽管它的脂质A部分通常被视为通过激活TLR4/MD-2受体复合物的LPS生物活性的主要决定因素，但是该寡糖区还可以在它与抗原呈递细胞(APC)的相互作用中起重要作用。与这类LPS识别有关的受体包括补体受体CR3和清道夫受体SR-A(vanAmersfoortetal.，2003；Pluddemannetal.，2006)。已经使用几种百日咳博德特氏菌疫苗。在20世纪40年代和50年代全细胞百日咳(wP)疫苗的引入以及后来在二十世纪80年代和90年代无细胞百日咳(aP)疫苗的引入，导致百日咳发生率的逐渐下降并将该疾病的发病率和死亡率降低到低水平。尽管高的免疫接种覆盖度，百日咳疾病仍是地方性的并保持每隔2至5年显示出具有发生率峰值的循环型态。在最近的二十年期间，若干国家，包括荷兰在内，经历了报告的百日咳案例数增加。令人感兴趣的是，在一些地区，也已观察到年龄分布的变化。尽管在免疫接种之前的时代和早期疫苗时代，百日咳病例主要在儿童中得到报道，但最近几年中，成人和青少年已经占了逐渐增加的比例。已经为所报道的百日咳的再出现提出了若干理由，包括⑴流行百日咳博德特氏菌的遗传变化，其降低疫苗功效，(2)百日咳疫苗效力降低，(3)免疫力渐弱，(4)百日咳病例的报道增加，和(5)百日咳疾病诊断的改进。因此，对于不表现出现有疫苗的全部缺点的新的抗百日咳博德特氏菌疫苗仍存在需求。发明描述本发明基于这样的假设具有改变的寡糖链的百日咳博德特氏菌突变体可能在它们与树突细胞(DC)的相互作用方面受到影响。想象得到，特异性靶向抗原呈递细胞(APC)诸如DC可以影响针对全细胞百日咳疫苗的免疫反应结果。作为通过该途径改进全细胞疫苗的第一步，我们现在已经识别出在百日咳博德特氏菌中参与LPS寡糖生物合成的基因簇。特别是在该簇内的两个基因，当灭活或过表达时，所产生的突变体具有与DC相互作用并激活DC的改善的潜能。^lt在第一方面，本发明提供两种多肽。第一种多肽是多糖脱乙酰基酶并具有与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少50%相同性的氨基酸序列。第二种多肽是糖基转移酶并具有与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少50%相同性的氨基酸序列。多糖脱乙酰基酶和糖基转移酶多肽各自的活性优选通过分别过表达/灭活各自在如本文随后定义的百日咳博德特氏菌中的编码基因和分析该可获得的LPS进行评价。当转化的百日咳博德特氏菌产生的LPS包含至少可检测量的如随后在本文定义的本发明的LPS时，多糖脱乙酰基酶、糖基转移酶多肽分别将被认为具有活性并且是有功能的。可检测量的LPS如实施例所描述优选在用热酚/水萃取(Westphal和Jarm，1965)、通过温和水解(Holst2000)和通过负离子模式的ESI-MS(电喷雾电离质谱)分析之后是可检测的。根据甚至更优选的实施方式，所述多肽与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的相同性，甚至更优选至少90%、92%、95%、97%、98%或99%的相同性。在最优选的实施方式中，多糖脱乙酰基酶具有SEQIDNO:1。该多糖脱乙酰基酶源于百日咳博德特氏菌。编码SEQIDNO1的氨基酸序列的核酸序列在SEQIDNO3中给出。根据另一个甚至更优选的实施方式，所述多肽与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的相同性，甚至更优选至少90%、92%、95%、97%、98%或99%的相同性。在优选的实施方式中，糖基转移酶具有SEQIDNO2。该糖基转移酶源于百日咳博德特氏菌。编码SEQIDNO:2的氨基酸序列的核酸序列在SEQIDNO4中给出。相同性百分比被计算为对比序列之间的相同氨基酸残基的数目除以减去全部空位长度的对比序列长度。使用采用默认设置的DNAman4.0最佳对比程序，进行多序列比对。通常在由它们的SEQIDNO标识的序列或其部分之间进行比对。优选地，使用由它们的SEQIDNO标识的序列进行比对。本领域技术人员将理解，本发明多肽可以从百日咳博德特氏菌之外的其它生物体获得，只要它们具有所要求的活性和相同性。在优选的实施方式中，如上文标识的每一多肽从博德特菌获得，诸如百日咳博德特氏菌(B.pertussis)、支气管败血症博德特氏菌(B.bronchiseptica)、副百日咳博德特氏菌(B.parapertussis)。最优选地，如上文标识的每一多肽从百日咳博德特氏菌获得。一个单一的百日咳博德特氏菌菌株或若干不同的百日咳博德特氏菌菌株可能具有若干同源的本发明的多肽。根据另一个优选的实施方式，本发明的多肽是如前定义的多肽序列的任何一个的变体。变体多肽可以是所述多肽的非天然存在的形式。可通过遗传工程化途径使得多肽变体与分离自其天然来源的多肽不同。变体可通过从SEQIDNO:1或从SEQIDNO:2的氨基酸序列或从编码SEQIDNO:1的氨基酸序列的核酸序列(其是SEQIDNO3)或从编码SEQIDNO:2的氨基酸序列的核酸序列(其是SEQIDNO4)开始的定点诱变加以制备。优选地，多肽变体包含不改变所编码的多肽的生物学功能的突变。多糖脱乙酰基酶或糖基转移酶的生物学功能或活性已经在本文定义。在本发明的另一个方面，分别提供了如先前定义的多糖脱乙酰基酶和糖基转移酶，都用于制备药物。优选地，所述药物是如在本文随后定义的疫苗或佐剂。核酸序列在本发明的第二方面，提供了两个核酸序列。第一个编码多糖脱乙酰基酶，所述多糖脱乙酰基酶具有与SEQIDNO1的氨基酸序列具有至少50%的相同性的氨基酸序列，优选具有氨基酸序列SEQID而1，和/或源于博德特氏菌，优选百日咳博德特氏菌。第一个核酸序列优选是与SEQIDNO:3的核酸序列具有至少50%相同性的核酸序列。优选地，相同性是至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%、甚至更优选至少98%并且甚至更优选至少99%。最优选地，该核酸序列具有SEQIDNO3的核酸序列。SEQIDNO3相应于NP_8809668。第二个核酸序列编码糖基转移酶，所述糖基转移酶具有与SEQIDNO2的氨基酸序列具有至少50%的相同性的氨基酸序列，优选具有氨基酸序列SEQID而2，和/或源于博德特氏菌，优选百日咳博德特氏菌。第二核酸序列优选是与SEQIDNO:4的核酸序列具有至少50%相同性的核酸序列。优选地，相同性是至少55%、更优选至少60%、更优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%、甚至更优选至少98%并且甚至更优选至少99%。最优选地，该核酸序列具有SEQIDNO4的核酸序列。SEQIDNO:4相应于NP_8809669。相同性百分比通过计算在该序列中相同核苷酸的数目除以减去任何空位长度的总核苷酸长度的比率加以确定。使用DNAman4.0版本，利用OptimalAlignment(FullAlignment)程序，进行DNA多序列比对。显示出50%或更高的相同性水平的相关DNA序列的最小长度应该为40个核苷酸或更长。通常在由它们的SEQIDNO标识的序列或其部分之间进行比对。优选地，使用由它们的SEQIDNO标识的序列进行比对。根据另一个优选的实施方式，本发明的核酸序列是如上文定义的核酸序列的任何一个的变体。核酸序列变体可用于制备如前定义的多肽变体。核酸变体可以是如上文定义的核酸序列的任何一个的片段。核酸变体也可以是由于遗传密码简并性而不同于SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的核酸序列。核酸变体还可以是SEQIDNO:3或SEQIDNO4.的等位基因变体。等位基因变体表示占同一个染色体基因座的基因的两个或更多个可选的形式的任何一个。优选的核酸变体是核酸序列，其包含沉默突变(一个或多个)。可选地或组合地，核酸变体还可以通过引入核苷酸置换而获得，该核苷酸置换不产生由该核酸序列编码的多肽的另一种氨基酸序列，但是其与拟用于产生本发明多肽的宿主生物体的密码子选择相对应。根据优选的实施方式，核酸变体编码如在本文先前定义的仍表现出它的生物学功能的多肽。更优选地，核酸序列变体编码分别表现出多糖脱乙酰基酶或糖基转移酶活性的多肽。编码这样的多肽的核酸序列可分离自任何微生物。所有这些变体可以使用本领域技术人员已知的技术而获得，诸如通过在低至中至高杂交条件之下与核酸序列SEQIDNO:3或SEQIDNO:4或可用于设计探针的它们的变体杂交(DNA印迹法)进行文库筛选。