用于制造重组多克隆蛋白质的方法

专利名称：：用于制造重组多克隆蛋白质的方法
技术领域：
：本发明是关于使用不依赖位点特异性整合的生产系统产生重组多克隆蛋白质，诸如来自免疫球蛋白超家族的蛋白质，例如可溶形式或膜结合形式的B细胞受体或T细胞受体。
背景技术：
：诸如传染病及癌症的许多疾病缺乏有效疗法。单克隆抗体一般尚未成功对抗所有此等把标，此部分归因于复杂靶标的变异性及引起自单克隆抗体识别免疫逃脱的靶蛋白质适应性变。另一方面，多克隆抗体能靶向多个动态靶标例如病毒、细菌.或癌细胞。又，多克隆抗体在抗原突变情况下具有保留活性的最高可能性。存在不同市售多克隆抗体治疗剂，包括1)自正常人类供体的血液分离的正常人类免疫球蛋白；2)来源于带有针对特定疾病耙标(例如病毒)的抗体(先前已经由感染或接种而遇到)的个别人类供体的血液的人类高免疫性免疫球蛋白；及3)来源于经免疫动物的血液的动物高免疫性免疫球蛋白。自人类血液纯化的免疫球蛋白已证实有效对抗B型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、细胞巨大病毒及其它疱疹病毒、狂犬病病毒、肉毒杆菌毒素等感染，以及有效预防新生恒河浙美D(neonatalrhesusD)。自用人类T细月包免疫的兔血液纯化的免疫球蛋白被用于在治疗或预防移植排斥反应中提供T细月包免疫抑制(例如抗胸A泉细月包5求蛋白(Thymoglobulin))。正常人类免疫球蛋白已被用于加强免疫缺陷患者的免疫系统以及用在各种自体免疫病症的疗法中。然而，广泛使用免疫球蛋白因供体血液原料的供应受限、批次间变化的问题及安全性不稳定而已受限制。动物源性免疫球蛋白尤其面临20世纪80年代及90年代对于动物源性单克隆抗体所观测相同的免疫原性问题。最后，如同其它血液产品一样，诸如HIV、疱渗或肝炎病毒或病毒性蛋白颗粒的感染剂传播的危险仍存在。因此，尽管临床医师承认多克隆抗体在一些情况下为优选治疗剂，但其使用已极受限制。产生人类免疫球蛋白的新方法随转基因动物技术而出现。已产生带有人类免疫球蛋白基因座的转基因小鼠(美国专利第6，111,166号)。此等小鼠产生完全人类免疫球蛋白，且针对特定靶标的抗体可藉由常用免疫技术产生。然而，较大抗体产量因相对小体型的小鼠而受限。亦已将较大型动物制成人类免疫球蛋白基因转基因动物，例如牛(Kuroiwa,Y.等人脂wre肠fec/z冊/ogy;2002;20:889-893)。然而，自该等动物的血液产生供治疗用的多克隆抗体并非无并发症问题。首先，动物及人类的免疫生理学可能显示相当大的差异，引起所得免疫库、功能重排及抗体反应多样性的差异。第二，所引入的免疫球蛋白基因座的有丝分裂不稳定性可能影响抗体的长期产生。第三，删除动物自身免疫球蛋白基因座使得(例如)动物抗体的产生将不超过人类抗体产生在技术上具挑战性。第四，诸如病毒、朊病毒或其它病原体的感染剂传播的危险伴随动物中所产生的人类抗体的给药。最近，已开发出在产生时不依赖供体可用性的一种新型多克隆抗体。此等多克隆抗体是藉由自具有针对所要靶标的免疫反应的供体分离编码抗体的核酸序列、接着筛选出特异性结合所要把标的抗体而产生。多克隆抗体可藉由经修改的哺乳动物表达技术来制造，该技术是基于如WO2004/061104中所述一个抗体表达质粒位点特异性整合至各细胞的同一基因组位点中。此新型多克隆抗体的一实例为针对恒河猴D的重组多克隆抗体(WO2006/007850)。使用位点特异性整合产生细胞群体，其中各细胞含有单一拷贝且其中表达水平及生长速率预期为相对均一的。发明概要本发明提供用于产生重组多克隆蛋白质的替代方法，该等方法不依赖位点特异性整合且由此关于产生细胞系的选择提供增加的灵活性，同时维持蛋白质的多克隆性。另夕卜，表达水平可高于使用位点特异性整合的可能表达水平。本发明的方法是基于所关注的个别基因随机整合至宿主细胞中，优选接着克隆具有所要特征的单细胞。接着将各自产生多克隆蛋白质的个别成员的个别细胞克隆混合以产生用于产生多克隆蛋白质的多克隆制造细胞系。多克隆抗体一般为最熟知的多克隆蛋白质。T细胞受体(TcR)同样如此，其于重组表达系统中产生时可以可溶形式获得，可具有如同多克隆抗体的治疗潜力。然而，就本发明的重组表达系统而言，亦有可能将未必同源的蛋白质(例如，在特定缺陷或疾病中具有已知相关性的不同蛋白质)组合。本发明将通过多克隆抗体例示，但其意欲涵盖可能需要一起制造的多克隆TcR及其它多克隆蛋白质。必要时，该等蛋白质亦可为融合蛋白质。本发明允许在一容器中商业性生产重组多克隆蛋白质，例如用于医药组合物中。本发明的一重要特征在于在制造过程期间，构成多克隆蛋白质的个别分子的偏向表达保持于较低量，使不合需要的批次间变化降至最低且避免制造期间消除多克隆抗体的成员。在一方面中，本发明是关于一种产生能表达包含2个至n个独特成员的多克隆蛋白质的多克隆细胞系的方法，该方法包含a)提供一组表达载体，其中该等载体中的每一个包含编码该多克隆蛋白质的独特成员的独特核酸的至少一个拷贝；b)在避免表达载体位点特异性整合至宿主细胞的基因组中的条件下用该等表达载体中的每一者各别地转染宿主细胞，从而获得细胞的2个至n个组合物，各组合物表达多克隆蛋白质的一个独特成员；c)将细胞的该2个至n个组合物混合以获得多克隆细胞系。在优选具体实施方案中，多克隆细胞系被用作多克隆制造细胞系，且经冷冻及储存并用作多克隆主细胞库(polyclonalMasterCellBank,pMCB)，自其可将样本(例如安瓿)解冻且直接用于制造重组多克隆蛋白质或产生多克隆工作细胞库(polyclonalWorkingCellBank,pWCB)。在一具体实施方案中，表达载体为游离型载体(episomalvector)。在另一优选具体实施方案中，表达载体稳定且随机地整合至宿主细胞的基因组中。表达载体可在随机位置处稳定整合至宿主细胞的一或多个染色体中。优选地，克隆步骤b)中所获得的经转染细胞。在一具体实施方案中，克隆是使用如本文所述的荧光活化细胞分选(FACS)克隆来进行。克隆可针对至少一个选自由以下各项组成的组的标准来选择生长速率、倍增时间、表达水平、产生水平、随时间的产生稳定性、生存力、耐性(hardiness)、稳固性(robustness)、形态及拷贝数。优选地，克隆是针对关于该至少一个标准的均一性来选择。更优选地，克隆是针对关于倍增时间及表达水平的均一性来选择。一个克隆或一个以上克隆可针对各独特多克隆蛋白质成员来选择。因此，2个克隆可针对各独特多克隆蛋白质成员来选择，或可选择3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、ll个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个克隆。表达不同独特成员的细胞的组合物可以1:1比率或以不同于1:1比率的比率混合。优选地，表达载体除多克隆蛋白质的编码序列的变化以外皆相同。该方法可应用于单体(monomeric)多克隆蛋白质与多聚体(multimeric)多克隆蛋白质。在多聚体蛋白质的状况下，一个表达载体可编码一个独特多克隆蛋白质成员的所有亚单元。或者，步骤a)中的表达载体组由两个或两个以上表达载体亚組构成，其中第一亚组包含编码蛋白质的一个亚单元的变异核酸序列，且第二亚组包含编码蛋白质的另一个亚单元的变异核酸序列，使得各转染以来自第一亚组的成员及第二亚组表达载体的成员进行。此转染可同时或依序进行。特定而言的，步骤a)中的表达载体组可由两个表达载体亚组构成，其中第一亚组包含编码抗体重链的变异核酸序列，且第二亚组包含编码抗体轻链的变异核酸序列，使得各转染以来自第一亚组的成员及第二亚组表达载体的成员进行。该表达载体或又一表达载体优选编码可选标记。此外，在有利于表达可选标记的细胞生长的条件下连续培养细胞。通过使用包含宿主细胞所缺乏的基因产物的可选标记来最大地确保此目的。在一具体实施方案中，可选标记由亦编码多肽成员或该多肽成员的亚单元的转录物编码，优选地，其中该可选标记由编码最大亚单元的转录物编码。本发明的一方面是关于一种制造多克隆蛋白质的方法，其中该多克隆蛋白质包含2-n个独特成员，该方法包含a)提供使用本发明的方法所获得的多克隆细胞系；b)在允许表达多克隆蛋白质的条件下培养该多克隆细胞系；及c)自细胞或培养基回收及任选地纯化该多克隆蛋白质。本发明者已确定，令人惊讶地，在模拟生产周期期间维持个别克隆的分布，其代表工业上制造重组药品的条件。由于多克隆抗体的个别成员的表达载体在不同位置处整合且由于拷贝数不同，因此上述现象非常令人惊讶。其可产生表达水平与生长速率方面的差异。与预期相反，制造未引起多克隆抗体的一或多个成员完全或部分损失。即使不同细胞系之间生长速率具有微小差异，仍预期多克隆组合物随时间将引起多克隆组合物的至少一个成员完全或部分损失。因此，在本发明的具体实施方案中，继工作细胞库解冻之后10次以上细胞分裂，优选15次以上细胞分裂，诸如20次以上细胞分裂，例如25次以上细胞分裂，诸如30次以上细胞分裂，例如40次以上细胞分裂，诸如50次以上细胞分裂，例如75次以上细胞分裂，诸如100次以上细胞分裂期间维持组成稳定性。随附实施例显示在25次以上细胞分裂期间组成稳定性被维持于可接受的限度内。尽管各别转染在绝大多数状况下优选，但在某些条件下有可能在转染前汇集表达载体。若多克隆蛋白质为单体，则此确实为一种选择，此是由于不存在一个细胞表达多克隆蛋白质的若干不同成员的问题。若多克隆蛋白质为多聚体，则转染前汇集表达载体仅在采用手段确保每个细胞中仅插入一个拷贝时方为可能的。否则，可能发生亚单元不合需要的混杂(scrambling)。尽管汇集表达载体有一定可能性，但其与各别转染相比较为不优选，此是由于预期其产生关于维持组成稳定性的较不稳固(robust)制造系统。在本发明的两种方法中，应了解，多克隆蛋白质通常为与实现表达的细胞并不天然相关的多克隆蛋白质。本发明描述将变异核酸序列的文库引入宿主细胞系中以产生适合作为多克隆制造细胞系的细胞集合的若干方法。此等方法包括用文库整体式转染(bulktransfection)细胞集合；用文库的部分半整体式转染细胞等分试样；或优选地个别转染，其中用文库的个别成员转染宿主细胞，接着汇集选择后即产生的克隆。优选地，本发明利用哺乳动物细胞(细胞系或细胞型)作为宿主细胞系。在本发明的一方面中，由独立基因片段对编码多克隆蛋白质的个别成员。个别成员包含(arecomprisedof)两个或两个以上多肽链的多克隆蛋白质包括可溶形式或膜结合形式的抗体及T细胞受体。在本发明的其它具体实施方案中，一对基因片段编码抗体重链及轻链可变区，或T细胞受体ct链及卩链可变区，或T细胞受体Y链及5链可变区。本发明进一步提供包含2个至n个细胞群体的多克隆细胞系，各群体表达重组多克隆蛋白质的独特成员，该等细胞包含至少一个随机整合至基因组中的表达构建体。在一具体实施方案中，至少一个表达构建体随机整合至染色体外元件中。在另一具体实施方案中，该至少一个表达构建体在随机位置处整合至宿主细胞的一或多个染色体中。细胞系优选源于哺乳动物细胞系，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤细胞(例如Sp2/0细胞、NS0、YB2/0)、NIH3T3、成纤维细胞或永生化人类细胞(诸如海拉细胞(HeLacell)、HEK293细胞或PER.C6)。然而，亦可使用非哺乳动物真核或原核细胞，诸如植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、细菌、真菌等。在又一方面中，本发明是关于包含编码与组成性启动子以可操作方式连接的5型腺病毒反式激活蛋白E1A的稳定整合核酸的DHFR阴性CHO细胞。构建该经修饰的CHO细胞系用于产生本发明的其它方面的实验。如并入本文中的实施例中所示，该细胞系已证实关于生长速率及表达水平的均一性及两者随时间的稳定性异常稳定且由此尤其适于在本发明的方法中使用。稍后实验显示E1AmRNA在经两次亚克隆的细胞中不可检测。此意谓显示显著组成稳定性的结果不可仅归于E1A表达。甚至还预期，稳定表达E1A的DHFR阴性CHO细胞系将产生极稳定及高表达细胞系。在一优选具体实施方案中，细胞系来源于DG44细胞系，其为同型合子DHFR基因敲除的。若细胞包含重组DHFR表达构建体，则此细胞系可仅在胸苷缺乏培养基中存活。在优选具体实施方案中，本发明的细胞系进一步包含编码所关注多肽的稳定整合表达构建体的至少一个拷贝。所关注多肽可为多聚体蛋白质，该多聚体蛋白质优选为抗体。为允许在胸苷缺乏培养基中选择，编码所关注多肽的表达构建体另外编码dhfr。优选地，dhfr及所关注多肽的至少一个亚单元是由同一转录物编码，更优选地，dhfr是由编码最大亚单元的转录物编码。由此在所要产物(所关注多肽)与选择标记(dhfr)之间产生强连接，且确保存活细胞表达所关注多肽。为进一步增强所关注多肽的表达，可由一或多个可由转录激活剂E1A反式活化的启动子控制所关注多肽的表达，优选地，其中该启动子为CMV启动子或来源于CMV启动子。定乂"蛋白质"或"多肽"意谓氨基酸的任何链，无论长度或翻译后修饰如何。蛋白质可以单体或包含两个或两个以上经装配多肽链、蛋白质片段、多肽、寡肽或肽的形式存在的多聚体。如本文所用的术语"多克隆蛋白质"或"多克隆性"(polyclonality)是指包含不同但同源的蛋白质分子的蛋白质组合物，该等蛋白质分子优选是选自免疫球蛋白超家族。因此，各蛋白质分子与组合物的其它分子同源，但亦含有一或多段可变多肽序列，该一或多段的特征在于多克隆蛋白质的个别成员之间存在氨基酸序列差异。该等多克隆蛋白质的已知实例包括抗体或免疫球蛋白分子或其衍生物(诸如Fab、Fab2、单链Fvs等)、T细胞受体及B细胞受体。