79] 1.配方
[0180] 每剂量（0. 5ml)中含实施例4中吸附后的PT抗原、FHA抗原、PRN抗原和吸附后的 白喉类毒素、破伤风类毒素分别如下所示：
[0181] 表8、组分百白破疫苗配方
[0182]
[0183] 2?合并及稀释
[0184] 室温，搅拌下，将吸附后的PT、FHA、Prn、白喉类毒素、破伤风类毒素原液加入稀释 液中，调节pH值至5. 8~7. 2,继续搅拌不低于1小时。
[0185] 3?效价和毒性检测
[0186] 3. 1效价测定
[0187] 3. 1. 1无细胞百日咳疫苗
[0188] 按《中华人民共和国药典》（2010年版三部）中"吸附百白破联合疫苗"附录2进 行。以适宜的稀释倍数稀释至第一个免疫剂量，再按5倍系列稀释。免疫时间为21天。每 一次人用剂量的免疫效价应不低于4. 0IU;且95%可信限的低限应不低于2. 0IU。如达不到 上述要求时可进行复试，但所有有效试验的结果必须以几何平均值（如用概率分析法时， 应用加权几何平均）来计算。达到上述要求即判为合格。
[0189] 3. 1.2白喉疫苗
[0190] 按《中华人民共和国药典》(2010年版三部）附录XI C进行，每一次人用剂量中白 喉类毒素的免疫效价应不低于30IU。
[0191] 3. 1.3破伤风疫苗
[0192] 按《中华人民共和国药典》（2010年版三部）附录XI B进行。每一次人用剂量中 破伤风类毒素的免疫效价应不低于40IU。
[0193] 3. 2特异性毒性试验
[0194] 3. 2. 1无细胞百日咳疫苗
[0195] 毒性参考品购自中国食品药品检定研究院（批号为第一批），按照每批标示进行 稀释，将本实施例制备的百白破疫苗稀释至与成品相同浓度。用体重14~16g NIH小鼠 (雌性或雌雄各半），毒性参考品的每一稀释度和供试品各用一组，每组至少10只，每只小 鼠腹腔注射0. 5ml，分别进行3. 2. 1. 1-3. 2. 1. 3项试验，应符合规定。
[0196] 3. 2. 1. 1小鼠体重减轻试验
[0197] 于注射前和注射后16~18小时分别称取小鼠体重，试验结果经统计学方法处理 后，注射供试品的小鼠体重减轻毒性的活性应不高于l〇BWDU/ml。
[0198] 3. 2. 1. 2小鼠白细胞增多试验
[0199] 于注射后3日分别取小鼠末稍血进行白细胞计数。试验结果经统计学方法处理 后，注射供试品的小鼠白细胞增多毒性的活性应不高于〇. 5LPU/ml。
[0200] 3. 2. 1. 3小鼠组胺致敏试验
[0201] 于注射后4日，每只小鼠腹腔注射0. 5ml含二盐酸组织胺4mg或二磷酸组织胺2mg 的溶液，30分钟后分别测小鼠肛温。试验结果经统计学方法处理后，供试品的小鼠组胺致敏 毒性的活性应不高于〇. 8HSU/ml，且无动物死亡。
[0202] 3. 2. 2白喉、破伤风疫苗
[0203] 用体重250~350g豚鼠，每批制品不少于4只，每只腹部皮下注射2.5ml，分两 侧注射，每侧1. 25ml，观察30天。注射部位可有浸润，经5~7天变成硬结，可能30天不 完全吸收。在第10天、第20天、第30天称体重，到期体重比注射前增加，局部无化脓、无坏 死、无破伤风症状及无晚期麻痹症者为合格。
[0204] 3. 3毒性逆转试验
[0205] 每批供试品置37°C 4周，按3. 2. 1. 3项进行，应符合规定。
[0206] 检测结果参加表9所示，完全符合《中华人民共和国药典》三部（2010年版）的规 定：
[0207] 表9、组分百白破疫苗效价与特异性毒性检测结果
[0208]
[0209]
[0210] 上述实施例的疫苗抗原配比为优选比例，其每剂各组分抗原含量可在以下区间选 择：
[0211] PT 抗原 10-40yg ;FHA 抗原 5-40yg ;PRN 抗原 l-15yg ;白喉类毒素 10-30Lf ;破 伤风类毒素l-l〇Lf。