低至中度至高度严格条件是指在42°C在5XSSPE、0.3%SDS、200pg/ml剪切和变性鲑精DNA，以及对于低至中度至高度严格性分别为25%、35%或50%甲酰胺中进行预杂交和杂交。接着，使用2XSSC、0.2%SDS和对于低中度至高度严格为55°C、65°C或75°C，洗涤杂交反应三次，每次30分钟。如在本文提供的序列信息不应该被如此狭窄地解释为要求包含错误识别的碱基。本领域技术人员能够识别这样的错误识别的碱基并知道如何修正这样的错误。在本发明的另一个方面，提供了如先前定义的分别编码多糖脱乙酰基酶和糖基转移酶的核酸，两种核酸都用于制备药物。优选地，所述药物是如在本文随后定义的疫苗或佐剂。核酸构津体在进一步的方面，本发明涉及核酸构建体，其包含在前面部分定义的核酸序列的任一个，所述核酸序列编码表现出以下活性的多肽-表现出多糖活性并具有与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少50%相同性的氨基酸序列，或-表现出糖基转移酶活性并具有与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少50%相同性的氨基酸序列。任选地，存在于该核酸构建体的核酸可操作地连接于一个或多个调控序列，其指导多肽在适当的表达宿主中的产生。可操作地连接在本文被定义为这样的结构，其中相对于编码本发明的多肽的核酸序列，调控序列被适当地放置的位置使得该调控序列指导本发明的多肽的产生。表达将被理解为包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。核酸构建体被定义为核酸分子，其分离自天然存在的基因或其已经被修饰以包含核酸片段，该核酸片段以非天然存在的方式结合或并列。调控序列在本文被定义来包括对于多肽表达必需或有利的所有成分。至少，调控序列包括启动子和转录和翻译终止信号。表汰载体本发明进一步涉及表达载体，其包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码多肽的核酸序列，所述多肽表现出多糖脱乙酰基酶活性并具有与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少50%相同性的氨基酸序列，如前文部分所定义。优选地，表达载体包含所述核酸序列，其被可操作地连接于一个或多个调控序列，所述调控序列指导所编码的多肽在适当的表达宿主中的产生。至少，调控序列包括启动子和转录和翻译终止信号。表达载体可被视为重组表达载体。表达载体可以是任何载体(例如原生质载体、病毒载体)，其可以方便地进行重组DNA步骤并可以引起编码所述多肽的核酸表达。取决于其中该表达载体将被引入的宿主的性质以及本发明的核酸序列的起源，本领域技术人员将知道如何选择最适合的表达载体和调控序列。最优选的宿主细胞在称为宿主细胞的部分中给出。在本发明中，当被引入宿主细胞时，表达载体将导致细胞内的存在于所述表达载体中的核酸序列的表达水平增加、和/或细胞内由存在于所述表达载体中的核酸编码的多肽的表达水平增加和/或细胞内由存在于所述表达载体中的核酸序列编码的多肽的活性水平增加。在这方面，所述增加通过与不包含所述表达载体的宿主细胞相比和/或与不包含与SEQIDNO:1具有最少50%相同性的内源性多肽的宿主细胞相比进行评价。在本发明的另一个方面，提供了如先前定义的表达载体，其用于制备药物。优选地，所述药物是如在本文随后定义的疫苗或佐剂。灭活载体(inactivationvector)本发明进一步涉及灭活载体，其包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码多肽的核酸序列，所述多肽表现出糖基转移酶活性并具有与SEQIDN02的氨基酸序列具有至少50%相同性的氨基酸序列，如前文部分所定义。灭活载体被设计成降低或灭活与SEQIDNO2的氨基酸序列具有至少50%相同性的核酸序列在给定宿主中的表达。灭活载体可被视为重组表达载体。灭活载体可以是任何载体(例如质粒、病毒)，其可以方便地进行重组DNA步骤并可以引起如上文定义的核酸序列表达的灭活。取决于该灭活载体将被引入其中的宿主的性质以及本发明的核酸序列的起源，本领域技术人员将知道如何选择最适合的灭活载体。最优选的宿主细胞在称为宿主细胞的部分中给出。在本发明中，当被引入宿主细胞时，灭活载体将导致细胞内的存在于所述表达载体中的核酸序列的表达水平降低(或下降)、和/或由存在于所述表达载体中的核酸序列编码的多肽的表达水平降低和/或由存在于所述表达载体内的核酸序列编码的多肽的活性水平降低。在这方面，所述降低优选通过与不包含所述灭活载体的宿主细胞相比进行评价。表现出糖基转移酶活性并具有与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少50%相同性的氨基酸序列的多肽表达水平的降低和/或它的活性水平的下降可通过本领域已知的传统方法实现，诸如通过灭活或下调编码所述糖基转移酶的内源性核酸序列在所述宿主中的表达。该灭活或下调可通过在编码所述多肽的核酸序列中一个或多个核苷酸的缺失而实现。在另一个实施方案中，本发明涉及宿主，优选在其编码所述糖基转移酶的核酸序列中具有突变的博德特氏菌。优选地，为构建具有灭活的编码糖基转移酶的核酸序列的宿主，可制备出置换或灭活载体并接着通过转化被弓丨入宿主。本领域技术人员将知道如何构建这样的载体。可选地或与编码所述糖基转移酶的内源性核酸的灭活相联合，可以通过将编码所述糖基转移酶的核酸序列融合至适于在所选择的生物体中低水平表达蛋白质的弱启动子以降低编码所述糖基转移酶的核酸序列的表达。可选地或与编码内源性糖基转移酶的内源性核酸的灭活相联合，可以通过将编码所述糖基转移酶的核酸序列融合至适于在所选择的生物体中以可诱导水平表达蛋白质的诱导型启动子从而使之成为诱导型的。可选地或与前文定义的优选的实施方式相联合，编码内源性糖基转移酶的核酸序列的灭活优选通过使用自杀载体实现。更优选地，自杀载体是PSS1129(Stibitzetal,1994)。在本发明的另一个方面，提供了如先前定义的灭活载体，其用于制备药物。优选地，所述药物是如在本文随后定义的疫苗或佐剂。宿主细胞在进一步的方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明的表达载体和/或本发明的灭活载体，两种都如前文部分所定义。宿主细胞的选择在相当程度上取决于本发明的核酸序列的来源。取决于宿主细胞的性质，本领域技术人员将知道如何用本发明的构建体或载体转化它。宿主细胞可以是任何细菌微生物细胞、原核细胞或真核细胞，其适于本发明的LPS的表达。在优选的实施方式中，宿主细胞是如在本文先前提到的博德特氏菌。最优选地，博德特氏菌是百日咳博德特氏菌。用于转化博德特氏菌属的适当方法可包括这样的方法，其包括以本领域技术人员已知的方式接合。用于博德特氏菌属的适当的转化方法被描述于Stibitzetal，1994。根据第一个优选的实施方式，由此获得的宿主细胞内的存在于表达载体中的核酸序列的表达水平增加、和/或所述细胞内的由存在于所述表达载体中的核酸编码的多肽的表达水平增加和/或所述细胞内的由存在于所述表达载体中的核酸序列编码的多肽的活性水平增加。在该实施方式中，存在于所述表达构建体的核酸序列编码与SEQIDN0:1具有至少50%相同性的多肽。在这方面，所述增加通过都在相同条件之下培养和测定时与不包含所述表达载体的宿主细胞相比和/或与不包含与SEQIDNO:1具有最少50%相同性的内源性多肽的宿主细胞相比进行评价。“增加多肽的表达水平”在本文优选被定义为当两种类型的细胞(亲本细胞和转化的细胞)都在相同的条件下培养时，相比于转化宿主细胞从其来源的亲本宿主细胞将产生的多肽，转化宿主细胞产生更多的如先前定义的多肽。优选地，当两种类型的细胞(亲本细胞和转化的细胞)都在相同的条件下培养时，相比于转化宿主细胞从其来源的亲本宿主细胞将产生的，本发明的宿主细胞多产生至少3%、6%、10%或15%的与SEQIDNO:1具有至少50%相同性的本发明的多肽。比亲本细胞多产生至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或150%的所述多肽的宿主也是优选的。根据另一个优选的实施方式，将本发明的宿主细胞的该多肽的产生水平与作为对照的B213百日咳博德特氏菌的产生水平(Kasugaetall953，也参见表1)相比较。