多克隆蛋白质可由经定义的蛋白质分子亚组组成，该亚组已通过常见特征定义，诸如对所要靶标的共有结合活性，例如在针对所要靶抗原的多克隆抗体的状况下。术语"所关注的多克隆蛋白质"涵盖共有常见特征的所定义多克隆蛋白质亚组，该常见特征为诸如对所要靶标的结合活性，例如在通过针对耙抗原的结合活性或特异性描述的多克隆抗体的状况下，该抗原例如为分别的蛋白质、微生物、寄生虫、细胞型、过敏原或碳水化合物分子或任何其它可为特异性抗体结合的耙标的结构、分子或物质中的一或多者或该等抗原的混合物。术语"重组多克隆蛋白质组合物的一个成员"或"重组多克隆蛋白质的一个成员"表示包含不同但同源的蛋白质分子的蛋白质组合物的一个蛋白质分子，其中各蛋白质分子与组合物的其它分子同源，但亦含有一或多段可变多肽序列，该一或多段的特征在于多克隆蛋白质的个别成员之间存在氨基酸序列差异。术语"可变多肽序列'，及"可变区"可互换使用。术语"重组多克隆蛋白质的独特成员"表示包含不同但同源的蛋白质分子的蛋白质组合物的一个蛋白质分子，其中各蛋白质分子与组合物的其它分子同源，但亦含有一或多段可变多肽序列，该一或多段的特征在于多克隆蛋白质的个别成员之间存在氨基酸序列差异。术语"抗体，，描述血清的功能组份且通常称作分子集合(抗体或免疫球蛋白)或一个分子(抗体分子或免疫球蛋白分子)。抗体分子能与特异性抗原决定子(抗原或表位)结合或与的反应，继而可诱导免疫效应机制。个别抗体分子通常视作单特异性，且抗体分子的组合物可为单克隆(亦即，由相同抗体分子组成)或多克隆(亦即，由与同一抗原上或甚至独特、不同抗原上的相同或不同表位反应的不同抗体分子组成)。各抗体分子具有使其能与其相应抗原特异性结合的独特结构，且所有天然抗体分子具有两个相同轻链及两个相同重链的相同整体基本结构。抗体亦统称为免疫球蛋白。如本文所用的术语抗体亦意欲包括嵌合抗体及单链抗体；以及抗体的结合片段，诸如Fab、Fv片段或scFv片段；以及多聚体形式，诸如二聚IgA分子或五价IgM。术语"多克隆抗体"描述能与同一抗原上或不同抗原上的若干不同特异性抗原决定子结合或与之反应的不同抗体分子的组合物。通常认为多克隆抗体的变异性位于该多克隆抗体的所谓可变区中。然而，在本发明的情形中，多克隆性亦可理解为描述存在于所谓恒定区中的个别抗体分子之间的差异，例如，如在含有两个或两个以上抗体同型的抗体混合物的状况下，该等抗体同型为诸如人类同型IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgM、IgD及IgE或鼠类同型IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3及IgA。"所关注的重组多克隆抗体"描述所定义的重组多克隆抗体亚组，其特征在于与所要靶标或所要靶标组结合的能力，该等靶标例如为分别的蛋白质、微生物、寄生虫、细胞、过敏原或碳水化合物分子或其它可为特异性抗体结合的靶标的结构、分子或物质或其混合物。术语"免疫球蛋白，，通常用作血液或血清中所发现的抗体混合物的统称，但亦可用于命名其它来源的抗体混合物。术语"免疫球蛋白分子，，表示个别抗体分子，例如，作为免疫球蛋白的一部分，或任何多克隆或单克隆抗体组合物的一部分。当陈述多克隆蛋白质的成员与抗原结合时，其此处意谓具有低于1mM、优选4氐于100nM、甚至更优选4氐于10nM的结合常数的结合。术语"所关注的变异核酸分子的文库"用于描述核酸分子的集合，其共同编码"所关注的重组多克隆蛋白质"。当用于转染时，所关注的变异核酸分子的文库包含于表达载体的文库中。该文库典型地具有至少2个、3个、4个、5个、6个、IO个、20个、50个、IOOO个、104个、105个或106个独特成员。如本文所用的术语"独特核酸序列，，应理解为可编码一起构成所关注蛋白质的不同多肽链的核酸序列。当独特核酸序列包含一个以上编码序列时，此等序列可呈双顺反子转录单元的形式或其若与合适启动子以可操作方式连接，则可以两个各别转录单元的形式操作。同样地，若所关注蛋白质由3个或4个亚单元组成，或若选择标记与编码所关注蛋白质或其亚单元的核酸一起包括于转录单元中，则可设想使用三顺反子及四顺反子转录单元。优选地，本发明的独特核酸序列为核酸分子(诸如载体)的一部分。一些需要一个以上编码序列以产生所关注蛋白质的完整分子的实例包括B细胞受体、抗体及抗体片段(诸如Fab及可变域)或T细胞受体。当引入细胞中时，一起编码所关注的经完全装配蛋白质的基因存在于同一载体中，由此在一个核酸序列中连接于一起。如本文所用的术语"所关注基因"是指包含一或多个编码所关注蛋白质的一个成员的基因片段(基因组或cDNA)的核酸序列。复数形式的"所关注基因"是指编码所关注多克隆蛋白质的核酸序列的文库。术语"Gor，用作所关注基因(包括单数与复数形式)的缩写。如本文所用的术语"载体"是指核酸序列可插入其中用于在不同遗传环境之间输送和/或用于在宿主细胞中表达的核酸分子。若载体带有供插入载体中的核酸序列转录用的调节元件(至少一合适启动子)，则该载体于此处称为"表达载体"。若插入上文所鉴别的载体中的核酸序列编码如本文所定义的所关注蛋白质，则使用以下术语"所关注载体"及"所关注表达载体'，。术语"同型编码载体(anisotype-encodingvector)，，是指带有编码抗体同型的核酸序歹寸的载体。在本i兑明书中，"p藍菌体载体(phagemidvector)，，及"噬菌体载体(phagevector)，，可互换使用。术语"质粒，，及"载体"可互换使用。本发明意欲包括起等效功能的其它形式载体，例如质粒、噬菌体及病毒基因组或能引导所要蛋白质在适当宿主中产生的任何核酸分子。术语"所关注载体的文库的每个成员"用于描述来源于所关注载体的文库的具有独特核酸序列的个别载体分子，其中该核酸序列编码所关注的重组多克隆蛋白质的一个成员。术语"质量转移(masstransfer)"用于描述所关注的核酸序列自一个载体群体转移至另一个载体群体且对各DNA同时如此进行，而不重新分选以分离所关注的个别DNA。该等载体群体可为含有(例如)所关注的可变区、启动子、前导序列或强化元件的文库。接着可在无预先分离的情况下将此等序列自(例如)噬菌体载体移至哺乳动物表达载体。尤其对于抗体序列而言，此技术确保在文库自(例如)选择载体(例如噬菌体呈现载体)移至哺乳动物表达载体时vH与VL多样性之间的联系不会丧失。藉此保留VH与VL的原始酉己7于。术语"转染，，于本文中用作将外来DNA引入细胞中的广义术语。该术语亦意欲涵盖将外来DNA引入细胞中的其它功能等效方法，诸如供体细胞及受体细胞的转化、感染、转导或融合。术语"选择"用于描述细胞已获得能与尚未获得某特征的细胞分离的该特征的方法。该等特征可为对细胞毒性剂具抗性或产生必需营养素、酶或颜色。术语"可选标记基因，，、"选择标记基因"、"选择基因，，及"标记基因，，用于描述编码可选标记的基因(例如，赋予针对某细胞毒性药物(诸如某些抗生素)的抗性的基因、能产生可自生长培养基耗尽的必需营养素的基因、编码产生可分析代谢物的酶的基因或编码(例如)可由FACS分选的有色蛋白质的基因)，可将其连同所关注基因一起共同引入细胞中。术语"重组蛋白质」用于描述自经包含蛋白质的编码序列的表达载体转染的细胞系表达的蛋白质。^口本文所用的术i吾"以可才喿4乍方式连才妾(operablylinked)"是指片段被置于与另一片段的功能关系时，与该另一片段连接。举例而言，若编码信号序列的DNA被表达为参与多肽转移至内质网之前导序列，则该编码信号序列的DNA与编码该多肽的DNA以可操作方式连接。又，若启动子或增强子刺激编码序列转录，则该启动子或增强子与该编码序列以可操作方式连接。术语"大多数个别细胞"是指一定百分率的细胞，诸如大于80%、优选大于85%、更佳90%、95%或甚至99%或更高。如本文所用的术语"基因组"并非照文字上理解为存在于细胞中的染色体的正常补体，而亦为可引入细胞中或维持于细胞中的染色体外元件。该等染色体外元件可包括(但不限于)迷你染色体(mini-chromosome)、酵母人工染色体(yeastartificialchromosomes,YAC)、小鼠人工染色体(mouseartificialchromosomes,MAC)或人类人工染色体(humanartificialchromosomes,HAC)。术语"启动子"是指结合RNA聚合酶以起始转录的过程中所涉及的DNA区。术语"头对头启动子(head-to-headpromoters)，，是指靠近置放使得由启动子驱动的两个基因片段转录反向发生的启动子对。头对头启动子亦可构建有包含两个启动子之间的不相关核酸的填充片段。该填充片段可易于含有500个以上核苷酸。"抗生素抗性基因(antibioticresistancegene)，，为编码能克制抗生素对细胞的抑制作用或毒性作用以确保该细胞在该抗生素存在下存活且继续增殖的蛋白质的基因。术语"内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite)，，或"IRES"描述不同于mRNA上的正常5'端帽子结构的结构。两种结构均可由核糖体识别以起始对AUG密码子扫描来起始翻译。通过使用一个启动子序列及两个起始AUG,可自单一mRNA翻译第一多肽序列及第二多肽序列。因此，为能自单一双顺反子mRNA共同翻译第一多核苷酸序列与第二多核苷酸序列，该第一多核苷酸序列及该第二多核苷酸序列可经由接头序列(包括能使IRES序列下游的多核苷酸序列翻译的IRES序列)以转录方式融合。在此状况下，经转录的双顺反子RNA分子将自加帽5'端且自双顺反子RNA分子的内部IRES序列翻译，从而产生第一多肽与第二多肽。术语"可诸导性表达(inducibleexpression)J用于描述需要诱导分子相互作用或辅佐抑制分子及供表达的调节蛋白质释放发生的表达。术语"组成性表达，，(constitutiveexpression)是指并非通常为可诱导性的表达。术语"混杂"(scrambling)描述自个别细胞表达多克隆蛋白质的两个或两个以上独特成员(各自包含两个或两个以上不同多肽链(例如来自免疫球蛋白超家族))的情形。此情形在个别细胞已整合至基因組(一对以上基因片段)中时可发生，其中各对基因片段编码多克隆蛋白质的独特成员。在该等情形下，可形成自基因片段表达的多肽链的非所欲组合。多肽链的此等非所欲组合可能不具有任何治疗作用。术"i吾"VH-VL《连〉'昆杂，，(VH-VLchainscrambling)为上文所定义的混杂的一实例。在此实例中，VH及VL编码基因片段构成一对基因片段。混杂在自细胞产生VH及VL多肽的非所欲组合时发生，其中两个不同VH及VL编码基因片段对被整合至同一细胞中。该混杂的抗体分子不太可能保留原始特异性，且由此可能不具有任何治疗作用或甚至非所欲的治疗作用。术语"重组多克隆制造细胞系(recombinantpolyclonalmanufacturingcellline)"是指经所关注的变异核酸序歹ll的文库转染使得一起构成重組多克隆制造细胞系的个别细胞带有所关注的独特核酸序列的一或多个拷贝的蛋白质表达细胞的群体，其中该独特核酸序列编码所关注的重组多克隆蛋白质的一个成员，且各拷贝被整合至各细胞的基因组中。针对保留所关注的独特核酸序列的经整合拷贝的能力来选择构成重组多克隆制造细胞系的细胞，例如通过抗生素选择。可构成该制造细胞系的细胞可例如为细菌；真菌；真核细胞，诸如酵母；昆虫细胞；或哺乳动物细胞，尤其永生哺乳动物细胞系，诸如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤纟田胞(例如Sp2/0纟田胞、NS0、YB2/0)、NIH3T3及永生化人类细胞(诸如海拉细胞、HEK293纟田胞或PER.C6)。术语"偏差(bias)"用于表示重组多克隆蛋白质产生期间的现象，其中多克隆载体、多克隆细胞系或多克隆蛋白质的组合物因随机遗传突变、个别细胞之间的增殖动力学差异、不同表达构建体序列之间的表达水平差异或DNA的克隆效率差异而随时间改变。术语"RFLP"是指"限制片段长度多态性"(restrictionfragmentlengthpolymorphism),其为一种在用卩艮制酶裂解后分析核酸分子片段的迁移凝胶图案的方法。术语"5'UTR"是指mRNA的5'非翻译区。术语"避免位点特异性整合的条件"(conditionsavoidingsitespecificintegration)是4旨不包4舌获4寻4立力、净争异性整合的任何可能方式的转染过程。位点特异性整合可(例如)使用重组酶及重组酶于宿主细胞染色体中的识别位点的组合来达成。重组酶亦可与识别染色体中的特定位点的核苷酸段共价连接。位点特异性整合亦可使用同源重组达成-但效率较低。若使用整合载体，则避免位点特异性整合通常将使得在宿主细胞整个基因组的随机位置处整合。术语"随机整合(randomintegration)"是指表达载体在随机位置处整合至宿主细胞的基因组中。随机的辞典含义为对各个项目(在此状况下为整合位点)存在同等机会。当转染细胞时，所有整合位点并不表示绝对同等机会的整合，此是由于染色体的一些部分比其它部分更倾向于整合事件。当未做任何事情以将表达载体引导至特定整合位点时，其将在可能整合位点的组内随机的位置处整合。因此，在本发明的情形中，"随机整合"应理解为未做任何事情以将表达构建体引导至预定位置的转染程序。不存在将表达载体引导至预定位置的手段足以确保"随机整合，，。因而，整合位点在经转染群体中的细胞之间会有所不同，且准确整合位点可视为不可预测。术语"稳定整合(stablyintegrated)"是指表达载体整合至宿主细胞的基因组中，其中该整合经至少20代、更佳30代、更佳40代、更佳50代(诸如75代，例如100代)或更多代而保持稳定。