根据甚至更优选的实施方式，当本发明的宿主细胞是百日咳博德特氏菌时，将本发明的宿主细胞的多肽的产生水平与作为对照如上文定义的B213菌株的产生水平相比较。多肽的产生水平的评价可以通过进行Northern印迹或阵列分析在mRNA水平进行和/或通过进行蛋白质印迹在多肽水平进行。所有这些方法都是本领域技术人员熟知的。“多肽活性增加”在本文被定义为采用特异于所述活性的测定，相比于转化的宿主细胞从其来源的亲本宿主细胞所表现出的活性，表现出更高的多糖脱乙酰基酶活性。优选地，所述测定是在多肽部分中提到的测定。优选地，如采用特异于所述活性的测定一一其优选是在多肽部分中提到的测定——所分析，相比于转化的宿主细胞从其来源的亲本宿主细胞所表现出来的活性，本发明的宿主细胞表现出高至少3%、6%、10%或15%的多糖脱乙酰基酶活性。比亲本细胞表现出高至少20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%或150%的所述活性的宿主也是优选的。根据另一个优选的实施方式，将本发明的宿主细胞的多糖活性水平与作为对照的如之前定义的B213百日咳博德特氏菌的相应活性相比较。根据更优选的实施方式，当本发明的宿主细胞是百日咳博德特氏菌时，将本发明的宿主细胞的多糖脱乙酰基酶活性水平与作为对照的如之前定义的B213菌株的相应活性相比较。多肽表达和/或活性增加可通过本领域知道的常规方法实现，例如通过将与天然情况下相比更多拷贝数的编码多糖脱乙酰基酶的核酸序列引入宿主一一无论其是在载体上还是在染色体中。可选地，编码所述多糖脱乙酰基酶的核酸序列可以通过将其融合于适于在所选择的生物体中高水平表达蛋白质的高度表达的启动子或强启动子或者两种方式的组合而进行过表达。取决于宿主细胞的性质，本领域技术人员将知道哪种强启动子是最适当的。优选地，当宿主细胞是百日咳博德特氏菌时，强启动子是载体PMMB67EH的tac启动子(MethodsforGeneralandMolecularBacteriology,EditorsP.Gerhardtetal.,AmericanSocietyforMicrobiology,WashingtonDC,1994,p.409-410)。可选地或与第一个优选的实施方式相联合，本发明提供第二个优选的实施方式，其中所述宿主细胞的编码与SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少50%相同性的多肽的核酸序列的表达水平降低、和/或所述多肽的表达水平降低和/或所述多肽的活性水平增加，优选通过利用如先前在本文定义的本发明的灭活载体而实现。在该实施方式中，存在于所述灭活载体中的核酸序列编码与SEQIDNO:2具有至少50%相同性的多肽。在这方面，所述降低通过当两者都在相同的条件下培养和/或测定时与不包含所述灭活载体的宿主细胞比较来进行评价。“降低多肽的表达水平”在本文优选被定义为当两种类型的细胞(亲本细胞和转化的细胞)都在相同的条件下培养时，相比于转化宿主细胞从其来源的亲本宿主细胞将产生的多肽，转化宿主细胞产生较少的如先前定义的多肽。优选地，当两种类型的细胞(亲本细胞和转化的细胞)都在相同的条件下培养时，相比于转化宿主细胞从其来源的亲本宿主细胞将产生的与SEQIDNO2具有至少50%相同性的本发明的多肽，本发明的宿主细胞少产生至少3%、6%、10%或15%的与SEQIDNO:2具有至少50%相同性的本发明的多肽。比亲本细胞少产生至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或150%的所述多肽的宿主也是优选的。根据另一个优选的实施方式，将本发明的宿主细胞的该多肽的产生水平与作为对照的如之前定义的B213的产生水平相比较。根据甚至更优选的实施方式，当本发明的宿主细胞是百日咳博德特氏菌时，将本发明的宿主细胞的多肽的产生水平与作为对照如之前定义的B213菌株的产生水平相比较。多肽的产生水平的评价可以通过进行Northern印迹或阵列分析在mRNA水平进行和/或通过进行蛋白质印迹在多肽水平进行。所有这些方法都是本领域技术人员熟知的。“多肽活性增加”在本文被定义为采用特异于所述活性的测定，相比于转化的宿主细胞从其来源的亲本宿主细胞所表现出的活性，表现出较低的糖基转移酶活性。优选地，所述测定是在本文已经在多肽部分中描述的测定。优选地，如采用特异于所述活性的测定——其优选是在多肽部分中描述的测定——所分析，相比于转化的宿主细胞从其来源的亲本宿主细胞所表现出来的活性，本发明的宿主细胞表现出低至少3%、6%、10%或15%的多糖脱乙酰基酶活性。比亲本细胞表现出高至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或150%的所述活性的宿主也是优选的。根据另一个优选的实施方式，将本发明的宿主细胞的糖基转移酶活性水平与作为对照的如之前定义的B213的相应活性相比较。根据更优选的实施方式，当本发明的宿主细胞是百日咳博德特氏菌时，将本发明的宿主细胞的多糖脱乙酰基酶活性水平与作为对照的如之前定义的B213菌株的相应活性相比较。多肽表达和/或活性的降低可通过本领域知道的常规方法实现，例如通过将比天然情况下更多拷贝数的编码多糖脱乙酰基酶的核酸序列引入宿主——无论其是在载体上还是在染色体中。可选地，编码所述多糖脱乙酰基酶的核酸序列可以通过将其融合于适于在所选择的生物体中高水平表达蛋白质的高度表达的启动子或强启动子或者两种方式的组合而进行过表达。取决于宿主细胞的性质，本领域技术人员将知道哪种强启动子是最适当的。优选地，当宿主细胞是百日咳博德特氏菌时，强启动子是如之前定义的载体PMMB67EH的tac启动子。根据更优选的实施方式，宿主细胞不产生任何可检测量的本发明的糖基转移酶和/或不表现出任何可检测的糖基转移酶活性。优选地，宿主细胞不产生糖基转移酶或基本上不产生糖基转移酶。可选地，根据另一个更优选的实施方式，宿主细胞产生可诱导量的本发明的糖基转移酶和/或表现出诱导型的糖基转移酶活性。本发明的糖基转移酶表达水平的降低和/或其活性水平的降低可通过本领域已知的传统方法实现，诸如通过灭活或下调编码所述宿主的内源性糖基转移酶的核酸序列进行。该灭活或下调可通过在编码基因中缺失一个或多个核苷酸而实现。在另一个实施方案中，本发明涉及宿主，优选在其编码所述糖基转移酶的核酸序列中具有突变的百日咳博德特氏菌。优选地，为构建具有灭活的编码糖基转移酶的核酸序列的宿主，制备出置换或灭活载体并接着通过转化弓I入宿主。本领域技术人员将知道如何构建这样的载体。可选地或与所述内源性核酸的灭活相联合，编码所述糖基转移酶的核酸序列的表达可以通过将其融合至适于在所选择的生物体中低水平表达蛋白质的弱启动子加以降低。可以选地或与所述内源性核酸的灭活相联合，可以通过将编码所述糖基转移酶的核酸序列融合至适于在所选择的生物体中以可以诱导水平表达蛋白质的诱导型启动子使之成为诱导型表达。优选地，当宿主细胞是百日咳博德特氏菌时，诱寻型启动子是如之前定义的载体PMMB67EH的tac启动子。令人惊讶地，本发明的宿主细胞具有吸引人的性质，这使得将其用作全百日咳疫苗或用作佐剂非常吸引人其具有改进的与DC相互作用、接着诱导它们的成熟以及诱导促炎细胞因子产生的潜能。可选地或联合地，从这些细胞可获得的LPS也非常适于用作疫苗或用作如下文介绍的佐剂。因此，在本发明的另一个方面，提供了如先前定义的表达载体，其用作药物。优选地，所述药物是如在本文随后定义的疫苗或佐剂。通过所述宿主细胞可获得的LPS在进一步的方面，本发明涉及可获自如先前在本文定义的本发明的宿主细胞。优选地，宿主细胞是博德特氏菌，更优选百日咳博德特氏菌，甚至更优选过表达本发明的多糖脱乙酰基酶和/或灭活本发明的糖基转移酶的百日咳博德特氏菌。更优选地，本发明的LPS可获自如在实施例中制备的突变体2331。更优选地，当在用热酚/水萃取分离(Westphal和Jarm，1965)、通过温和水解进行0-脱酰作用(Hoist2000)以及通过负离子模式的ESI-MS分析之后进行分析时，本发明的LPS的ESI-MS谱的特征在于比来源于野生型百日咳博德特氏菌(称为野生型LPS)的LPS的相应ESI-MS谱产生更多的离子。优选地，野生型百日咳博德特氏菌是如之前定义的菌株B213。不意图受限于任何理论，这些额外的离子可至少部分地反映具有己糖胺残基的LPS的脂质A部分的1或4'磷酸基的取代增加。通常，野生型LPS的ESI-MS谱的特征在于产生7种离子(见表3)，而本发明的LPS的ESI-MS谱的特征在于产生超过7种离子、至少8种、至少10种、至少12种和更优选14种离子。可选地或与在前实施方式相联合，优选地，本发明的LPS的ESI-MS谱比野生型LPS的ESI-MS谱包括更多包含己糖胺的离子。通常，野生型LPS的ESI-MS谱的特征在于产生两种具有己糖胺的离子(见表3)，而本发明的LPS的ESI-MS谱的特征在于产生两种以上离子、至少4种、至少6种和更优选8种离子。药物组合物和医疗用途本发明进一步涉及药物组合物，其包含本发明的宿主细胞和/或本发明的LPS，两者都如先前在本文所定义。药物组合物可用作疫苗或用作佐剂。疫苗可以被用来免疫(引起免疫应答)或哺乳动物的疫苗接种。佐剂在本文被定义为包括任何物质或化合物，其当与抗原联合用于免疫哺乳动物优选人时刺激免疫系统，从而引起、增强或促进针对所述抗原的免疫应答，优选没有产生针对佐剂本身的特异性免疫应答。与在相同的条件下但是缺少佐剂时针对给定抗原产生的免疫应答相比，优选的佐剂针对所述给定抗原的免疫应答增强至少1.5、2、2.5、5、10或20倍。测定在一组动物或人中通过佐剂产生的针对给定抗原的免疫应答相对于相应的对照组的统计平均增强在本领域中是可获得的。佐剂优选能够增强针对两种不同抗原的免疫应答。本发明的佐剂通常是对于哺乳动物外源性的化合物，从而排除对于哺乳动物内源性的免疫刺激化合物，诸如白介素、干扰素及其他激素。在优选的实施方式，当药物组合物用作佐剂时，所述组合物进一步包含抗原。当所述组合物用作疫苗时，抗原存在于本发明的宿主细胞表面和/或存在于可获自这类细胞的LPS之内。在这种情况下，所述疫苗优选是针对本发明的宿主和/或针对能够表达相关LPS分子的任何宿主的疫苗。当所述组合物用作佐剂时，优选存在抗原。所述抗原优选是来自或通过下文进一步定义的细菌、病毒、真菌、寄生虫、癌细胞或过敏原产生的抗原。本发明的抗原和宿主细胞和/或通过这样的细胞可获得的LPS优选用于治疗和/或预防由所述细菌、病毒、真菌或寄生虫引起的传染病，或由癌细胞引起的肿瘤，或由所述过敏原引起的过敏症。在进一步优选的实施方式，包含本发明的宿主细胞和/或可由其获得的LPS以及任选的如在本文定义的抗原的药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。所述药物组合物可进一步包含药学上可接受的稳定剂、渗透剂、缓冲剂、分散剂等。所述药物组合物的优选形式取决于意图的施用模式和治疗应用。药物载体可以是任何相容的、无毒的物质，其适于将活性成分，即本发明的宿主细胞和/或可获得该宿主细胞的LPS以及任选的抗原输送到患者。用于鼻内输送的药学上可接受的载体的例子为水、缓冲盐溶液、甘油、聚山梨醇20、克列莫佛EL和辛酸/癸酸甘油酯的含水混合物，并且可以被缓冲以提供中性PH环境。用于肠道外输送的药学上可接受的载体的例子为无菌缓冲0.9%NaCl或5%葡萄糖，其任选补充有20%的白蛋白。用于肠道外施用的制剂必须是无菌的。所述活性成分的肠胃外施用途径与已知的方法一致，例如通过皮下、静脉内、腹膜内、肌内、动脉内或损伤内途径进行的注射或输注。本发明的组合物优选通过弹丸注射加以施用。用于肌内注射的典型药物组合物将可制备成包含例如I-IOml的磷酸盐缓冲盐水和1至100μg、优选15-45μg的抗原和1至100μg、优选15-45μg的本发明的宿主细胞和/或LPS。对于经口施用，活性成分可以以液体剂型诸如酏剂、糖浆剂和悬液加以施用。用于经口施用的液体剂型可以包含着色剂和调味剂，以增加患者接受度。制备肠胃外、经口或鼻内可施用的组合物的方法是本领域所熟知的并在各种来源中更详细地进行描述，包括例如Remington'sPharmaceuticalScience(第15版，MackPublishing，Easton，PA,1980)(通过引用并入其全部内容，用于所有目的)。本发明的组合物中的抗原优选是来自或通过细菌、病毒、真菌、寄生虫、癌细胞或过敏原产生的抗原。可以与本发明的宿主细胞和/或LPS相结合的病毒抗原可以源自于一切种类的病毒，这样的病毒的非限制性实例是逆转录病毒科诸如人类免疫缺陷性病毒(HIV)；风疹病毒；副粘液病毒科诸如副流感病毒、麻疹、腮腺炎、呼吸道合胞病毒、人变性肺病毒；黄病毒科诸如黄热病毒、登革热病毒、丙型肝炎病毒(HCV)、日本脑炎病毒(JEV)、蜱传播的脑炎、St.Louis脑炎或WestNile病毒；疱疹病毒科诸如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、埃-巴二氏病毒；布尼亚病毒科；沙粒病毒科；汉他病毒科(Hantaviridae)诸如汉他病毒；冠状病毒科；乳多空病毒科诸如人乳头瘤病毒；弹状病毒科诸如狂犬病病毒；冠状病毒科诸如人冠状病毒；α病毒科(Alphaviridae)；动脉病毒科；纤丝病毒科诸如埃波拉病毒；沙粒病毒科；痘病毒科诸如天花病毒和非洲猪瘟病毒。同样地，本发明的宿主细胞和/或LPS可以与来源于病原菌、真菌(包括酵母)或寄生虫的抗原相联合。这样的抗原包括例如以下细菌的细菌抗原螺杆菌属(Helicobacter)诸如幽门螺杆菌(H.pylori)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)诸如脑膜炎奈瑟氏球菌(N.mengitidis)、嗜血杆菌属(Haemophilus，)诸如流感嗜血杆菌(H.influenza)、博德特氏菌属诸如百日咳博德特氏菌、衣原体属(Chlamydia)、链球菌属(Streptococcus)诸如血清型A链球菌(Streptococcussp.serotypeΑ)、弧菌属(Vibrio)例如霍乱弧菌(V.cholera)、革兰氏阴性肠病原体，包括例如沙门氏菌属(Salmonella)、志贺菌属(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和埃希氏杆菌属(Escherichia)，以及来自导致炭疽、麻疯病、肺结核、白喉、Lyme病、梅毒、伤寒和淋病的细菌的抗原。来自寄生虫的抗原例如包括来自原生动物诸如Babeosisbovis、疟原虫属(Plasmodium)、禾Ij什曼原虫属(Leishmaniaspp·)、鼠弓形虫(Toxoplasmagondii)禾口锥虫属(Trypanosoma)诸如克氏锥虫(T.cruzi)的抗原。真菌抗原可以包括来自真菌诸如曲霉属(Aspergillussp·)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、隐球菌属(Cryptococcus)诸如新生隐球菌(C.neoformans)和荚膜组织胞浆菌的抗原(Histoplasmacapsulatum)。尽管疫苗接种通常被应用于针对病原体的预防保护或用于病原性感染后的疾病治疗，本领域技术人员知道用于肿瘤治疗的疫苗应用。而且，越来越多的肿瘤特异性蛋白质被发现是可通过人抗体或人源化抗体靶向的适当部分。这样的肿瘤特异性蛋白质也在本发明的范围内。许多肿瘤特异抗原在本领域是已知的。因此，在一个优选的实施方式中，本发明提供包含肿瘤特异性抗原和如上文定义的宿主细胞和/或LPS的组合物。适当的肿瘤抗原包括例如癌胚抗原、前列腺特异性膜抗原、前列腺特异性抗原，蛋白质MZ2-E、多态上皮粘蛋白(PEM)、叶酸结合蛋白LK26、(截短的)表皮生长因子受体(EGRF)、HER2、Thomsen-Friedenreich(T)抗原、GM-2和⑶-2神经节苷脂、Ep-CAM、粘蛋白-1、上皮糖蛋白-2和结肠特异性抗原。另外，抗原可以被靶向DC，以诱导在自身免疫性疾病预防方面的耐受。这样的过敏原也在本发明的范围内。因此，在进一步的方面，本发明的宿主细胞、优选百日咳博德特氏菌和/或可获自这类细胞的LPS用作药物。优选地，所述药物是针对百日咳的疫苗。在另一个优选的实施方式中，本发明的宿主细胞、优选百日咳博德特氏菌和/或可获自这类细胞的LPS用作佐剂。更优选地，本发明的宿主细胞、优选百日咳博德特氏菌和/或可获自这类细胞的LPS与抗原联合使用。因此，在进一步的方面，本发明涉及本发明的宿主细胞、优选百日咳博德特氏菌和/或可获自这类细胞的LPS在制备预防和/或治疗百日咳的药物中的用途。在优选的实施方式中，本发明的宿主细胞、优选百日咳博德特氏菌和/或可获自这类细胞的LPS被用作佐齐U，用于制备针对抗原引起免疫应答的药物。更优选地地，本发明的宿主细胞和/或可获自这类细胞的LPS被用作与所述抗原联合的佐剂。因此，在进一步的方面，本发明涉及如在本文先前定义的多肽和/或如在本文定义的本发明的核酸序列在制备预防和/或治疗百日咳的药物中的用途。