缩写"CMV，，=(人类)细月包巨大病毒(cytomegalovirus)。"AdMLP"=腺病毒主要晚期启动子。SV40多聚A=猿猴病毒40多聚A信号序列。GFP=绿色荧光蛋白质。TcR二T细胞受体。ELISA=酶联结免疫吸附鉴定。LTR二长末端重复序列。图1为产生多克隆细胞库的过程的示意图。该图示意性说明为获得多克隆细胞库(例如多克隆主细胞库)所需的步骤。a)说明各编码多克隆蛋白质的不同及独特成员的不同表达载体N.A.,、N.A.2、N.A.3等。b)说明待用表达载体转染的宿主细胞。c)说明表达载体在不同位置处且以不同拷贝数整合至个别细胞中。d)说明选择针对多克隆蛋白质的成员中的每一者的细胞克隆。在此特定状况下，为便于说明，多克隆蛋白质的每一独特成员仅显示一个克隆。步骤e)说明将步骤d)中所选择的克隆混合以产生多克隆细胞库。图2a为编码重链及轻链的原型载体。元4牛^口下其间具有间隔元件的两个相同头对头人类CMV启动子重链(VH+恒定区)及轻链(k02-286)的编码区bGH=牛生长激素聚腺苷酸化序列SV40pA=SV40聚腺苷酸化序歹'J重链及轻链的基因组前导序列IRES+DHFR=ECMV内部核糖体进入位点及小鼠二氬叶酸还原酶cDNApUCori=pUC复制起点bla、amp=氨千青霉素抗性基因(ampicillinresistancegene)图2b为ElA表达载体pML29。元4牛下该载体是基于pcDNA3,l+(Invitrogen)CMV=人类CMV启动子EU^5型腺病毒13S反式激活蛋白的cDNAbGH=牛生长激素聚腺苷酸化区SV40EP=SV40早期启动子Neo=neo抗性基因SV40多聚A=SV40聚腺苷酸化区AMP=编码氨千青霉素抗性的p-内酰胺酶基因图3为进行实验的5周时段期间混合物1-9的IgG含量。详情参见实施例1。图4为显示5周培养时段开始(黑色)及结束(蓝色)时混合物8的组成的离子交换层析图。图5显示通过离子交换层析法分析来自全部9个混合物的第一(灰色)及最终(黑色)样本且计算并图标各个别抗体的含量。图6显示通过离子交换层析法分析菌种及生物反应器运作期间来自4个混合物(实施例5)的样本且计算并图标各个别抗体的含量。混合物1A-3A含有单一克隆/抗体。表达6个抗体中的每一者的细胞克隆在混合物1A(图6a)、混合物2A(图6b)及混合物3A(图6c)中不同。混合物4A(图6d)含有3个克隆/抗体。发明详细描述重逸/^發蛋^者《这屑鍵本发明提供可靠地制造优选选自免疫球蛋白超家族(具有类免疫球蛋白域的蛋白质家族)的重组多克隆蛋白质的方法。大多数成员与细胞表面识别事件有关。序列分析表明抗体、T细胞受体、MHC分子、一些细胞翻附分子及细胞因子(cytokines)受体高度同源。含有可变区的此家族成员尤其适合于产生本发明的重组多克隆蛋白质。该等成员包括抗体、膜结合抗体(B细胞受体)、Fab片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、T细胞受体(TcR)、可溶性TcR、TcR可变域片段、通过多肽接头连接的TcR可变域片段或其它抗体或TcR衍生的片段。具体的，预期本发明可用于重组治疗性多克隆抗体及TcR的大规模制造及生产。本发明的制造方法的主要优势之一在于构成重组多克隆蛋白质的所有成员可于一个或数个生物反应器或其等效物中产生。另外，重组多克隆蛋白质组合物可自反应器以单一制剂形式纯化，而无须在过程期间分离构成重组多克隆蛋白质的个别成员。相比之下，若欲通过混合经纯化的单克隆抗体；f莫拟重组多克隆抗体组合物(例如，如WO91/16074中所提出)，则将需要在生物反应器中各别制造待包括于组合物中的各抗体且亦将个别地纯化抗体。此单克隆混合物的产生与如本文所述产生重组多克隆抗体或其它多克隆蛋白质的方法相比，成本高昂、耗时且占用面积大。因此，如WO91/16074中所述的方法对于可包括于该混合物中的单克隆抗体数目当然存在实际限制，而如本文所述的技术一般可产生具有许多个别成员(原则上无上限)的多克隆抗体。所使用的宿主细胞系优选为哺乳动物细胞系，包含典型地用于生物医药蛋白质表达的那些哺乳动物细胞系，例如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤细胞(例如Sp2/0细胞、NS0、YB2/0)、NIH3T3及永生化人类细胞(诸如海拉细胞、HEK293细胞或PER.C6)。在本发明中，使用CHO纟田胞，更特别为经修饰的DG44克隆。选择此特殊细胞系的原因在于，CHO细胞被广泛用于重组制造抗体且DG44克隆可与另外允许所编码的基因扩增的代谢选择标记DHFR组合使用。DG44细胞系已通过经编码E1A反式激活蛋白的表达载体转染而加以修饰。当所关注基因与CMV启动子以可操作方式连接时，进行此修饰以增加总产量。CMV启动子是由E1A反式活化。修饰已提供异常稳定的细胞系，从而提供针对不同抗体具有均一生长速率及均一且较高表达水平的细胞克隆。由此认为修饰改良了随时间的组成稳定性。检测经修饰细胞系中的E1A表达的尝试已失败。因而，均一生长速率及均一且较高表达水平不太可能仅归于E1A表达。尽管在目前状况下，E1A表达不可检测，但仍相信利用E1A表达使CMV启动子反式活化可产生更高且稳定的表达水平。优选将BHK-21细胞或CHO细胞用于表达。合适的CHO细胞包括(但不限于)CHO-Kl及CHO-S细胞。CHO的Dhfr缺乏(minus)突变体(诸如CHO-DUKX-B11或DG44)为用于实施本发明的优选哺乳动物细胞。此等细胞在此项技术中已为熟知且广泛可得，例如可得自美国菌种保存中心(AmericanTypeCultureCollection,A.T.C.C.,Rockville,Md.)(BHK-21)或Dr.LawrenceChasin,ColumbiaUniversity,NewYork(CHODUKX-B11或DG44)。此等细胞良好适应在悬浮培养物中(亦于无血清条件下)生长和/或可在低血清浓度下生长且可与DHFR选择标记一起使用。优选对细胞系进行亚克隆且选择显示较高且稳定表达多克隆蛋白质的成员的克隆。因此，一般熟习此项技术者将能用其它克隆取代DG44克隆且用如所述的其它哺乳动物细胞取代CHO细胞，或甚至利用其它类型的细胞，包括植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、真菌及细菌。因此，细胞类型的选择并不意欲限制本发明。使用本发明的方法可获得的产量视许多参数而定，该等参数包括(但不限于)培养条件及所使用的宿主细胞种类。在本发明的具体实施方案中，产量优选超过50mg/L蛋白质，诸如大于60mg/L,例如大于75mg/L,诸如大于100mg/L，例如大于125mg/L,诸如大于150mg/L,例如大于200mg/L，诸如大于250mg/L,例如大于300mg/L,诸如大于400mg/L,例如大于500mg/L,诸如大于600mg/L,例如大于700mg/L，i者如大于750mg/L,例如大于800mg/L,诸如大于900mg/L,例如大于1,000mg/L,诸如大于2g/L，例如大于3g/L,-渚如大于4g/L，例如大于5g/L。本发明的重组多克隆蛋白质意欲涵盖包含不同但同源的蛋白质分子的蛋白质组合物，该等蛋白质分子天然可变，意谓在优选具体实施方案中，变异核酸的文库包含天然产生的多样性。因此，各蛋白质分子与组合物的其它分子同源，但亦含有一或多段可变多肽序列，该一或多段的特征在于多克隆蛋白质的个别成员之间存在氨基酸序列差异。构成可变多肽序列的氨基酸序列差异可能小至一个氨基酸。优选地，氨基酸序列的差异构成一个以上氨基酸。通常，认为多克隆抗体或TcR的天然变异性位于多肽链的所谓可变区或V区中。在本发明的一方面中，多克隆蛋白质中的个别成员包含长度大致介于80个与120个氨基酸之间的可变区。可变区可包含高变域，例如互补决定区(CDR)。在天然产生的TcR中，各可变区中有四个CDR。在天然产生的抗体中，重链中有三个CDR且轻链中有三个CDR。在本发明的又一方面中，多克隆蛋白质的个别成员的可变区包含至少一个长度介于l个与26个(1-26)氨基酸之间、优选长度介于4个与16个氨基酸之间的高变域。此高变域可对应于CDR3区。对于抗体而言，各可变区优选构成三个高变域。此等高变域可对应于CDR1、CDR2及CDR3。对于TcR而言，各可变区优选构成四个高变域。此等高变域可对应于CDR1、CDR2、CDR3及CDR4。高变域可单独构成本发明的重组多克隆蛋白质的可变区内的可变序列。在本发明的情形中，多肽序列的变异性(多克隆性)亦可理解为描述存在于抗体多肽链的所谓恒定区或C区中的个别抗体分子之间的差异，例如，如在含有两个或两个以上不同抗体同型的抗体混合物的状况下，该等抗体同型为诸如人类同型IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgM、IgD及IgE或鼠类同型IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM及IgA。因此，重组多克隆抗体可包含特征在于可变区(V区)中或恒定区(C区)中或二者中个别抗体分子之间的序列差异的抗体分子。优选地，抗体具有相同同型，此是由于此种情形会使后续纯化相当容易。亦可设想将(例如)同型IgG1、IgG2及IgG4的抗体组合，此是由于此等同型可使用蛋白质A亲和层析法一起纯化。在一优选具体实施方案中，构成多克隆抗体的所有抗体具有相同恒定区以进一步有利于纯化。更优选地，抗体具有重链的相同恒定区。轻链的恒定区在独特抗体之间亦可相同。为提供编码结合特定抗原的蛋白质的变异核酸序列，可利用此项技术中已知的许多方法。典型地，本发明将得益于使用能鉴别和/或分离编码结合特定抗原的蛋白质的核酸的筛选程序。若干此等方法包括自以下技术已知的富集步骤或所谓生物淘选步骤(biopanningstep):诸如SymplexTM(Mejier等人，2006,J.Mol.Biol,358:764-772;WO2005/042774)、嗟菌体呈现(Kang，A.S.等人1991.ProcNatlAcadSciUSA88，4363-4366)、核糖体呈现(Schaffitzel，C.等人1999.J.Immunol.Methods231,119-135)、DNA呈现(Cull,M.G.等人1992.ProcNatlAcadSciUSA89,1865-1869)、RNA-肽呈现(Roberts,R.W.,Szostak，J.W.，1997ProcNatlAcadSciUSA94,12297-12302)、共价呈现(covalentdisplay)(WO98/37186)、细菌表面呈现(Fuchs,P.等人1991.Biotechnology9,1369-1372)、酵母表面呈现(Boder，E.T.,Wittrup，K.D.，1997.NatBiotechnol15，553-557)及真核病毒呈现(Grabherr，R.，Ernst，W,,2001.Comb.Chem.HighThroughput.Screen.4,185-192),该等技术皆为此项技术中已知的方法，且皆为实施本发明的受关注辅助法。FACS及磁性珠粒分选亦适用于使用经标记抗原达成富集(淘选)目的。亦可继生物淘选步骤之后或单独使用免疫检测筌定，诸如ELISA(Dreher，M.L.等人1991.J.Immunol.Methods139,197-205)及ELISPOT(Czerkinsky，C.C.等人1983.JImmunolMethods.65，109-21)。所关注的重组多克隆蛋白质的组合物包含已通过常见特征定义的所定义蛋白质亚组，该常见特征为诸如对所要靶标的共有结合活性，例如在针对所要靶抗原的多克隆抗体的状况下。典型地，多克隆蛋白质组合物具有至少2个、3个、4个、5个、10个、20个、50个、100个、1000个、104个、105个或106个独特变异成员。多克隆蛋白质组合物中所需的独特成员的数目将视靶标的复杂性而定。在抗体的状况下，所靶向的抗原的复杂性将影响多克隆抗体组合物中所需的独特变异成员的数目。就较小或不太复杂的靶标(例如小蛋白质)而言，包含2或3个与100个之间的独特变异成员的多克隆抗体组合物可能足够，且变异体的数目优选不超过90个或甚至80个或70个。在许多情形中，独特变异体的数目将不超过60个或50个，且变异体的数目优选处于5个与40个之间，诸如5个与30个之间。而对于更复杂的靶标而言，包含20个至500个之间的独特变异成员的多克隆抗体组合物可能足够。对抗原包含许多不同分子的极复杂靶标而言，可能需要包含50个至10,000个之间的独特变异成员的多克隆抗体组合物。在哺乳动物中，存在天然产生的多克隆蛋白质的若千已知实例，其在血液中自由循环，诸如抗体或免疫球蛋白分子；或存在于细胞表面上，诸如T细胞受体及B细胞受体。在一些哺乳动物中，此等天然产生的多克隆蛋白质的多样性是通过编码此等蛋白质的可变区的基因的遗传重组来达成。另外已知抗体通过体细胞突变而使其多样性增加。本发明可通过分离造成多样性的序列(例如免疫球蛋白分子或TcR的可变域或CDR区)且自其产生文库来利用此等天然多样性。对于自例如抗体可变重链与可变轻链、TcRa链与卩链或TcRS链与y链的两个独立基因片段编码的蛋白质而言，文库中的各载体将构成成对此等可变区编码序列。可变区编码序列对的文库的产生在此项技术中已为熟知。包含天然产生的多样性的文库为(例如)组合文库(可变区编码序列的随机配对)以及同源对文库(来源于同一细胞的可变区编码序列对，例如WO2005/042774)。自并入适当构架(诸如抗体或TcR可变区)中的经分离CDR基因片段产生的其它文库(例如Soderlind,E.等人，2000.Nat.Biotechnol.18，852-856)适用于本发明。优选筛选文库以获得具有所要特异性的亚文库(所关注文库)。蛋白质的多样性亦可以人工方式获得，例如合成或通过变。突变可为编码单一蛋白质的核酸序列的随机突变或,与、突变，从而产生单一蛋白质的多克隆群体。产生人工抗体文库的另一实例描述于EP0859841中，其为一种基于产生可与另一CDR文库组合的可变区框架文库的方法。在本发明的一优选具体实施方案中，重组多克隆蛋白质为重组多克隆抗体或抗体片段。在本发明的另一优选具体实施方案中，重组多克隆蛋白质为重组多克隆TcR或TcR片段。因此，本发明的重组多克隆蛋白质亦可由不同同型构成或更优选由不同亚类构成。免疫球蛋白的多克隆性可在免疫球蛋白分子的恒定部分中或可变域中或恒定部分与可变域二者中出现。抗体的所谓恒定区、尤其重链中的多克隆性在抗体的治疗应用方面受关注。各种免疫球蛋白同型具有不同生物功能(概述于表1中)，当利用抗体进行治疗时可能需要将其组合，此是由于免疫球蛋白的不同同型可能牵涉于天然免疫反应的不同方面(Canfield及Morrison1991.J.Exp.Med.173，1483-91;K證pel等人2002.Transfus.Clin.Biol.9,45,53;Stirnadel等人2000.Epidemiol.Infect.124，153-162)。表1:人类免疫球蛋白同型的生物功能<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>本发明的又一方面为包含含有2-n个细胞群体的多克隆细胞系的重组多克隆制造细胞系，其中各群体表达重组多克隆蛋白质的独特成员，该等细胞包含随机整合至基因组中的表达构建体。该等表达构建体优选稳定整合至基因组中。在一具体实施方案中，构建体被整合至一或多个染色体中。多克隆细胞系中细胞群体的数目n可为3个或3个以上，i者如4个或4个以上，例如5个或5个以上，-清如6个或6个以上，例如7个或7个以上，诸如8个或8个以上，例如9个或9个以上，诸如10个或10个以上，例如11个或11个以上，诸如12个或12个以上，例如13个或13个以上，诸如14个或14个以上，例如15个或15个以上，诸如16个或16个以上，例如17个或17个以上，i者如18个或18个以上，例如19个或19个以上，-渚如20个或20个以上，例如21个或21个以上，t者如22个或22个以上，例如23个或23个以上，诸如24个或24个以上，例如25个或25个以上，诸如26个或26个以上，例如27个或27个以上，诸如28个或28个以上，例如29个或29个以上，诸如30个或30个以上，例如35个或35个以上，i者如40个或40个以上，例如45个或45个以上，诸如50个或50个以上，例如60个或60个以上，诸如70个或70个以上，例如80个或80个以上，诸如90个或90个以上，例如100个或100个以上。在多数情况下，n可小于50个，诸如小于45个，例如小于40个，-渚如小于35个，例如小于30个。本发明的一重要具体实施方案为在最终混合多克隆细胞系之前所进行的细胞克隆步骤。此步骤通过使克隆偏差(clonalbias)的出现降至最低而使所获得的多克隆细胞库的产量及稳定性得以改良。表达重组多克隆蛋白质的一个独特成员的细胞可来源于1个或1个以上经克隆的细胞，诸如2个或2个以上，例如3个或3个以上，i者如4个或4个以上，例如5个或5个以上，诸如6个或6个以上，例如7个或7个以上，诸如8个或8个以上，例如9个或9个以上，诸如10个或10个以上，例如11个或11个以上，_渚如12个或12个以上，例如13个或13个以上，-渚如14个或14个以上，例如15个或15个以上，诸如16个或16个以上，例如17个或17个以上，-漆如18个或18个以上，例如19个或19个以上，诸如20个或20个以上，例如21个或21个以上，i者如22个或22个以上，例如23个或23个以上，诸如24个或24个以上，例如25个或25个以上，诸如26个或26个以上，例如27个或27个以上，诸如28个或28个以上，例如29个或29个以上，诸如30个或30个以上，例如35个或35个以上，诸如40个或40个以上，例如45个或45个以上，诸如50个或50个以上，例如60个或60个以上，i者如70个或70个以上，例如80个或80个以上，诸如90个或90个以上，例如100个或100个以上。在多数情况下，经克隆细胞的数目小于50个，例如小于20个，诸如小于15个，例如小于10个。在上述具体实施方案的又一具体实施方案中，编码多克隆蛋白质(优选来自免疫球蛋白超家族)的变异核酸序列皆来源于天然产生的序列，例如自供体分离的序列。克^,摔#多克隆蛋白质的特征之一在于其由许多个别蛋白质分子构成，其中各蛋白质分子与多克隆蛋白质的其它分子同源，但亦具有特征在于多克隆蛋白质的个别成员之间的氨基酸序列差异的变异性。优选地，该等差异限于多克隆蛋白质的整体结构的独特区域。该等区域例如为抗体或TcR的可变区且可能进一步限于此等区域中的CDR区。此变异性亦可描述为多样性，其可在核酸层面上与蛋白质功能层面上鉴别，例如对靶标的特异性及亲和力差异。细胞系的克隆多样性可通过对自表达重组多克隆蛋白质的细胞池分离的克隆进行RFLP来分析。(RT)-PCR产物的测序是分析克隆多样性的另一可能方式。亦可通过对由细胞系产生的重组多克隆蛋白质进行功能测试(例如ELISA)来分析多样性。WO2006/007853揭示表征多克隆细胞系及多克隆蛋白质的方法。此等方法可用于分析细胞系及所得多克隆蛋白质的克隆多样性。若存在克隆偏差(亦即，构成多克隆抗体的个别抗体含量逐渐变化)，则其可通过将用于转染的初始文库的克隆多样性与表达重组多克隆蛋白质的细胞(细胞系)池中所发现的多样性相比较来进行评估。自细胞系表达的多克隆蛋白质的克隆多样性可以多克隆蛋白质所引起的靶覆盖(targetcoverage)来评估。在此状况下，当约25-100%的所要靶分子被多克隆蛋白质结合时，视为获得足够多样性。举例而言，在多克隆抗体的状况下，抗体与靶抗原表面上至少25%的非相同表位结合提供组合物中的足够多样性。靶覆盖所引起的克隆多样性优选为至少50%,且甚至更佳为至少75%。对于抗体而言，该耙覆盖可(例如)通过表位定位来评估。或者，克隆多样性可以多克隆组合物个别成员的分布来评估。此分布可以与转染期间最初引入细胞系中的不同编码序列的数目相比，最终多克隆蛋白质组合物中的不同个别成员的总数来评估。在此状况下，当转染中最初使用的编码序列的至少50%、优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少90%(诸如至少95%、97%、98%或99%)可#1鉴别为最终多克隆蛋白质的不同个别成员时，视为获得足够多样性。以另一方式表示，若制造期间多克隆蛋白质中仅1个成员丧失，或若2个、3个、4个或5个成员丧失，则克隆多样性可视为足够。多克隆组合物个别成员的分布亦可关于个别成员之间的相互分布来评估。在此状况下，若组合物中无单一成员构成最终多克隆蛋白质组合物中的蛋白质总量的75%以上，则视为获得足够克隆多样性。优选地，无个别成员超过最终多克隆组合物中的个别成员总数的50%以上，甚至更优选为25%且最优选为10%。基于多克隆组合物中个别成员的分布的克隆多样性评估可通过RFLP分析、序列分析及蛋白质分析来进行，诸如稍后对于多克隆组合物表征所述的方法。克隆多样性可因克隆偏差而降低，该克隆偏差可因a)表达水平的差异，b)细胞增殖的变化而出现。若该等偏差出现，则易于通过对如本文所述的方法进行微小修改来补救克隆多样性丧失的此等来源中的每一者。有可能细胞系中个别细胞的细胞增殖速率的变化可经延长的时段将偏差引入重组多克隆蛋白质表达中，使由细胞系表达的重组多克隆蛋白质的一些成员的存在增加或减少。由于本发明方法可能基于随机整合至宿主细胞的基因组中，因此位置与拷贝数在多克隆细胞系的成员之间有所不同。此可能引起克隆之间增殖速率及表达水平的差异。通过选择具有类似增殖速率的细胞克隆，使此问题最小化。又一可能性为使用多克隆蛋白质的各成员的一个以上克隆。实施例说明与多克隆蛋白质的各成员仅一个克隆相比，若使用介于3个与5个之间的表达多克隆蛋白质的单一成员的克隆，则组成稳定性增加。处理此问题的另一方式为使用一或多个选择标准以确保细胞在某些预设限度内关于一或多个标准为均一的，该一或多个标准是选自由生长速率、倍增时间、表达水平、产生水平、随时间的产生稳定性、生存力、耐性、稳固性、形态及拷贝数组成的组。增殖速率变化的一原因可能为构成用于初始转染的开始细胞系的细胞群体为异质的。已知细胞系中的个另'J细胞经延长的时段不同地发育。为确保更均质的开始物质，在用所关注的表达载体转染之前，可使用将细胞系限制稀释(limitingdilution)直至单细胞层面且使各单细胞生长成新细胞群体来进行细胞系的亚克隆或重复亚克隆(所谓通过限制稀释进行细胞亚克隆)。用于单细胞克隆以确保明确定义的细胞群体的一替代优选方法为继转染之后使用荧光活化细胞分选(FACS)。此可在选择程序之前完成。经荧光标记的抗体可用于富集来源于经IgG构建体转染的细胞池的高产细胞(Brezinsky等人J.2003.ImmunolMethods277,141-155)。使用FACS分选的优势在于该方法组合单细胞克隆(通过将单细胞分选至孔中)，而同时提供关于各单细胞的表达水平的信息。为进一步改进分选程序，可将生存力染色(viabilitystain)包括在内以摒弃死亡细胞或濒临死亡细胞。FACS程序使细胞经受相当严格的条件，包括剪应力。此意谓间接选择对该等条件具抗性的细胞。此外，自动化操作FACS程序以允许分选大量单细胞。FACS方法亦可用于分选表达类似量的免疫球蛋白的细胞，从而产生关于生产力的均质细胞群体。同样地，通过使用以荧光染料5,6-羧基荧光素二乙酸盐丁二酰亚胺酯(CFSE)标记，可通过FACS方法选择显示类似增殖速率的细月包。本发明的一重要具体实施方案为产生多克隆抗体的各成员的一或多个克隆细胞系。单细胞克隆的产生可使用许多标准技术中的任一者进行。然而，结果为，针对生存力及IgG量选择细胞且将其个别分选至孔中的FACS细胞分选法已始终如一地显示提供适合于制备多克隆主细胞库及后续多克隆工作细胞库的稳定克隆。可在FACS分选之前或期间移除来自(例如)Mtx的选择压力，但优选维持持续选择压力，例如，通过于无核苷培养基中生长。优选在继细胞分选之后在选择压力下于培养物中一定天数后选择个别克隆。由于在分选之后同一天选择克隆，因此该等克隆的生长速率将相对均一。除此之外，亦视觉检查群落以摒弃与原始未转染的细胞系相比形态明显变化且生长速率较低的克隆。最后，可使用(例如)ELISA或其它分析技术鉴定抗体表达水平且可选择具有较高及相对均一表达水平的克隆。即使确实发生增殖速率所诱导的偏差，个别成员的丧失或过度呈现亦可能未必关键，此视最终重组多克隆蛋白质产品的多样性需求及多样性随时间的稳定性而定。凉i细應宿主细胞可白可将DNA整合至其染色体中或保留染色体夕卜元件的任何纟田胞产生，该等染色体外元件为诸如迷你染色体、酵母人工染色体(YAC)、小鼠人工染色体(MAC)或人类人工染色体(HAC)。MAC及HAC详细描述于WO97/40183中，其以引用的方式并入本文。优选地，使用哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤细月包(例如Sp2/0、YB2/0或NSO细月包)、成纤维细月包(诸如NIH3T3)及永生化人类细胞(诸如海拉细胞、HEK293细胞或PER.C6)。然而，亦可使用非哺乳动物真核或原核细胞，诸如植物细胞、昆虫细月包、酵母细月包、真菌、大肠杆菌(E.coli)等。在本发明的一具体实施方案中，通过在用所关注载体的文库转染之前对细胞系进行所谓限制稀释直至单细胞层面、接着使各单细胞生长成新细胞群体来亚克隆待用作开始物质的细胞系。必要时，亦可在选择正确细胞系的过程中稍后进行该亚克隆。单细胞克隆的其它方法包括FACS克隆(Brezinsky等人J.2003.ImmunolMethods277，141-155)、LEApTM技术(来自Cyntellect,SanDiego,California,USA)及ClonePix(来自Genetix,UK)。^合身戎沐以下描述集中于使用哺乳动物表达系统。然而，同样可能使用具有合适修改的用于在细菌中表达的本发明方法。合适的载体包含合适的选择基因用于哺乳动物细胞表达的合适选择基因包括(但不限于)能用于营养选择的基因，诸如胸香激酶基因(TK)、谷氨酰胺合成酶基因(GS)、色胺酸合成酶基因(trpB)或组胺醇脱氢酶基因(hisD)。另外，选择标记为赋予抗药性的抗代谢物抗性基因，诸如二氢叶酸还原酶基因(dhfr)，其可用次黄噤呤及胸苷缺乏培养基选择且用曱胺喋呤(methotrexate)进一步选择；黄噤呤-鸟噪呤磷酸核糖转移酶基因(gpt),其可用霉酚酸(mycophenolicacid)选择；新霉素磷酸转移酶基因(neo)，其可用真核细胞中的G418选择且用原核细胞中的新霉素(neomycin)或卡那霉素(kanamycin)选择；潮霉素B磷酸转移酶(hyg、hph、hpt)基因，其可用潮霉素(hygromycin)选择；噪呤霉素N-乙酰基-转移酶基因(pac),其可用嘌呤霉素(puromycin)选择；或杀稻瘟菌素S脱胺酶基因，Bsd)，其可用杀稻痕菌素(blasticidin)选捧；扎辛抗性基因(Zeocinresistancegene,Shble)，其介导对扎辛(Zeocin)及博莱霉素(Bleomycin)的抗性。最后，编码能(例如)通过流式细月包术分选的蛋白质的基因亦可用作选择标记，诸如绿色荧光蛋白质(GFP)、神经生长因子受体(NGFR)或其它膜蛋白质，或P-半乳糖苷酶(LacZ)。