因此，在进一步的方面，本发明涉及如在本文先前定义的多肽和/或如在本文先前定义的本发明的核酸序列在制备佐剂中的用途。优选地，在这个方面，如在本文先前定义的本发明的多肽和/或如在本文先前定义的本发明的核酸序列与抗原相联合，用于制备引起针对所述抗原的免疫应答的药物。在本发明的方法和用途中，哺乳动物优选是人。在本文件及所附权利要求中，动词“包含/包括”及其动词变化形式以非限制性含义被用于指在该词之后的项目被包括在内，但未具体提到的项目没有被排除。另外，通过不定冠词“一个/种(a)”或“一个/种(an)”提及一要素并不排除存在一个/种以上该要素的可能性，除非上下文清楚地要求有一个并且只要一个要素。不定冠词“一个/种(a)”或“一个/种(an)，，因此经常是指“至少一个/种”。图1.(A)鉴定的糖基转移酶操纵子的示意图。暗灰色箭头表示编码推定的糖基转移酶的基因，而淡灰色箭头和白色箭头分别表示编码推定的单糖脱乙酰基酶的基因和侧翼0RF。(B)通过Tricine(三(羟基基)甲基甘氨酸)-SDS-PAGE进行的来自野生型百日咳博德特氏菌株(WT)以及BP2329突变株、BP2328突变株和BP2331突变株的LPS特性分析。图2.野生型百日咳博德特氏菌㈧和百日咳博德特氏菌突变株BP2328(B)、BP2329(C)和BP2331(D)的0-脱乙酰LPS的负离子ESI-MS0图3.来自BP2331突变株的0-脱乙酰LPS的负模式串联质谱分析。㈧提取的m/z为1108.3的离子的MS/MS谱，(B)提取的m/z为1162.0的离子的MS/MS谱，(C)从m/ζ为1162.0的离子提取的m/z为1112.6的离子的MS3图谱。图4.在用野生型和突变体百日咳博德特氏菌细胞刺激之后的DC活化。(A)在用MOI10(黑线)或100(虚线)的PFA-固定的野生型和突变体百日咳博德特氏菌细胞刺激24h之后在人DC中⑶83、HLA-DR、⑶86和⑶40细胞表面表达的分析。未刺激的DC作为对照(灰色填充柱状图)。显示的是来自5，000个计数事件的所示百日咳博德特氏菌的FACS柱状图。纵轴代表细胞数，而横轴代表染色强度。(B)在用PFA固定的野生型和突变体百日咳博德特氏菌细胞以MOI10或100刺激之后通过培养的人DC的IL-10和IL_12p70产生。结果表示为平均细胞因子浓度(士SD)。图5.在用纯化的野生型和突变体百日咳博德特氏菌LPS刺激之后的DC活化。在用1μg/ml纯化的LPS刺激24h之后在人DC中的⑶83、⑶86和⑶40细胞表面表达的分析。未刺激的DC作为对照(灰色填充柱状图)。显示的是来自5，000个计数事件的所示百日咳博德特氏菌的LPS的FACS柱状图。纵轴代表细胞数，而横轴代表染色强度。(B)在用1μg/ml纯化的LPS刺激之后通过培养的人DC的IL-10产生。结果表示为平均细胞因子浓度。图6.通过纯化的百日咳博德特氏菌LPS和全细菌细胞进行的IL-6诱导。用系列稀释的来自野生型百日咳博德特氏菌(WT)或者BP2328突变株、BP2329突变株和BP2331突变株的纯化LPS(A)或全细菌细胞(B)的储备溶液刺激通过人巨噬细胞系MM6进行的IL-6的产生。在培养物上清液中的IL-6浓度在ELISA中针对人IL-6进行定量。数据代表三个单独实验的平均值。图7.百日咳博德特氏菌LPS的结构。所提出的BP2328突变株和BP2329突变株的截短型核心OS结构通过红色箭头示出。根据Caroffetal.(2000)改写。实施例材料和方法菌株和生长条件所使用的全部菌株在表1中描述。一般地，大肠杆菌菌株在37°C在Luria-Bertani肉汤中生长，同时以200rpm摇动。在适当的情况下，在100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素或10μg/ml正大霉素的存在下生长细菌，用于质粒维持或菌株选择。百日咳博德特氏菌在补充有15%去纤维蛋白的绵羊血(Titium)的Bordet-Gengou(BG)琼脂上于35°C生长。重组DNA技术所使用的全部质粒在表1中描述。使用PromegaWizardPlusSVMinipr印s系统分离质粒DNA。根据生产商(Roche)的说明，使用限制性内切核酸酶。使用PromegaWizardSVGel和PCRClean-Up系统，从琼脂糖凝胶分离DNA片段。使用快速DNA连接试剂盒(Roche)，进行连接。所使用的全部引物在表2中描述。通过将约109个细菌重悬于50μ1蒸馏水中，之后将悬液在95°C加热15min，制备用于PCR反应的染色体模板DNA。然后，将悬液在16，IOOxg下离心lmin，之后将上清液用作模板DNA。为构建百日咳博德特氏菌突变株Β213ΔΒΡ2328和ΔBP2329，通过使用引物BP2328_FWup、BP2329_FWup以及引物BP2328_REVup和BP2329_REVup——两种都包含BamHI位点，我们扩增包括相应的ORF的5’区和上游序列的DNA片段。此外，通过采用都含有BamHI位点的引物BP2328_FWd_、BP2329_FWd_，以及引物BP2328_REVd_和BP2329_REVd_，获得含有所述ORF的3，区和下游序列的DNA片段。为构建百日咳博德特氏菌BP2331突变株，通过引物BP2331_FW和BP2331_REV扩增相应的ORF0使用纯TaqReady-to-goPCR珠(AmershamBiosciences)，在25μ1；总反应体积中，采用5pmol每一引物，进行PCR。温度程序如下95°C3min；95°C15s，55°C30s，和72°Clmin，30次循环；继之以72°C7min，接着冷却至4°C。从琼脂糖凝胶纯化PCR产物并将其克隆入pGEM-TEasy,分别得到质粒pGEM_BP2328up、pGEM_BP2328d。wn、pGEM_BP2329up、pGEM-BP2329down和pGEM_BP233l。pGEM-BP2328down和pGEM_BP2329d。m的BamHI-SpeI片段分别被连接入BamHI-SpeI-限制性pGEM_BP2328up和pGEM_BP2329up。所产生的质粒和质粒pGEM-BP2331分别用BamHI和EcoRV切割，以允许插入通过分别用BamHI和HindIII消化获得的来自质粒PBSL128的卡那霉素抗性序列盒。最后，所获得的构建体的EcoRI片段被连接入EcoRI限制性自杀质粒pSS1129。最终构建体——分别称为pSS1129_BP2328KQ、pSS1129-BP2329K0和pSSl129_BP2331KQ，包含方向与所述操纵子的转录方向相同的卡那霉素抗性序列盒。基于PSS1129的质粒被用来转化大肠杆菌SM10(Apir)，其允许接着将所述质粒转移至百日咳博德特氏菌和通过等位基因交换构建百日咳博德特氏菌BP2328、BP2329和BP2331突变体。转化体通过使用各种引物组的PCR进行筛选。LPS分离和0-脱酰LPS的制备使用略微改变的热酚/水萃取法(Westphal和Jann，1965)分离LPS(Geurtsenetal.，2006)。LPS的0-脱酰化通过温和胼解实现(Hoist,2000)。简言之，将LPS溶于无水胼(200iU)中，并在37°C温育50min，伴随着恒定搅拌，以释放0-连接的脂肪酰基链。冷却混合物并将600yl的冷丙酮分小份添加，以将胼转化成丙酮腙。通过离心(4000xg，在7°C30min)收集0-脱酰化LPS的沉淀物。用600yl冷丙酮洗涤沉淀两次、离心并在冷冻脱水之前溶于水。毛细管电泳_电喷雾质谱法PrinceCE系统(PrinceTechnologies)被连接于4000QTRAP质谱仪(AppliedBiosystems/MDSSciex)。鞘液(异丙醇-甲醇，21)以1.0iU/min的流速输送。使用15mM乙酸铵去离子水溶液，在约90cm长的无涂层熔凝硅石毛细管上获得分离。5kV和_5kV的电喷雾电离电压分别被用于正离子模式检测和负离子模式检。对于全部质谱实验，氮被用作帘气和碰撞气体。在MS2(增强产物离子扫描或EPI)和MS3实验中，扫描速度被设置为4000Da/s，其中具有阱，阱填充时间被设置为“动态”，而Q1的分辨率被设置为“单位”。对于MS3实验，激发系数被设定为这样的值，在该值下对于单电荷前体仅激发第一同位素，其中激发时间设定为100ms。通过Tricine-SDS-PAGE的LPS分析将大约109个细菌悬浮在50u1的样品缓冲液中(Laemmli，1970)，并添加0.5mg/ml蛋白酶K(终浓度)。