选4奪标记可位于分别的表达载体上，由此用编码选4奪标记的表达载体及一或多个编码所关注蛋白质或所关注蛋白质的亚单元的表达载体进行共同转染。选择标记亦可位于编码所关注蛋白质的表达载体中。在此后者状况下，选标记优选位于亦编码所关注蛋白质或其亚单元之一的转录物上。此可(例如)使用IRES构建体完成。在多聚体蛋白质(诸如抗体)的状况下，选"^奪标记优选位于编码最大亚单元(诸如抗体重链)的转录物上。整合所关注基因的载体进一步包含编码所关注的重组多克隆蛋白质的一个成员的DNA,在其之前为引导蛋白质表达的自身哺乳动物启动子。若所关注的重组多克隆蛋白质的成员包含一个以上蛋白质链，例如若该成员为抗体或T细胞受体，则在编码该等蛋白质链的DNA之前可为引导各链较高量表达(双向或单向)的自身哺乳动物启动子。在双向表达中，可使用表达载体中的头对头启动子构象，而对于单向表达而言，可将与(例如)IRES序列组合的两个启动子或一个启动子用于表达。亦可设想具有两个由同一转录物编码且由IRES序列分开的不同亚单元的双顺反子表达载体。合适的头对头启动子组态为(例如，但不限于)处于两个方位的AdMLP启动子连同小鼠金属硫蛋白-1启动子，处于两个方位的AdMLP启动子连同延长因子-l启动子，或处于两个方^f立的CMV启动子连同MPSV启动子，或以两个方位使用的CMV启动子。在抗体的状况下，经验已表明细胞所表达的重链量应不超过轻链量。因此，引导轻链表达的启动子优选至少与引导重链表达的启动子一样强。编码功能前导序列或转位信号的核酸序列可包括于表达载体中以将基因产物引导至内质网或细胞内的特定位置(诸如细胞器(organelle))。强聚腺苷酸化信号可处于蛋白质编码DNA序列的3'端。聚腺香酸化信号确保初生RNA转录物终止及聚腺苷酸化化且与讯息稳定性相关。编码所关注的重组多克隆蛋白质的成员的DNA可(例如)编码抗体或抗体片段的重链与轻链，在各基因序列之前任选地为引导两条链中的每一者较高量表达的自身哺乳动物启动子元件和/或接着强多聚A信号。整合用的表达载体可带有其它转录调节元件，诸如用于增加整合位点处的表达及表达稳定性的增强子、抗抑制元件(anti-repressor)或常染色质开放元件(ubiquitouschrmatinopeningelements,UCOE)。增强子为与转录中所涉及的核蛋白质特异性相互作用的核酸序列。UCOE开放染色质或将染色质维持于开放状态且有利于重现性表达以可操作方式连接的基因(更详细描述于WO00/05393及Benton等人，Cytotechnology38:43-46，2002中)。其它增强子或强化元件包4舌如(例如)Girod&Mermod2003(「Chapter10:Useofscaffold/matrix-attachmentregionsforproteinproduction」，第359-379页，GeneTransferandExpressioninMammalianCells,SCMakrides(编),2003，ElsevierScienceBV)中所述的基质附着区(MAR)。抗抑制元件包括(但不限于)STAR元件(Kwaks等人NatBiotechnol.2003年5月，21(5):553-8)。当上文所述的调节元件中的一或多者被整合至宿主细胞的染色体中时，将其称为异源调节元件。多^>發工,勿岸及2细岸在本发明的优选具体实施方案中，利角多克隆默金细胞库(polyclonalMorkingCellBanks,pMCB)及多克隆卫斯特细刃包库(polyclonalWasterCellBanks，pWCB)。可用于通过解冻及扩展单一安瓿的内含物来建立多克隆制造细胞系的pMCB可自包含个別细胞系的冷冻原料产生。用于产生该pMCB的个别细胞系是获自i)单一克隆(如实施例2中所述)，H)单一克隆的混合物(如实施例2中所述)，或Hi)克隆池(选择后所获得的单一集落池。克隆已自经个别转染且经选择用于稳定表达多克隆蛋白质的个别成员的宿主细胞获得。针对稳定表达的选择是通过此项技术中已知的程序进行，例如使用选4%标记基因。在本发明的一优选具体实施方案中，个别细胞系是获自经克隆或亚克隆的细胞，例如通过使源于i)、ii)或iii)的细胞系经受限制稀释或单细胞FACS分析及选择，或通过选择高表达克隆，例如使用自动仪器，如ClonePixFL(见下文)。可将用于产生如上文所述的pMCB的个别细胞系预储存于个别细胞系的冷冻文库原料中，在产生pMCB之前自该冷冻文库原料解冻及扩展各个别细胞系的安瓿。优选地，个别细胞系表达特性与由pMCB的其它成员产生的抗体不同的全长抗体，例如不同抗原特异性、不同亲和力、不同可变区或CDR区和/或不同恒定区。用于产生pMCB的各细胞系产生多克隆蛋白质的不同成员。优选地，多克隆蛋白质的各独特成员结合特定抗原。另外，优选地，各独特成员是自位于各宿主细胞基因组中的随机位点处的多个整合体(integrant)产生。pMCB是通过将预定数目的来自各个别细胞系的细胞混合而产生。该等细胞优选以相等数目(1:1比率)混合，但亦可能需要其它比率(见后文)。将细胞的混合物以等分试样冷冻，在此将其分配至许多小瓶中，各小瓶具有规定数目的细胞。将此等小瓶冷冻且储存作为供稍后制造目的用的pMCB。优选地，构成pMCB的小瓶的数目超过10个、25个、50个、75个、100个、200个、500个或1000个小瓶。可在产生多克隆制造细胞系的不同批次的不同时间点处将pMCB中的个别小瓶解冻，该等批次能产生批次间具有基本上相同组成的多克隆蛋白质。在本发明的一替代方法中，可自来源于pMCB的pWCB扩展多克隆制造细胞系。pWCB是通过将来自pMCB的单一小瓶解冻且将细胞扩展为足以产生可以新一系列等分试样(pWCB)冷冻的细胞总数的许多代而产生，其中各pWCB等分试样中的细胞数与最初用于产生pWCB的pMCB小瓶中的细胞数大致相同。当pWCB已耗尽时，可能自pMCB的等分试样产生新pWCB。因此，与扩展来自冷冻文库原料的个别细胞系且混合新pMCB所需的工作量相比，此方法将需要显著较低的工作量。另外，在pWCB耗尽的情况下，产生多克隆制造细胞系的更多批次的机会增加，该等批次能产生批次间具有基本上相同组成的多克隆蛋白质。通过混合已通过个别转染而获得的个别细胞系来产生pMCB的优势在于有可能在产生pMCB之前进行经个别转染的细胞系的额外分析及选择。由此可确保实现已描述的多样性需求的更稳定多克隆制造细胞系。另外，多克隆蛋白质可以更具重现性方式制造。以下关于pMCB所述的内容亦适用于pWCB。在本发明的又一具体实施方案中，已如上文所述经选择用于稳定表达多克隆蛋白质的个别成员的个别细胞系在产生pMCB之前关于其增殖速率和/或生长力来进一步表征。在一优选具体实施方案中，选择具有类似增殖速率或生产力的细胞系用于产生pMCB。甚至更优选地，选择具有类似生产力以及类似增殖速率的细胞系用于产生pMCB。优选地，在表征增殖速率和/或生产力之前使细胞系适应无血清悬浮培养。或者，在转染之前使用于转染的亲本细胞适应无血清悬浮培养。增殖速率可通过此项技术中已知的方法评估。哺乳动物细胞系的增殖速率应介于18小时与100小时之间，优选介于22小时与40小时之间且最佳介于24小时与32小时之间。生产力应超过0.5皮克蛋白质/细胞/天(皮克/(细胞x天))，优选应超过l、1.5、3、5、8、10、15、20、30、40、50、75或100皮克/(细胞x天)。另夕卜，当通过细胞内染色法评估时，细胞系应显示关于表达的均质细胞群体。必要时，可通过克隆，例如通过本文所述的FACS分选法，获得各个别细胞系的更均质细胞群体。在本发明的其它具体实施方案中，继如本文所述的转染及选择程序之后，对个别细胞系进行FACS分选以鉴别具有均质表达水平的细胞。可使用经荧光标记的抗体分选表达较高量的所要蛋白质(例如抗体或TcR)的细胞，从而产生关于生产力的均质细胞群体。此技术是基于以下观测所分泌的蛋白质可在分泌其的细胞表面上检测到，且表面蛋白质的量曰业'然对应于个别细胞的表达水平。因此，高产细月包可为用经标记的抗体染色后、接着通过FACS分析分选出的单细胞。该技术已由Brezinsky(Brezinsky等人J.2003.ImmunolMethods277,141-155)描述。替代分选技术是基于对自细胞表达的蛋白质具特异性的配位体与细胞表面偶合。举例而言，抗Fc抗体或抗独特型抗体可经由生物素(biotin)与分泌蛋白质的细胞群体表面偶合。接着由个别细胞表面上的抗Fc抗体捕捉该细胞所分泌的抗体。其后，可在用经标记的抗体染色后即通过FACS分选高产细胞。此技术已描述于EP667896中。为获得具有均质高表达水平的细胞系，基于通过所述技术中的一者所获得的FACS概况来分析具有高表达水平的单细胞。接着如上文所述扩展个别细胞克隆且关于增殖速率及生产力潜在地分析。或者，通过分选收集如通过FACS概况所鉴别的具有最高表达水平的细胞子池。必要时，来自个别细胞系的细胞子池亦可关于增殖速率及生产力加以分析。在本发明的一替代具体实施方案中，使用诸如ClonePixFL自动仪器(Genetix，UK)的自动仪器选择展示高表达水平和/或类似生长特性的克隆。其可如下完成使转染及选择之后所获得的群落在半固体培养基中生长，该半固体培养基允许通过捕捉紧邻群落处所分泌的蛋白质产物来检测高产群落。各群落的产生水平是藉助于免疫荧光标记由细胞表达的蛋白质、接着基于诸如表达水平及生长特性的预定选择标准由成像软件选择最佳克隆来确定。此外，可通过自动仪器使用光检测成像来评估各群落的大小(反映细胞增殖速率)。接着通过自动仪器分离具有所要生产和/或生长特性的群落且将其转移至96孔盘进行进一步繁殖优选地，选择具有类似生产力的个别细胞系用于产生pMCB。在一优选具体实施方案中，构成pMCB的个別纟田胞系是自(例如)通过单细胞分选、限制稀释或自动仪器采集所获得的具有高表达水平的经克隆细胞产生或自具有高表达水平的细胞池产生。在本发明中，将获自转染及选择之后所分离的细胞的单一群落的个别细胞系与获自(例如)通过单细胞FACS分选所获得的克隆的个别细胞系称为经克隆的细胞系。在一优选具体实施方案中，该等经克隆的细胞系用于产生pMCB。在本发明的其它具体实施方案中，在产生pMCB时以不同比率混合个别细胞系。可基于个别细胞系和/或由该细胞系表达的个别蛋白质成员的特性(例如比生产率或结合亲和力)，根据预定标准来混合该等个别细胞系。举例而言，表达尤其结合关键抗原或表位的某些抗体的个别细胞系可以超过pMCB的其余成员细胞系的量供给，例如高2倍、3倍、5倍或10倍。一个成员细胞系可(例如)超出所有其它成员以2:1比率添力口，例如成员1为4x106个细胞且其余成员细胞系中的每一者为2x106个纟田胞。亦可采用pMCB中的个另、J细胞系为差另、J比率的此方法以避免个别细胞系之间增殖速率及生产力的差异，尤其当此等个别细胞系尚未针对此等特性的类似性加以选择时。因此，若个别细胞系中的一或多者与特征在于较快增殖速率的多克隆工作细胞库其它成员相比具有较慢增殖速率，亦即，较长倍增时间，但此较慢增殖速率与特定高生产力无关时，则可将此(此等)特定成员以增加的量添加至pMCB中以补偿其緩慢生长5举例而言，若构成pMCB的其余细胞系具有介于22小时与30小时之间的增殖速率则可以2:1比率添加具有50小时增殖速率的细胞系。同样地，可降低具有短倍增时间的细胞系的比率以确保此等细胞系在制造期间将不会过剩(takeover)。另外，可根据对由产生自pMCB的多克隆制造细胞系所产生的多克隆蛋白质产物的分析调整pMCB中个别细胞系的比率。例如可基于IEX模式或等效表征工具作出该等调整。若该分析显示一或多个特定蛋白质成员与其余成员相比以增力口的量产生，则可产生新pMCB，其中产生此等特定蛋白质成员的细胞系的比率降低。且反的，若特定成员以较低量产生，则可产生具有增加比率的产生此成员的细胞系的pMCB。潜#系鍵本发明的重组多克隆蛋白质可使用任何合适的培养模式制造，该培养模式包括(但不限于)批次(batch)、补料批次(fed-batch)及灌流(perfusion)过程。建i葛量^这蛋^l的衷迷，系鍵将核酸序列引入细胞中的方法在此项技术中已知。此等方法典型地包括使用DNA载体以将所关注序列引入细胞、基因组或染色体外元件中。细胞转染可通过熟习此项技术者已知的许多方法实现，该等方法包括脂质粒转染(lipofection)、化学介导的转染、磷酸钙沉淀、电穿孔、显孩史注射、脂质粒融合、RBCghost融合、原生质粒融合、病毒转导及类似方法。对于宿主细胞系转染而言，使用所关注栽体的文库，其中各载体包含编码所关注的重组多克隆蛋白质的一个成员的核酸序列的仅一个拷贝。所关注表达载体的此文库共同编码所关注的重组多克隆蛋白质。合适的整合用载体描述于先前部分中。产生重组多克隆制造细胞系及自该细胞系产生重组多克隆蛋白质可通过若干不同转染及制造策略获得。图i中所说明的优选转染方式为一种高产量方法，其中使用构成所关注文库的个别载体各别地转染宿主细胞。将此方法称为个别转染。优选各别地选择经个别转染的宿主细胞。然而，亦可在选择之前将其汇集。选择后即产生的个别细胞克隆可关于表达水平、增殖速率及整合模式加以分析，且优选地，具有类似生长速率、类似拷贝数、类似表达水平和/或类似稳固程度的彼等克隆可用于产生多克隆GOI文库原料。可在产生原料之前、在已自原料撷取后即刻或在短增殖及适应时间之后混合个别细胞克隆以获得所要多克隆细胞系。此方法可进一步改进组成稳定性。在允许一个以上拷贝整合至各细胞中的转染环境下，若多克隆蛋白质为单体，则可使用表达载体的混合物进行整体式转染。对于多聚体蛋白质而言，允许多重整合至宿主细胞基因组中的该整体式转染将引起亚单元混杂。在许多状况下，诸如制造医药用途的重组多克隆抗体时，应避免混杂。