在55°C温育样品60min，然后在95°C温育lOmin，以灭活蛋白酶K。然后，通过添加样品缓冲液10倍稀释样品，之后，将2ill每一样品施加于Tricine-SDS-PAGE凝胶(Lesseetal.，1990)。使溴酚蓝在35V跑入分离胶，之后电压增至105V。在前端到达凝胶底部之后，继续电泳另外的45min。在水/乙醇/乙酸1181(v/v/v)中过夜固定凝胶，接着如所述用银染色(Tsai和Frasch，1982)。细菌细胞悬液的制备在0.5%多聚甲醛(PFA)磷酸缓冲盐水(PBS)溶液中灭活细菌30min并在无酚红的RPMI1640培养基(Gibco)中彻底洗涤。在600nm处的光密度(0D_)为1的细菌悬液，相当于约109个细菌/ml，在无酚红RPMI1640培养基中制备。人DC产生和培养如以前所描述，从人外周血单核细胞(PBMC)产生不成熟的人DC，其中进行微小的修改(Sallusto和LanzaveCChia，1994)。简言之，使用Ficoll梯度的密度梯度离心(AmershamBiosciences)，从健康志愿者的肝素化血液分离PBMC。回收的PBMC级分在补充有10%热灭火胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基中洗涤三次。接下来，通过三层Percoll梯度的离心(GEHealthcareBio-SciencesAB)(在RPMI1640，10%FCS中的60%、47.5%和34%Percoll)，从PBMC制备单核细胞。从上面的分界面收获单核细胞，用RPMI1640，10%FCS洗涤三次，并且在六孔板(每孔4ml，0.5X106个细胞/ml)中在补充有2.4mML-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)、100U/ml青霉素-链霉素(Gibco)、100ng/ml人重组GM-CSF(Peprotech)和50ng/ml人重组IL-4(Strathmann-BiotecAG)的RPMI1640，10%FCS中温育。在六天的培养之后，收获不成熟的DC(imDC)，其是⑶14和⑶83阴性的，表达低水平的⑶86和HLA-DR，并表达高水平的⑶40和⑶11c，如通过流式细胞术所评价的。DC刺激洗涤ImDC并以5X105个细胞/ml的浓度重悬于RPMI164010%FCS中，并与感染复数(M0I)为10或100的PFA固定的百日咳博德特氏菌细胞或者浓度为10或lOOOng/ml的纯化LPS共温育。在全部实验中未刺激的imDC用作对照。在24h之后收获DC并直接染色，用于细胞表面标记的表达；在测量细胞因子之前将上清液储存在-80°C。细胞表面标记的流式细胞术分析DC成熟标记和共刺激分子的表面表达通过流式细胞术评价。收获不成熟的或经刺激的DC，在RPMI1640，10%FCS中洗涤，并重悬于包含0.牛血清白蛋白(FACS缓冲液)的过滤除菌的PBS中。接下来，在4°C与下列抗体之一温育30min:FITC-偶联的抗人CDllc(mlgGl)和CD83(mIgGl)、藻红蛋白-偶联的抗人CD86(mIgGl)和CD40(mlgGl)、别藻蓝蛋白_偶联的抗人⑶14(mlgGl)和HLA-DR(mIgG2b)和适当的荧光染料-标记的同种型对照(来自eBioscience的CDllc、CD40和CD14；来自BDPharmingen的CD83、CD86和HLA-DR)。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并使用流式细胞术分析(FACScan，BectonDickinson)。细胞因子测量根据制造商的说明(BDBiosciencesPharmingen)，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)，确定在经刺激的DC的上清液中人IL-10和IL-12p70的浓度。内毒素活性测定用如所述的系列稀释的全细菌细胞悬液或纯化LPS刺激人巨噬细胞细胞系MM6(Ziegler-Heitbrocketal.，1988)(Geurtsenetal.，2006)。通过离心从培养物收集细胞、之后它们以1.0的0D■被重悬于PBS，制备细菌细胞悬液，在8mM甲醛存在下热灭活，并在4°C储存。刺激之后，根据生产商的说明，采用针对人IL-6的ELISA，对培养物上清液中的IL-6浓度进行量化(PeliKineCompact)。结果在百日咳博德特氏菌中新的LPS生物合成操纵子的鉴定我们发现四个基因的簇(BP2328至BP2331，GenBank登录号NP_880966至NP_880969)，其中三个显示出与来自各种细菌的LPS糖基转移酶具有高序列相似性，即BP2328、BP2329和BP2331。BP2330显示出与来自苛养木杆菌(Xylellafastidiosa)的多糖脱乙酰基酶具有最高的相似性。四个0RF彼此接近，并且在一些情况下甚至重叠，表明它们组成一个操纵子(图1A)。所述操纵子的基因上游和在相反方向上的基因下游，分别推定编码DNA聚合酶IIIa亚基DnaE的同系物和大肠杆菌的推定硫酸酯酶YhbX的同系物。为了研究该推定LPS糖基转移酶的作用，我们制备了携带由卡那霉素抗性序列盒间隔的各BP2328、BP2329和BP2331基因的自杀质粒pSS1129构建体，用于通过等位基因交换进行插入失活。使用该方法，所有三种基因的敲除突变体可以在百日咳博德特氏菌菌株B213中容易地获得。通过全细胞裂解液的Tricine-SDS-PAGE进行它们的LPS分析，这清楚地显示出BP2328和BP2329突变体的截短型LPS(图1B)。相比之下，BP2331突变株的LPS是更异源的，并且由多条带组成，包括野生型长度。LPS结构分析为确定它们的结构，分离出来自野生型和BP2328、BP2329和BP2331突变株的LPS、进行0-脱乙酰并通过负离子模式的ESI-MS分析(图2)。提出的LPS组成在表3中概括。野生型LPS的图谱(图2A)揭示出在m/zll08.5处的主要三电荷离子，其具有组成GlcNAc-Man2NAc3NAcAFuc2NAc4NMe'GalNA*Glc'GlcN2*GlcA'Hep3*P*Kdo脂质A-OH。其它离子存在于m/z770.1([M-3H]”,811.1([M-4H]”、831.4([M_4H][)、888.3([M-3H]”、951.8([M-HD、987.1([M-2H]2!,1081.7([M-3H]”,1121.1([M-3H+K]”,1155.0([M_2H]”禾口1162.1([M-3H]3_)。这些离子的大多数对应于去磷酸或截短的糖形；然而，在m/zll62.1处的三电荷离子对应于全长百日咳博德特氏菌LPS，其用额外的己糖胺部分取代(表3)。BP2328突变体LPS的ESI-MS谱(图2B)在m/z743.6、770.0和823.7显示出三电荷离子，连同它们在m/z1115.2、1155.1和1235.7的相应双电荷离子。额外的峰存在于m/z777.3([M-3H+Na]3)、952.1([M-HD、1034.6([M-2H]”、1074.6([M-2H]20和1166.1([M-2H+Na]2—)。峰的赋值表明，最完整的核心OS结构由在m/z823.7和1235.7处相应于组成GalNA.Glc.GlcN2.GlcA'Hep2PKdo月旨质A—OH的离子表示。BP2329突变体LPS(图2C)显示出在m/z603.9和657.6处的三电荷离子，连同它们在m/z906.0和986.6处的相应双电荷离子。此外，这些离子的钠和钾加合物分别存在于m/z917.4和997.6以及m/z925.0和1005.6。额外的峰存在于m/z866.0([M_2H]”、937.4([M_2H_H20]勹和1067.1([M-2H]2_)。在这种情况下，最完整的核心结构由在m/z1067.1处相应于组成G1cN2GlcAHep2PKdo脂质A-OH的双电荷离子表示。BP2331突变体LPS(图2D)显示出许多峰，包括在m/z1108.3和1162.0处分别相应于全长百日咳博德特氏菌LPS和用额外的己糖胺取代全长百日咳博德特氏菌LPS的三电荷离子。为解析额外的己糖胺部分的位置——其在野生型和BP2331突变体LPS都进行了观察，以负离子模式进行ESI-MS2研究(图3)。在m/zll08.3(图3A)和1162.0(图3B)处的离子的MS/MS谱都示出了在m/z951.5处的单电荷碎片离子，其显示从碰撞诱导解离下在Kdo-脂质A键之间的裂解得到的脂质A-0H由N-酰化(30HC14)葡糖胺残基的3(1—6)-连接二糖组成，其中每一残基被磷酸基取代。在m/z1162.0的离子的图谱也显示出额外的在m/z1112.6的离子，其表明该额外的己糖胺残基被直接附着于脂质A。在m/z1112.6上的MS3进一步支持了该结论(图3C)。通过百日咳博德特氏菌LPS突变体的树突细胞活化为确定LPS突变对DC活化的影响，将不成熟的DC与M0I为10和100的PFA固定的百日咳博德特氏菌野生型和突变体细菌共培养。通过流式细胞术进行成熟标记(CD83和HLA-DR)和共刺激分子(⑶86和⑶40)的分析(图4A)和通过ELISA进行IL-10和IL12p70诱导的分析(图4B)，监测DC活化。野生型和全部突变体细菌诱导⑶83、HLA-DR、⑶86和⑶40表达，表明全部菌株都能够活化DC。然而，BP2329和BP2331突变体细菌的刺激性明显分别比野生型细菌低和高，而BP2328突变株与野生型的效率相同。在BP2329突变株的情况下观察到的较低的DC成熟伴随着降低的IL-10和IL-12p70诱导(图4B)。类似地，BP2331突变体——其显示出增强的DC成熟能力，诱导出更高量的IL-10和IL_12p70。野生型菌株和BP2328突变株诱导出相当的IL-10水平，这与在应答这些菌株的DC上共刺激分子和成熟标记的相等表达一致。然而，尽管野生型菌株明显诱导IL-12p70的产生，但这对于BP2328突变株几乎不是这样(图4B)，表明IL-10和IL_12p70表达可以被差异调节。为评价在野生型和突变株之间观察到的DC活化能力的差异是否与LPS组成直接有关，采用10和lOOOng/ml的纯化LPS进行DC活化研究。相比于响应野生型、BP2328和BP2331突变体细菌在DC上成熟标记和共刺激分子的表达增加高，即使采用lOOOng/ml的这些菌株的LPS，也发现⑶83、⑶86和⑶40表达仅仅微小增加(图5A)，而HLA-DR表达没有增加(数据未显示)。类似地，IL-10诱导低(图5B)，而IL-12p70不能在用LPS刺激的DC的上清液中检测到(数据未显示)。然而，相互比较(图5A和5B)表明，根据由完整细菌得到的结果，发现对于从BP2331突变株分离的LPS具有最高的DC活化能力，接下来是从BP2328突变株和野生型菌株分离的LPS，而从BP2329突变株分离的LPS不能使DC成熟。因此，突变体的LPS结构的改变差异影响DC活化能力。LPS和全细菌细胞的内毒素活性为评价LPS突变对LPS的内毒素活性的影响，测试纯化LPS刺激人巨噬细胞细胞系MM6产生IL-6的能力。与野生型LPS相比较，来自BP2331突变株的纯化LPS具有强烈增加的刺激巨噬细胞的能力(图6A)。相比之下，来自BP2329突变株的LPS具有降低的刺激IL-6产生的能力，而来自BP2328突变体的LPS的活性与野生型LPS类似(图6A)。仅仅在测试的两个最高的LPS浓度下，后一LPS比野生型LPS具有更高的活性。与采用纯化LPS得到的数据一致，BP2331的全细胞悬液显示，与野生型细胞相比，刺激巨噬细胞的能力明显增加(图6B)。然而，BP2328突变体细胞也显示出该效应(图6B)，而BP2329突变体细胞与野生型细胞具有相似的活性，尽管它们的纯化LPS的活性较低(图6A)。讨论本研究的目的是在百日咳博德特氏菌基因组中鉴定新的LPS糖基转移酶。通过使用已知的LPS糖基转移酶的序列作为引导，我们能够鉴定出四基因操纵子。在先前的研究，其中家禽病原体禽博德特氏菌的基因组序列被与其它博德特氏菌进行比较，与本文鉴定的基因簇同源的基因簇被描述为参与LPS生物合成(Sebaihiaetal.，2006)。然而，没有报道可以证实该任务的功能研究。为研究该操纵子在百日咳博德特氏菌LPS生物合成中的作用，我们通过等位基因交换灭活该推定的糖基转移酶基因并使用Tricine-SDS-PAGE和ESI-MS比较野生型和突变株的LPS特性。出乎意料地，我们发现野生型菌株不仅包含全长百日咳博德特氏菌LPS，而且具有用额外己糖胺部分取代的全长种类，如我们所示，该己糖胺部分被直接附着于脂质A。以前尚未观察到用己糖胺取代百日咳博德特氏菌脂质A，从而代表着百日咳博德特氏菌脂质A的一种新的修饰。所提出的BP2328和BP2329突变株的截短型寡糖结构在图7中概述。在BP2328突变株中最完整的核心OS结构由GalNA*Glc'GlcN2*GlcA'Hep2PKdo脂质A_0H*HexN组成，表明BP2328突变株缺乏末端三糖、庚糖残基和其中的一个GlcN残基。该组成表明BP2328编码的蛋白质起着GlcN(l-4)至Glc转移酶的作用(图7)。BP2329-突变体LPS的分析表明该LPS被进一步截短，并且其最完整的结构由GlcNGlcAHep2PKdo脂质A-0HHexN组成。因为该结构遗漏核心OS的第二GlcN应该被连接到其上的Glc，所以存在的剩余GlcN残基必须被连接于第二庚糖。因此，该组成表明BP2329编码的蛋白质起葡萄糖基转移酶的作用，该葡萄糖基转移酶将Glc连接于第一庚糖亚基(图7)。这将与该基因产物与葡萄糖(01-4)庚糖转移酶的高同源性一致，该葡萄糖(01-4)庚糖转移酶诸如rfaK和lgtF/icsB，其用来首先鉴定该基因。在BP2331突变体的情况下观察到最复杂的表型。尽管所述蛋白质显示出与各种LPS糖基转移酶的高序列相似性，但是全长百日咳博德特氏菌LPS仍存在于该突变株。该观察结果或者表明BP2331基因不编码活性LPS糖基转移酶，或者表明所编码的酶显示出冗余性。与该最后的选择一致，我们已经在百日咳博德特氏菌的基因组中鉴定出基因，即BP3671，GenBank登录号为CAE43928，其编码与BP2331编码的蛋白质显示出69%相同性的蛋白质。虽然野生型和BP2331突变株的LPS特性大致相当，但一个显著的观察结果是所述突变体LPS更异源。尽管该现象的确切原因尚有待阐明，但一个可能的解释可以是BP2331突变体以某种方式显示出其LPS的非化学计量取代增加，可能是用己糖胺取代。用氨基糖修饰脂质A已经描述在各种细菌中，例如在大肠杆菌和沙门氏菌属(Trentetal.,2001b)中用4-氨基阿拉伯糖取代以及在土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)中用半乳糖胺取代(Phillipsetal.，2004)。氨基阿拉伯糖通路已经在大肠杆菌中详细研究并已经表明包括在所述糖部分转移到脂质A之前在单独的十一异戊烯磷酸载体上的装配(Trentetal.，2001a)。因为可以设想卡那霉素抗性序列盒在BP2331中的插入已经增加下游BP2330基因的表达，可以推测增加的BP2330表达也许已导致脂质A的己糖胺修饰增加，从而导致在BP2331突变体细胞中LPS异质性增加。在BP2331突变体中的己糖胺修饰水平的增加支持了该解释，见表3。在已经解决了LPS的结构之后，测试纯化LPS和全细菌细胞诱导DC成熟和刺激通过人巨噬细胞产生促炎细胞因子的能力。结果表明，与野生型菌株相比，BP2331突变株显示出增加的诱导DC成熟和促炎细胞因子产生的能力。由纯化LPS得到相似的结果。相比之下，来自BP2328和BP2329突变株的全细菌细胞和纯化LPS分别显示出相似的和降低的使DC成熟和刺激巨噬细胞的能力。这些结果表明LPS核心OS-组成的改变差异影响百日咳博德特氏菌LPS的生物学特性。从疫苗开发的前景来看，这是令人感兴趣的发现，因为这可允许开发更有效地引起免除应答的菌株。而且，显示出增加的LPS异质性的突变体诸如BP2331突变株，可得到更大量的抗LPS抗体，其本身可正面影响疫苗功效。一方面在DC水平和巨噬细胞活化之间而另一方面在DC水平与脂质A的己糖胺修饰程度之间发现的良好相关性(见表3)强烈表明BP2331突变体的修饰增加在这方面上是决定性的。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>参考文献Alexeyev,M.F.,shokolenko,I.N.,andCroughan,T.P.(1995)Improvedantibiotic-resistancegenecassettesandomegaelementsforEscherichiacolivectorconstructionandinvitrodeletion/insertionmutagenesis.Gene160:63-67.Allen,A.G.