对于多聚体蛋白质而言，若混杂为可接受的或若转染是于确保仅一个拷贝整合至各宿主细胞的基因组中的条件下进行，则可进行整体式转染。该等方法的实例包括反转录病毒转导(retroviraltransduction)及原、生质3求体鬲虫合(sphaeroblastfusion)。可将构成所关注的变异核酸序列的文库的个别载体一起混合成单一组合物，或优选地，可将编码各文库成员的个别载体保持于各别组合物中或保持于组合物中文库的约5个至50个个别载体的混合物中。另一方式为使用分成于组合物中含有文库的约5个至50个个别载体的数部分的载体文库进行转染。优选地，文库的一部分由10个至20个个别载体构成。接着将各组合物转染至宿主细胞的等分试样中。将此方法称为半整体式转染。经转染的等分试样的数目将视文库大小及各部分中个别载体的数目而定。若文库(例如)由100个独特变异成员构成，该100个独特变异成员被分成于组合物中含有20个独特变异成员的数部分，则宿主细胞的5个等分试样将需要用构成原始文库的一独特部分的文库组合物转染。转染后选4奪宿主细胞的等分试样。优选分别地选择独特等分试样。然而，亦可在选择之前将其汇集。等分试样可针对其克隆多样性加以分析，且仅将具有足够多样性的彼等等分试样用于产生多克隆GOI文库原料。可在重组多克隆蛋白质制造开始之前产生多克隆细胞系的冷冻原料。为获得制造所要的多克隆细胞系，可在产生冷冻原料之前、在已自原料撷取后即刻或在短增殖及适应时间之后混合克隆。上文概述的制造策略的共有特征为构成重组多克隆蛋白质的所有个别成员可在一个容器或有限数目的容器(诸如生物反应器)中产生，最多约IO个容器。若需增加表达水平，则可使用针对DHFR基因或谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)基因、次黄噪呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthinphosphoribosyltransferase，hprt)或色胺酸合成酶基因的选择进行基因扩增。其需要使用包含该选择标记的载体。本发明的一特殊特征在于保持拷贝数相对较低以保持细胞稳定性较高。因此，优选仅使细胞在相对适度选择压力下在具有低浓度MTX(例如1-10nM)的无核苷培养基中针对实施例中所使用的构建体类型经受一轮选择。据信该适度选择压力产生相对较低的拷贝数。据信适度选择压力产生带来高表达水平同时避免具有极高拷贝数的细胞不稳定的平衡拷贝数。为达成较高表达水平，用于表达的细胞系优选包括能增强控制多克隆蛋白质表达的启动子的异源反式激活蛋白。反式激活蛋白与启动子的合适组合的实例于下表(表2)中提及。表2.反式激活蛋白/启动子对的实例反式激活蛋白启动子实例注释-度病毒Tat长末端重复序列(LTR)腺病毒E1AHCMV主要IE增强子/启动子单纯疱渗病毒VP16单纯疱瘆病毒基因启动子为IE175US6,635,478B型肝炎病毒X蛋白质(HBx)SV40早期合成锌指蛋白(SyntheticZn-fingerprotein)合成Sangamo公司SV40大T抗原SV40晚期启动子四环素控制的反式激活蛋白(tTA)合成合成融合人类细胞巨大病毒IE2p86HCMV主要IE增强子/启动子人类细胞巨大病毒IElp72HCMV主要IE增强子/启动子爱-巴病毒R反式激活蛋白(Epstein-BarrvimsRtransactivator，Rta)EBV启动子曱状腺激素受体生长激素启动子糖皮质激素受体乳腺胂瘤病毒(MMTV)启动子优选地，用编码反式激活蛋白的表达构建体转染细胞系且使用限制稀释或用于单细胞克隆的其它方法选择克隆。该表达载体可包含如本文对于表达载体所述的元件，诸如启动子、选择标记等。优选地，控制反式激活蛋白表达的启动子为组成性启动子，诸如延长因子1启动子、CMV启动子、金属硫蛋白-1启动子或类似启动子。在一优选具体实施方案中，启动子为CMV启动子。尤其优选为使用腺病毒E1A反式激活蛋白，其似乎除反式活化控制所关注基因表达的CMV启动子以外亦自身稳定细胞。如其它地方所提及，E1A表达在首先产生的细胞系ECHO中不可检测。因此，E1A与细胞稳定之间的联系尚未由本发明实验证实。对于制造各蛋白质成员包含两个以上多肽链的多克隆蛋白质而言，链的组合对其所形成的蛋白质的亲和力、特异性及活性可具重要性。例如，此对于抗体及TcR可见。举例而言，已知抗体可变重链与可变轻链的组合影响由该等链所形成的抗体的亲和力及特异性。因此，当抗体编码序列的文库已针对其产生对某靶标具亲和力的抗体的能力加以选择时，需要确保最终产物中可变重链与可变轻链的组合与之对应。出于此原因，优选将构成多克隆蛋白质的个别成员的多肽链置于用于整合的同一载体中，从而确保该等多肽链在整个过程中将保持于一起。或者，可用编码重链与轻链的同源对的表达载体对转染宿主细胞。以下描述为如何获得重组多克隆抗体表达细胞系的一实例。可构建用于组成性表达的具有两个置于相反转录方向(诸如由可变重链及整个K或人轻链围绕的头对头构造)的启动子的通用启动子盒，以允许整个构建体转移至包含选择标记及重链恒定区的载体中。预期亦可使用用于诱导性表达的启动子盒。此外，启动子可尾对尾置放，引起反向转录，或尾对头置放，用于单向转录。诱导性启动子亦可用于控制表达。转染后，优选于选择性条件下培养细胞以选择稳定转化体。可随后使此等条件下存活的细胞在不同培养系统中生长，该等培养系统为诸如习知小型培养瓶、Nunc多层细胞工厂、小型高产量生物反应器(MiniPerm，INTEGRA-CELLine)、震荡器及旋转瓶至中空纤维及生物反应器WAVE袋(WaveBiotech,Tagelswangen,Switzerland)或其它抛弃式器皿/容器。可使用ELISA针对抗体产生来测试该等细胞。多克隆细胞系优选是针对在选择压力下于无血清培养基中悬浮生长延长的时段的生存力来选择。《3,秀鍵^/^發W存("prw"va〃o"J一估根据本发明，确保表达系统中的多克隆性在生产期间不会严重改变使得有可能在多克隆性确实改变时停止生产通常很重要。根据本发明此目的通过监测变异核酸序列的相对表达水平来完成。表达水平可(例如)在mRNA层面上使用(例如)RFLP分析、数组或实时PCR来监测，或在蛋白质层面上使用(例如)二维聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱分析或各种层析技术来监测。使用此等技术，将可能建立一定数目的所有个别表达水平的基线值且接着在生产期间自培养物采集样本以判断表达水平是否已变化(整体上与相对地)。在本发明的正常实施中，可建立一定范围的围绕基线值的值，且若发现相对表达水平在该等范围以外，则终止生产。重邀/^i發我沐可使如上文所述产生的多克隆细胞系在适用于表达由插入细胞基因组中的变异核酸序列编码的所关注多克隆蛋白质的条件下于合适培养基中生长。细胞培养可以若干步骤进行。当使用哺乳动物细胞时，所选细胞优选适应在悬浮液中以及无血清条件下生长。适应在无血清培养基中生长亦可有利地在将针对多克隆细胞系所克隆的细胞系混合之前完成。适应可在一或两个步骤中在有或无选择压力下进行。优选地，使用允许在整个制造时段中在不损害所制造药品的纯度的情况下达成选择的选择系统。一般而言，对于制造医药用途的重组蛋白质而言，优选不使用(例如)抗生素或其它低分子量药物以提供选择压力，此是由于将需要确认最终产物不含有任何痕量的抗生素。当多克隆细胞系适应适当条件时，可开始扩大规模。此时，可将多克隆工作细胞原料(多克隆工作细胞库，pWCB)和/或多克隆主细胞库(pMCB)冷冻。优选地，使用介于30公升与100公升之间的生物反应器，但亦可使用更小(5-10公升)或更大(高达1,000、5,000、10,000、15,000公升，或甚至更大)的生物反应器。合适的生产时间及生物反应器尺寸选择视来自批料的蛋白质的所要产量及来自细胞系的表达水平而定。时间可在数天至三个月之间变化。可自细胞或上清液回收经表达的重组多克隆蛋白质。可根据熟习此项技术者已知的程序纯化及表征重组蛋白质。纯化程序的实例于下文列出。表征程序的实例可见于(例如)WO2006/007853中。,培##J:清^鍵化重纽,^歷蛋白I自培养物上清液分离特异性蛋白质可能使用各种层析技术，该等层析技术利用蛋白质的物理化学特性的差异，例如分子量、净电荷、疏水性或对特异性配位体或蛋白质的亲和力的差异。由此，可根据分子量使用凝胶过滤层析或根据净电荷使用离子交换(阳离子/阴离子)层析或替代地使用层析聚焦来分离蛋白质。类似地，可根据疏水性使用疏水相互作用或疏水电荷诱导层析或使用亲和层析利用对特异性固定配位体或蛋白质的亲和力的差异来分离蛋白质。因此，可通过各种层析原理的依序组合达成蛋白质的复杂混合物的分离。由此，最初可根据(例如)净电荷使用离子交换层析来分离蛋白质的混合物，且随后可根据分子量使用凝胶过滤层析或在高浓度的所选盐存在下使用疏水相互作用层析进行疏水性分离之后分离具有类似净电荷的蛋白质。与诸如离子交换层析、疏水相互作用及凝胶过滤之后续纯化步骤组合的亲和层析已常常用于自不同来源(例如腹水、细胞培养物上清液及血清)纯化IgG(多克隆以及单克隆)。分离是基于蛋白质与偶合至层析基质的特异性配位体之间的可逆相互作用的亲和纯化为一种简便快速的方法，其提供高选择性、通常高容量且浓缩至较小体积。蛋白质A与蛋白质G两种细菌表面蛋白质对抗体的Fc'区具有高亲和力且已以固定形式#L用于许多常*见应用，包括来自各种物种的多克隆IgG及其亚类的纯化及免疫复合物的吸收及纯化。继亲和层析之后，可进行下游层析步骤(例如离子交换和/或疏水相互作用层析)以移除宿主细胞蛋白质、泄漏蛋白质A(leakedProteinA)及DNA。作为最终纯化步骤的凝胶过滤可用于移除诸如二聚体及其它聚集体的污染分子，且将样本转移至储存緩沖液中。视来源及表达条件而定，可能有必要包括额外纯化步骤以达成所需抗体纯度。由此常常与蛋白质A层析及凝胶过滤层析组合使用疏水相互作用层析或离子交换层析以纯化治疗用途的抗体。为使纯化简便，优选地，多克隆抗体的所有成员共享重链和/或轻链的相同恒定区。为纯化其它种类的抗体，须使用替代亲和层析介质，此是由于蛋白质A及G不结合IgA及IgM。可使用免疫亲和纯化(与固相偶合的抗IgA或抗IgM单克隆抗体)，或替代地，可采用包括离子交换及疏水相互作用的多步纯化策略。錄淘,在诸如抗体及TcR的多克隆蛋白质的结构表征因混合物的复杂性(克隆多样性及糖基化)而需要高分辨率。诸如凝胶过滤、离子交换层析或电泳的传统方法可能不具有足够分辨率以区分个别抗体。二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)已被用于图谱分析(profiling)复杂蛋白质混合物，继之以质谱分析(MS)或液相层析(LC)-MS(例如蛋白质组研究(proteomics))。组合以蛋白质电荷及质量为基础的分离的2D-PAGE已证实适用于区分血清样本中的多克隆、寡克隆及单克隆免疫球蛋白。然而，此方法具有一些限制。层析技术、尤其毛细管及与电喷雾电离MS偶合的LC正日益应用于分析复杂肽混合物。LC-MS已用于表征单克隆抗体。极复杂样本的分析需要更高解析力的层析系统，此可通过二维(或更多维)分离获得。该方法可基于第一维中的离子交换及第二维中任选地与MS偶合的逆相层析(或疏水相互作用)。##志袭在例如可经由与对同一靶标具有特异性或具有类似活性的多克隆蛋白质的可比性研究(comparabilitystudies)来对一多克隆蛋白质进行功能表征。该等研究可于试管内以及活体内进行。多克隆抗体的体外功能表征可为(例如)免疫沉淀法，其为一种自粗细胞溶解产物分析性分离耙抗原的高度特异性技术。通过将免疫沉淀法与诸如SDS-PAGE的其它技术组合，继之以蛋白质染色(库马斯蓝(CoomassieBlue)、银染色或生物素标记)和/或免疫墨点法，有可能检测并量化抗原，且由此评估抗体的一些功能特性。尽管此方法未给出抗体分子数以及其结合亲和力的评估，但其提供耙蛋白质及由此特异性的观测。此方法亦可用于监测表达过程期间抗体对抗原的潜在差异(克隆多样性的完整性)。多克隆抗体的体内功能表征可为(例如)感染研究。例如可用针对其已开发出多克隆抗体的特异性病毒感染诸如小鼠的实验动物。感染可被抑制的程度将指示多克隆抗体的功能性。治l纽合參在本发明的一具体实施方案中，包含作为活性成份的选自免疫球蛋白超家族的重组多克隆蛋白质的医药组合物意欲治疗或预防哺乳动物的疾病。在本发明的一优选具体实施方案中，医药组合物包含作为活性成份的重组多克隆抗体或抗体片段及医药学上可接受的赋形剂。在本发明的另一优选具体实施方案中，医药组合物包含作为活性成份的重组多克隆T细胞受体或T细胞受体片段及医药学上可接受的赋形剂。本发明的医药组合物是以本身已知的方式制备，例如藉助于习知溶解、冻干、混合、粒化或调制(confectioning)过程。医药组合物可根据习知医药规范来调配(参见，例如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(第20版),A.R.Gennaro编，2000,LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,PA及EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology,J.Swarbrick及J.C.Boylan编，1988-1999,MarcelDekker，NewYork,NY)。优选使用活性成份的溶液，亦及悬浮液，及尤其等渗水溶液或悬浮液，这些溶液或悬浮液有可能于使用前产生，例如在包含单独或连同载剂(例如甘露糖醇)一起的活性成份的冻干组合物的状况下。医药组合物可为无菌的和/或可包含赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐和/或緩沖剂，且以本身已知的方式制备，例如藉助于习知溶解或冻千过程。这些溶液或悬浮液可包含增教物质，诸如羧甲基纤维素钠、羧曱基纤维素、葡聚糖、聚乙烯吡咯啶酮或明胶。注射组合物是于无菌条件下以常规方式制备；上述方式亦适用于将组合物引入安瓿或小瓶中且将容器密封。医药组合物可包含约1%至约95%、优选约20%至约90%的活性成份。本发明的医药組合物可(例如)呈单位剂型，诸如呈安瓿、小瓶、栓剂、糖衣药丸、片剂或胶嚢的形式。本发效的逸合*的治^途本发明的医药组合物可用于治疗、改善或预防哺乳动物的疾病。可用本发明医药组合物治疗的疾病包括癌症、传染病、发炎疾病、过敏、哮喘及其它呼吸道疾病、自体免疫疾病、心血管疾病、中枢神经系统疾病、代谢及内分泌疾病、移植排斥反应及非期待怀孕(undesiredpregnancy)。本发明的一方面为动物疾病治疗、改善或预防的方法，其中投予有效量的重组多克隆抗体或抗体片段。在又一方面中，投予有效量的重组多克隆T细胞受体或T细胞受体片段。本发明的又一方面为重组多克隆抗体或重组多克隆丁细胞受体或抗体或T细胞受体的片段的用途，其用于制备治疗选自由以下疾病組成的组的疾病的组合物癌症、传染病、发炎疾病、过敏、啤喘或其它呼吸道疾病、免疫失调、自体免疫疾病、心血管疾病、中枢神经系统疾病、代:射疾病、内分泌疾病、移植排斥反应及非期待怀孕。,游,途及尿裙U^逸本发明的另一具体实施方案是针对诊断试剂盒及环境检测用的试剂盒以及使用此等试剂盒的方法。本发明的试剂盒包含根据本发明所制备的重组多克隆蛋白质，该蛋白质可经可检测标记标记或未经标记用于非标记才全测。若经标记，则可将本发明重组多克隆蛋白质添加至怀疑含有靶分子的样本中，且标记存在与否指示靶分子存在与否。待测试的样本可为体液样本，诸如血液、血清、血浆、脊髓液、淋巴液或尿液，或非哺乳动物样本，诸如来自怀疑藏有污染物的环境源的样本。非哺乳动物样本可为水、空气、或受污染土壤。非标记检测涵盖对结合后BIAcore中的折射变化的测量，其中重组多克隆蛋白质用于捕捉靶分子。实施例以下实施例用于说明本发明，4旦不应#见为限制本发明的范畴。实施例1表达抗体的CHO细胞克隆衍生4这裁#所使用的IgG表达载体如图2a中所示。E1A表达载体如图2b中所示。《好應屑所<吏用的纟田月包系为获自LawrenceChasin,ColumbiaUniversity(亦可购自Gibco，目录号12613-014)的DHFR-阴性CHO细胞系DG44的衍生物。在载体pcDNA3.1十(目录号V790-20，Invitrogen)中用5型&良病毒反式激活蛋白E1A(NCBI寄存编号AY339865,cDNA序歹'J:gctgtgga3tgtatcgaggacttgcttaacg3gcctgggca3cctttgg3cttg3gctgta33cgcccc3ggcc3t3a)的13S型式的cDNA转染DG44细胞。用500pg/ml浓度的遗传霉素(Geneticin)(Invitrogen)选4奪转染物。选择后，通过限制稀释对细胞进行单细胞克隆。通过用抗体质粒(上文所示)瞬间转染针对CMV启动子的反式活化(表达改良)来测试克隆。单一克隆显示瞬间鉴定中的表达水平与未经转染的DG44细胞系相比改良达3倍。表达水平增加并非实际反式活化的证据，且可能通过选择尤其高度表达的亚克隆而引起。在以稳定转染进行的比较中，所选池与野生型DG44细胞系相比，显示表达水平增加4-5倍。对此克隆(称为ECHO)进行两次亚克隆且其似乎关于CMV启动子的反式活化(表达改良)为稳定的。未测量CMV启动子的实际反式活化，但克隆仍显示在CMV启动子控制下抗体的稳定高表达。戎谬4这,在如上文所示构建所使用的抗体表达质粒。出于此目的，选择6个针对不同牛痘病毒表面蛋白质的不同抗体。选自该等抗体的原因在于，其每一者在离子交换层析中都具有极具特征性图谱，使得在不同抗体的混合物中鉴别及量化成为可能。该等抗体(公开于2006年12月4日申请的同在申请中的PCT/DK2006/000686中，题为rAnti-orthopoxvirusrecombinantpolyclonalantibodyJ,以WO2007/065433公开)为Sym002-037(克隆002-037Sym002-186克隆002-186Sym002-235(克隆002-235Sym002-286克隆002-286Sym002-303(克隆002-303Sym002-482丄r/兄l塗002-482由夹心ELISA测量IgG。简言的，用山羊抗人Fc(SerotecSTAR106)涂布96孔盘(Maxisorp,NUNC)，接着与样本及标样(经纯化的人类单克隆IgG1k抗体)一起培育。用与辣根过氧化酶(SerotecSTARIOOP)结合的山羊抗人k轻链进行检测。将ECHO细胞以含核苷(Invitrogen,目录号32571)与10%胎牛血清(FCS)(Invitrogen)的MEMa培养基以0.30x106个细胞/瓶的密度接种于T80瓶中。自接种起一小时内，用Fugene6(Roche)转染细胞将10piFugene6与490pi杜贝卡氏改良依格氏培养基(Dulbecco'smodifiedEagle'smedium)混合且在室温下培育5分钟添加5表达质粒且将混合物在室温下再培育15分钟将混合物添加至细胞培养瓶中第二天，抽出含转染试剂的培养基，将各瓶用5ml含10%经透4斤FCS(Invitrogen)的MEMai咅养基(无核苷)(MEMa-)洗涤一次，且添加10ml相同培养基以及2nM浓度的曱胺喋呤。其后，每周两次更换培养基。15天后，使细胞胰蛋白酶化且将所有细胞转移至新瓶。再培养2天后，更换培养基且第二天抽出(aspirated)培养基，对细胞计数且在IgGELISA中测量生产力。结果如表3中所示。生产力是以皮克/细胞/天为单位使用收集时的细胞数来计算。<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>1.使细胞胰蛋白酶化且对其计数2.将l-5xl06个细胞吸入无菌FACS管中3.在4°C下以250g将细胞向下旋转1分钟且移除上清液4.在2ml无菌FACSPBS(PBS+2%FCS)中洗涤细胞(5ml)5.以100pi经稀释抗体(Ab)/106个细胞以1:20稀释的山羊F(ab)2片段抗人IgGH+L-PE(Beckman-Coulter,IM1626)将细胞染色且培育20min(4°C下于黑暗中)6.在2mlFACSPBS中将细胞洗涤两次(5ml)7.再悬浮于FACSPBS中达l-5xloVml(2ml)8.添加石典化丙咬，10jug/ml1:100i殳定适当门且4吏用FACS-Aria(Beckton-Dickinson)将细胞单细胞分选至96孔盘中(5个盘/抗体)。约1周后，由显微镜检查孔中是否存在单一克隆。约2周后，各自于单一稀释液中由ELISA鉴定来自具有单一克隆的孔中的上清液，且基于ELISA值及对孔的视觉检查，选择24个呈现各抗体的克隆用于继续培养。利用对细胞数及形态的视觉观察结合针对抗体表达水平的选择来选择克隆。进一步在耗尽鉴定中测试所选克隆简言的，将细胞接种至24孔盘中且使其生长直至多数细胞死亡为止。由ELISA鉴定上清液且选择前10个针对各抗体的克隆以适应无血清悬浮培养。这#无清羞浮培使细胞胰蛋白酶化且对其计数。将5x106个细胞离心且再悬浮于10mlProCH04无血清培养基(Cambrex)中。将细胞转移至50ml纟田胞培养管(TRP，Switzerland)且在37°C下于震荡器上培育。每周两次对细胞密度计数且每次将培养物稀释至0.5xl06个细胞/毫升(头两周)或稀释至0.3xl06个细胞/毫升(其余时段)。4-5周后，多数克隆的倍增时间接近30小时，届时将其视为适应无血清培养。适应时段结束时，由ELISA鉴定细胞，冷冻于含10%DMSO的培养基中且用于表达实验(参见下文实施例2)。实施例2表达实验为测试混合培养物经长时间的组成稳定性，制备许多克隆混合物。基于适应时段期间所进行的计数，尽可能将倍增时间考虑在内。小心匹配具有类似倍增时间的克隆。总共制备9个混合物混合物1-5:在每一混合物中使用针对各抗体的单一克隆混合物6:各抗体使用2个克隆混合物7:各抗体使用5个克隆混合物8:各抗体使用3个克隆混合物9:使用所有可用克隆_各抗体5-7个将克隆混合使得呈现各抗体的细胞数(对于1-7个克隆的各抗体)构成混合物中细胞总数的1/6。如实施例1中所述在50ml培养管中进行实验。所使用的培养基为ProCH04且总培养体积为10ml。实验以0.3x106个细胞/毫升的浓度开始。每周两次以3及4天时间间隔将培养物稀释至0.3\106个细胞/毫升。每周一次采集样本用于ELISA及离子交换层析分析。第4天采集第一样本且第35天采集最终样本。9个混合物的ELISA值如图3中所示。自开始至结束所计算的细胞分裂数在混合物中自约25至约27不等。其意谓若如所述每周两次稀释培养物但每次保持完整体积，则最后总体积将在43,000公升与152,000公升之间不等。工业上大规模哺乳动物细胞培养物典型地高达15,000公升，其意谓此处关于培养时间及代数所述的混合实验为工业规模中培养物的合理模拟。似乎细胞生产力经5周的时段相对恒定，其中一些混合物中有下降的趋势。/gG效合#为、浙将5-10ml0.22pm经过滤的培养基上清液加载至1mlMabSelectSure管柱(GEHealthcare)上。如制造商所述用10mlPBS(pH7.4)洗涤且用0.1M甘胺酸(pH2.7)洗脱管柱。将所汇集的蛋白质物质针对40mMNaCl、50mM乙酸钠(pH5.0)透析两次且通过在280nm下测量吸光度来测定总IgG浓度。将60(igIgG混合物加载至来自PolyLC的弱阳离子交换管柱PolyCatA(100x4,6mm，3pm,1500A)上。通过以1ml/min的流速经72分钟施加于乙酸钠(pH5.0)緩沖液中的150至500mMNaCl的梯度来洗脱蛋白质。监测洗脱液的215nm吸光度且通过信号整合测定个别IgG的相对量。图3显示MabSelect纯化后来自混合物8的第一及最终收集物的IgG组成的阳离子交换分析的层析图。如所见，个别Ab被良好分离，其中四者具有基线分离。因此，UV信号整合给出样本中相对IgG浓度的极准确测定。如上文所述分析所有混合物且计算各混合物中各抗体的含量。于开始样本中见到6个不同抗体之间相当均一的分布。所见的差异可反映混合物中所使用的克隆之间的不同表达水平。各样本的抗体含量如图5中所图示。令人惊讶地，所有抗体皆可在所有最终样本中被明确鉴别。亦可见在具有一个以上呈现各抗体的单一克隆的混合物(混合物6-9)中，在最终样本中存在抗体更均一分布的趋势。实施例3:ECHO中E1A的表达为研究ECHO中E1A的表达，通过用SYBR绿色(SYBRgreen)进行定量反转录实时PCR(qRT-PCR)来测定ElAmRNA的含量。qRT-PCR方法是基于靶序列的PCR扩增。在DNA结合染料SYBR绿色存在下进行PCR,其中SYBR绿色在与双链DNA结合时发射绿光。由此允许在每一轮扩增后实时量化双《连DNA。当双链DNA的量较低时，在PCR之初，不能将来自经结合SYBR绿色的信号与背景噪声作出区分。然而，在扩增过程期间，信号增加超过噪声，且可追踪双链DNA的产生。以此方式，可基于SYBR绿色信号跨越特定临限值所需的周期来测定最初存在于样本中的靶标的相对量。达到临限值的准确点为Ct值，其可用于初始靶标量的相对比较。材料及方法如制造商所推荐，使用来自Qiagen的RNeasyMini试齐寸盒目录号74104自3.0E+06ECHO及Hek293纟田胞提取总RNA。叶吏用来自Agilent的2100Bioanalyzer系统以真核细胞总RNANano系歹'JII鉴定液(EukaryoteTotalRNANanoSeriesIIassay)来测定RNA样本的浓度及完整性。将完整性测定为介于1-10之间的RNA完整值(RIN)，其中1表示已降解而10表示完整RNA。ECHORNA具有9.5的RIN且HEK293具有8.9的RIN。使用来自Qiagen的QuantiTect反转录试剂盒目录号205311、使用800ngRNA作为开始物质制得各样本的cDNA。将Hek293cDNA稀释25倍，而将ECHOcDNA稀释两倍。使用来自Stratagene的SYBR亮绿色QPCR主混合物(BrilliantSYBRGreenQPCRMasterMix)目录号600548在StratageneMx3005P上进行qRT-PCR。热循环条件在95。C下保持10min;40个周期，在95。C下15s变性，在60°C下1min黏接，且在72°C下30s延长；在55-95。C下解链曲线分析。所使用的引子(ElA-696bpF:5'-TGACTCCGGTCCTTCTAACACA-'3,ElA-772bpR:5'-TCACGGCAACTGGTTTAATGG-'3)草巴向ElA基因的3'端的77bp片段。结果使用qRT-PCR鉴定分析ECHO细胞中E1A的表达且显示ElAmRNA在此鉴定中不可扩增及检测，强有力地说明ECHO细胞系不表达ElA蛋白质。使用人类293细胞系作为阳性对照，其是由腺病毒DNA的片段转化且已知以相对高量表达ElA。qRT-PCR在Hek293样本中显示扩增，阳性对照Ct=18.74，但在无模板对照(NTC)中及在ECHO样本中均未见到扩增。样本CtHek29318.74ECHO无CtNTC无Ct实施例4:制备供生物反应器实验用的细胞库为能进行组成稳定性研究的生物反应器实验，制备主细胞库及工作细胞库。