，Isobe，T.，andMaskell,D.J.(1998a)IdentificationandcloningofwaaF(rfaF)fromBordetellapertussisandusetogeneratemutantsofBordetellaspp.withdeeproughlipopolysaccharide.J.Bacteriol.180:35-40.Allen，A.G.，Thomas，R.M.，Cadisch，J.T.，andMaskell，D.J.(1998b)Molecularandfunctionalanalysisofthe1ipopolysaccharidebiosynthesislocuswlbfromBordetellapertussis，BordetellaparapertussisandBordetellabronchiseptica.Mol.Microbiol.29:27_38·Allen，A.，andMaskell,D.(1996)Theidentification，cloningandmutagenesisofageneticlocusrequiredforlipopolysaccharidebiosynthesisinBordetellapertussis.Mol.Microbiol.19:37_52.Caroff,M.，Brisson,J.，Martin,A.，andKaribian,D.(2000)StructureoftheBordetellapertussis1414endotoxin.FEBSLett.477:8-14.Clementz，T.，andRaetz,C.R.H.(1991)Agenecodingfor3-deoxy-D-manno-octulosonic—acidtransferaseinEscherichiacoli.Identification,mapping,cloning,andsequencing.J.Biol.Chem.266:9687_9696.DiFabio,J.L.，Caroff，M.，Karibian,D.，Richards，J.C.，andPerry,M.B.(1992)Characterisationofthecommonantigeniclipopolysaccharide0-chainsproducedbyBordetellabronchisepticaandBordetellaparapertussis·FEMSMicrobiol.Lett.76:275_281·Geurtsen，J.，Steeghs，L，Hamstra,H-J.，tenHove,J.，deHaan,Α.，Kuipers，B.,Tommassen,J.,andvanderLey,P.(2006)Expressionofthelipopolysaccharide-modifyingenzymesPagPandPagLmodulatestheendotoxicactivityofBordetellapertussis.Infect.Immun.74:5574_5585·Hanahan,D.(1983)StudiesontransformationofEscherichiacoliwithplasmids.J.Mol.Biol.166:557_580.Hoist,0.(2000)Deacylationoflipopolysaccharidesandisolationofoligosaccharidesphosphates.inMethodsinMolecularBiology,BacterialToxinsMethodsandProtocols(Hoist,0.，Ed.)pp345-353，HumanaPress，Totowa,NJ.Heinrichs,D.E.，Yethon,J.A.，andWhitfield,C.(1998)MolecularbasisforstructuraldiversityinthecoreregionsofthelipopolysaccharidesofEscherichiacoliandSalmonellaenterica.Mol.Microbiol.30:221~232.Isobe,T.，White,K.A.，Allen，A.G.，Peacock，M.，Raetz,C.R.H.，andMaskell,D.J.(1999)BordetellapertussiswaaAencodesamonofunctional2-keto-3~deoxy-D-manno-octulosonicacidtransferasethatcancomplementanEscherichiacoliwaaAmutation.J.Bacteriol.181:2648_265LKasuga，B.，Nakase，Y.，Ukishima，K.，andTakatsu，K.(1953)StudiesonHaemophiluspertussis.KitasatoArch.Exp.Med.27:21~28.Kurzai,0.，Schmitt，C.，Claus，H.，Vogel,U，Froseh，Μ，andKolb-Maurer,Α.(2005)CarbohydratecompositionofmeningococcallipopolysaccharidemodulatestheinteractionofNeisseriameningitidiswithhumandendriticcells.Cell.Microbiol.7:1319_1334.Laemmli,U.K.(1970)CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature227:680_685.Lesse，A.J.，Campagnari,A.A.，Bittner,W.Ε.，andApicella，Μ.Α.(1990)Increasedresolutionoflipopolysaccharidesandlipooligosaccharidesutilizingtricine—sodiumdodecy1su1fate-polyacrylamidegelelectrophoresis.J.Immunol.Methods126:109_117.MacLachlan,P.R.，Kadam，S.K.，andSanderson，K.E.(1991)Cloning，characterization,andDNAsequenceoftherfaLKregionforlipopolysaccharidesynthesisinSalmonellatyphimuriumLT2.J.Bacteriol.173:7151-7163.O'Neill，L.A.J.(2006)HowToll-likereceptorssignal:whatweknowandwhatWedonrtknow.Curr.Opin.Immunol.18:3_9·Palsson-McDermott，E.M.，and0，Neill，L.A.J.(2004)SignaltransductionbythelipopoIysaccharidereceptor，Toll—likereceptor-4.Immunology113153-162.Peppier，M.S.(1984)TwophysicallyandserologicallydistinctlipopolysaccharideprofilesinstrainsofBordetellapertussisandtheirphenotypevariants.Infect.Immun.43:224~232.Phillips，N.J.，Schilling,B.，McLendon,Μ.K.，Apicella,Μ.Α.，andGibson,B.W.(2004)NovelmodificationoflipidAofFrancisellatularensis.Infect.Immun.72:5340_5348·Pliiddeman，A.，Mukhopadhyay,S.，andGordon,S.(2006)Theinteractionofmacrophagereceptorswithbacteriallig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