对于实验而言，使用如实施例1中所述的表达6个不同抗体的ECHO细胞的克隆。所使用的克隆已适应在培养基ProCH04中无血清悬浮培养。_i勿岸将克隆解冻且于悬浮培养物中恢复一定时段。根据以下说明自指数生长中的细胞制备4个混合的主细胞库当细胞处于对数生长中时将其冷冻使所有6个抗体呈现于各细胞库中将呈现各抗体的同等细胞数混合混合物1A-3A含有单一克隆/抗体混合物4A含有3个克隆/抗体每种混合物冷冻10个各含有20x106个纟田胞的安瓿冷冻培养基含10%DMSO的培养基(ProCH04)工#勿應岸每种混合物解冻一个冷冻安瓿。将混合物于培养物中保持8-10天，随后制备工作细胞库当细胞处于对数生长中时将其冷冻每种混合物冷冻10个各含有20x106个纟田胞的安吾瓦冷冻培养基含10%DMSO的培养基(ProCH04)实施例5:生物反应器中的组成稳定性工作细胞库的每种混合物解冻一个冷冻安瓿且将细胞作为菌种(seedtrain)于培养物中保持14天，届时开始生物反应器培养使用各菌种以250ml开始培养基(ProCH04+5mM谷氨酰胺+1/100非必需氨基酸)以0.6x106个细胞/毫升接种两个生物反应器。在以补料培养基(feedmedium)(ProCH04+6g/L葡萄糖+5mM谷氨酰胺+1/100非必需氨基酸)接种后自第2天至第14天进行补料培养，在第16天收集时体积为约585ml。在DASGIP生物'反应器(单元1-8)中控制以下参数表4.一般生物反应器过程参数<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>每天采集5ml样本用于生存力、活细胞数、IgG产生及代谢物分析。所有培养皆如关于生存力及活细胞数所预期以相同方式进行。再采集10ml用于通过离子交换层析分析自菌种(第9天及第14天)且自各生物反应器(单元1-8)在将安瓿解冻后第20天、第24天、第28天及第30天分析IgG组成。如上文实施例2所述进4亍IgG组成分析。如上文所述分析所有混合物且计算4个混合物的各样本中各抗体的含量。来自培养物的IgG的总产量处于约150至250mg/L的范围内。各样本的抗体含量如图5中所图示。令人惊讶地，所有抗体皆可在所有样本中被明确鉴定。组合物看似稳固，经14天菌种培养、接着16天生物反应器运作期间，克隆中无一者丧失或过剩。组合物(composition)视输入克隆而不同。通过选择混合物的特异克隆以确定最终产物中个别抗体的相对分布亦似乎为可能的。权利要求1.一种产生能表达包含2个至n个独特成员的多克隆蛋白质的多克隆细胞系的方法，该方法包含a)提供表达载体组，其中所述载体中的每一个包含编码该多克隆蛋白质的独特成员(distinct)的独特核酸的至少一个拷贝；b)在避免所述表达载体位点特异性整合至宿主细胞的基因组中的条件下用所述表达载体中的每一个分别地转染所述细胞，从而获得细胞的2个至n个组合物，各组合物表达该多克隆蛋白质的一个独特成员；c)将细胞的该2个至n个组合物混合以获得多克隆细胞系。2.权利要求1的方法，其中所述表达载体为游离型载体(episomalvector)。3.权利要求1的方法，其中所述表达载体是稳定且随机地整合至所述宿主细胞的一或多个染色体中。4.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤b)中所获得的所述经转染细胞是克隆的。5.权利要求4的方法，其中所述细胞是使用FACS克隆进行克隆的。6.权利要求4或5的方法，其中克隆是针对至少一个选自由以下各项组成的组的标准来选择生长速率、倍增时间、表达水平、产生水平、随时间的产生稳定性、生存力、耐性、稳固性、形态及拷贝数。7.权利要求6的方法，其中克隆是针对关于该至少一个标准的均一性来选择。8.权利要求7的方法，其包含针对关于倍增时间及表达水平的均一性来选择。9.权利要求4-8中任一项的方法，其中一个以上克隆是针对各独特多克隆蛋白质成员来选择。10.权利要求9的方法，其中2个克隆是针对各独特多克隆蛋白质成员来选择，或其中选择3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个或100个克隆。11.前述权利要求任一项的方法，其中表达不同独特成员的细胞的所述组合物以1:1比率混合。12.前述权利要求1-10任一项的方法，其中细胞的所述组合物以不同于1:1比率的比率混合。13.前述权利要求任一项的方法，其中所述表达载体除该多克隆蛋白质的编码序列的变化以外皆相同。14.前述权利要求任一项的方法，其中转染前所述宿主细胞来源于一个克隆。15.前述权利要求任一项的方法，其中该多克隆蛋白质为多聚体蛋白质。16.权利要求15的方法，其中一个表达载体编码一个独特多克隆蛋白质成员的所有亚单元。17.权利要求15的方法，其中步骤a)中的该组表达载体由两个或两个以上表达载体亚组构成，其中第一亚组包含编码该蛋白质的一个亚单元的变异核酸序列，且第二亚组包含编码该蛋白质的另一个亚单元的变异核酸序列，使得各转染是以来自该第一亚组的成员及该第二亚组表达载体的成员进行。18.前述权利要求任一项的方法，其中该表达载体或又一表达载体编码可选标记。19.权利要求18的方法，其中细胞是于有利于表达该可选标记的细胞生长的条件下连续培养。20.权利要求18的方法，其中该可选标记包含该宿主细胞所缺乏的基因产物。21.权利要求18的方法，其中该可选标记是由亦编码多肽成员或该多肽成员的亚单元的转录物编码，优选地，其中该可选标记是由编码最大亚单元的转录物编码。22.前述权利要求任一项的方法，其中该多克隆蛋白质与所述宿主细胞并不天然相关。23.前述权利要求任一项的方法，其中该多克隆蛋白质为多克隆抗体或多克隆抗体片段。24.权利要求16的方法，其中步骤a)中的该组表达载体由两个表达载体亚组构成，其中第一亚组包含编码抗体重链的变异核酸序列，且第二亚组包含编码抗体轻链的变异核酸序列，使得各转染是以来自该第一亚组的成员及该第二亚组表达载体的成员进行。25.权利要求23的方法，其中所述多克隆抗体具有重链或轻链的相同恒定区，优选具有重链的相同恒定区。26.权利要求1-22中任一项的方法，其中该多克隆蛋白质为多克隆T细胞受体或多克隆T细胞受体片段。27.前述权利要求任一项的方法，其中所述宿主细胞为原核的。28.前述权利要求l-26任一项的方法，其中所述宿主细胞为真核的。29.权利要求28的方法，其中所述真核细胞选自由植物、酵母、真菌、脊推动物或无脊推动物组成的组。30.权利要求28的方法，其中所述真核细胞选自由中国仓鼠卯巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤细胞(例如Sp2/0细胞、NS0、YB2/0)、NIH3T3、成纤维细胞或包括海拉细胞(HeLacell)、HEK293细胞或PER.C6的永生化人类细胞组成的组。31.权利要求28的方法，其中该宿主细胞表达能使编码该多克隆蛋白质表达的启动子反式活化的重组反式激活蛋白。32.—种制造多克隆蛋白质的方法，该方法包含a)提供使用权利要求1-31任一项的方法所获得的多克隆细胞系；b)在允许表达该多克隆蛋白质的条件下培养该多克隆细J包系；及c)自所述细胞或培养基回收及任选地纯化该多克隆蛋白质。33.权利要求32的方法，其中所述经混合的组合物是于诸如震荡瓶、抛弃式生物反应器、生物反应器的容器中培养。34.权利要求33的方法，其中一个表达该多克隆蛋白质的独特成员的一个群体的多克隆细胞系是于一容器中培养，且表达该多克隆蛋白质的独特成员的第二群体的至少第二多克隆细胞系是于第二容器中培养，且来自各容器的该多克隆蛋白质于纯化之前或之后混合。35.权利要求32-34任一项的方法，其进一步包含验证在该经回收及任选地经纯化的多克隆蛋白质中独特成员中的每一者是否存在的步骤。36.—种包含2个至n个细胞群体的多克隆细胞系，各群体表达重组多克隆蛋白质的独特成员，所述细胞包含至少一个随机整合至基因组中的表达构建体。37.权利要求36的多克隆细胞系，其中该至少一个表达构建体被整合至一或多个染色体中。38.权利要求36或37的多克隆细胞系，其中n为3个或3个以上，诸如4个或4个以上，例如5个或5个以上，诸如6个或6个以上，例如7个或7个以上，诸如8个或8个以上，例如9个或9个以上，诸如10个或10个以上，例如11个或11个以上，诸如12个或12个以上，例如13个或13个以上，诸如14个或14个以上，例如15个或15个以上，诸如16个或16个以上，例如17个或17个以上，诸如18个或18个以上，例如19个或19个以上，i者如20个或20个以上，例如21个或21个以上，诸如22个或22个以上，例如23个或23个以上，诸如24个或24个以上，例如25个或25个以上，诸如26个或26个以上，例如27个或27个以上，t者如28个或28个以上，例如29个或29个以上，-渚如30个或30个以上，例如35个或35个以上，i者如40个或40个以上，例如45个或45个以上，诸如50个或50个以上，例如60个或60个以上，诸如70个或70个以上，例如80个或80个以上，i者如90个或90个以上，例如100个或100个以上。39.权利要求36-38任一项的多克隆细胞系，其中n小于50,i者如小于45，例如小于40,i>如小于35,例如小于30。40.权利要求36-39任一项的多克隆细胞系，其中表达该重组多克隆蛋白质的一个独特成员的细胞来源于1个或1个以上经克隆的细胞，诸如2个或2个以上，例如3个或3个以上，i者如4个或4个以上，例如5个或5个以上，i者如6个或6个以上，例如7个或7个以上，诸如8个或8个以上，例如9个或9个以上，诸如10个或10个以上，例如11个或11个以上，诸如12个或12个以上，例如13个或13个以上，i者如14个或14个以上，例如15个或15个以上，诸如16个或16个以上，例如17个或17个以上，诸如18个或18个以上，例如19个或19个以上，诸如20个或20个以上，例如21个或21个以上，诸如22个或22个以上，例如23个或23个以上，诸如24个或24个以上，例如25个或25个以上，诸如26个或26个以上，例如27个或27个以上，诸如28个或28个以上，例如29个或29个以上，诸如30个或30个以上，例如35个或35个以上，诸如40个或40个以上，例如45个或45个以上，i者如50个或50个以上，例如60个或60个以上，诸如70个或70个以上，例如80个或80个以上，-漆如90个或90个以上，例如100个或100个以上。41.权利要求36-40任一项的多克隆细胞系，其中该多克隆蛋白质为多聚体蛋白质。42.权利要求41的多克隆细胞系，其中各表达构建体编码多聚体蛋白质的亚单元。43.权利要求41或42的多克隆细胞系，其中所述亚单元的表达是于相同或相似启动子的控制之下。44.权利要求36-43任一项的多克隆细胞系，其中所述表达构建体编码可选标记。45.权利要求44的多克隆细胞系，其中该可选标记是由亦编码多肽成员或该多肽成员的亚单元的转录物编码。46.权利要求36-45任一项的多克隆细胞系，其中该多克隆蛋白质与所述宿主细胞并不天然相关。47.权利要求36-46任一项的多克隆细胞系，其中该多克隆蛋白质为多克隆抗体或多克隆抗体片段。48.权利要求47的多克隆细胞系，其中该组表达载体由两个表达载体亚组构成，其中第一亚组包含编码抗体重链的变异核酸序列，且第二亚组包含编码抗体轻链的变异核酸序列，使得各转染是以来自该第一亚组的成员及该第二亚组表达载体的成员进4亍。49.权利要求47或48的多克隆细胞系，其中所述多克隆抗体的所有成员皆具有相同同型(isotype)。50.权利要求36-46任一项的多克隆细胞系，其中该多克隆蛋白质为多克隆T细胞受体或多克隆T细胞受体片段。51.权利要求36-50任一项的多克隆细胞系，其中所述宿主细胞为原核的。52.权利要求36-50任一项的多克隆细胞系，其中所述宿主细胞为真核的。53.权利要求36-52任一项的多克隆细胞系，其中所述细胞包含稳定整合表达构建体，该表达构建体编码能使编码该多克隆蛋白质的所述成员的启动子反式活化的反式激活蛋白。54.—种DHFR阴性CHO细胞，其包含编码与组成性启动子以可操作方式连接的5型腺病毒反式激活蛋白E1A的稳定整合核酸。55.权利要求54的细胞系，其中该细胞系来源于DG44细胞系。56.权利要求54或55的细胞系，其中该细胞系进一步包含编码所关注多肽的稳定整合表达构建体的至少一个拷贝。57.权利要求56的细胞系，其中该所关注多肽为多聚体蛋白质，优选地，其中该多聚体蛋白质为抗体。58.权利要求56或57的细胞系，其中编码该所关注多肽的表达构建体另外编码dhfr。59.权利要求58的细胞系，其中dhfr及该所关注多肽的至少一个亚单元是由同一转录物编码，优选地，其中dhfr是由编码最大亚单元的转录物编码。60.权利要求56-59任一项的细胞系，其中该所关注多肽的表达是由一或多个可由E1A反式活化的启动子控制，优选地，其中该启动子为CMV启动子或来源于CMV启动子。全文摘要本发明是关于一种用于制造重组多克隆蛋白质组合物、尤其重组多克隆抗体组合物的方法。该方法包含获得经变异核酸序列集合转染的细胞集合，其中集合中的各细胞经转染且能表达集合的一个成员，该成员编码多克隆蛋白质的独特成员。将该等细胞在适合于表达多克隆蛋白质的条件下培养，该多克隆蛋白质获自细胞或培养物上清液。藉由用载体集合转染将核酸序列引入细胞中。本发明方法适合于制造治疗用途的重组多克隆抗体。文档编号C07K16/00GK101688204SQ200880017438公开日2010年3月31日申请日期2008年5月21日优先权日2007年5月25日发明者克里斯琴·穆勒,安妮·B·托尔斯特拉普,拉斯·S·尼尔森,芬恩·威伯格,迪特玛·韦尔古尼申请人:西福根有限公司