[0212] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限定。凡 本领域的技术人员利用本发明的技术方案对上述实施例做出的任何等同的变动、修饰或演 变等，均仍属于本发明技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种无细胞百日咳疫苗，其特征在于： 包含百日咳鲍特氏杆菌（Bordetella pertussis)液体培养物上清部分的PT抗原和 FHA抗原以及百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体部分的PRN抗原。2. 根据权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗，其特征在于： 采用过氧化氢、甘油、尿素混合作用于PT抗原和FHA抗原进行脱毒，其中过氧化氢作为 脱毒剂，甘油作为抗聚集剂，尿素作为保护剂。3. 根据权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗，其特征在于： 所述疫苗按照每剂含PT抗原10-40 y g、FHA抗原5-40 y g、PRN抗原1-15 y g的抗原含 量配制。4. 一种百日咳-白喉-破伤风联合疫苗，其特征在于： 所述联合疫苗的抗原包括如权利要求1所述的无细胞百日咳疫苗的抗原以及白喉类 毒素和破伤风类毒素。5. 根据权利要求4所述的联合疫苗，其特征在于： 所述联合疫苗抗原的含量为每剂含PT抗原10-40 y g ;FHA抗原5-40 y g ;PRN抗原 1-15 y g ;白喉类毒素10-30Lf ;破伤风类毒素I-IOLf。6. -种采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征在于： 采用过氧化氢分别脱毒百日咳鲍特氏杆菌Bordetella pertussis液体培养物上清部 分的PT抗原和FHA抗原，其包括如下步骤： a) 置换纯化后的PT抗原和FHA抗原缓冲体系，采用摩尔浓度为20-200mmol/L的磷酸 盐、碳酸盐或醋酸盐作为缓冲盐水，将pH值调节到7. 0-9. 0 ; b) 将步骤a中置换缓冲体系后的抗原稀释至100-500 y g/ml ; c) 在步骤b稀释后的抗原中加入抗聚集剂甘油和稳定剂尿素，使甘油终体积浓度达到 10% (V/V)-60% (V/V)，尿素终摩尔浓度达到l-2mol/L; d) 在步骤c后加入终浓度为0. 5% (W/V)-l. 5% (W/V)的过氧化氢，将缓冲体系pH值 调至 7. 0-9. 0 ; e) 在20-40°C条件下，脱毒2-5小时； f) 通过透析或超滤方式去除过氧化氢，完成脱毒，除菌过滤。7. 根据权利要求6所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征在 于： 所述步骤a中采用超滤方式置换缓冲体系，采用浓度为lOOmmol/L的磷酸盐缓冲盐水， 将体系pH值调节为8.0。8. 根据权利要求6所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征在 于： 所述步骤b中的抗原稀释至250 y g/ml。9. 根据权利要求6所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征在 于： 所述步骤c中甘油终体积浓度为30% (V/V)，尿素终摩尔浓度为2mol/L。10. 根据权利要求6所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征 在于： 所述步骤d中PT抗原脱毒加入过氧化氢终浓度为1.0 % (W/V)，FHA抗原脱毒加入过 氧化氢终浓度为0. 5 % (W/V)，pH均调至8. 0。11. 根据权利要求6所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征 在于： 所述步骤e中脱毒温度为37°C，PT抗原脱毒时间为4小时，FHA抗原脱毒时间为2小 时。12. 根据权利要求6所述的采用过氧化氢脱毒无细胞百日咳疫苗抗原的方法，其特征 在于： 所述步骤f中采用超滤的方式去除过氧化氢。13. -种制备无细胞百日咳疫苗的方法，其特征在于：采用柱层析法制备抗原，所述方 法包括如下步骤： 1) 将百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis)培养物经离心分离为上清部分和菌 体部分； 2) 将步骤1中的上清部分经层析纯化分离得到PT抗原和FHA抗原； 3) 将步骤1中的菌体部分经热释放后经过层析纯化得到PRN抗原； 4) 将步骤2中的PT抗原和FHA抗原采用过氧化氢作为脱毒剂进行脱毒； 5) 将步骤3中的PRN抗原和步骤4中脱毒后的PT抗原和FHA抗原经0. 22 y m的滤膜 微孔过滤后，用铝佐剂分别吸附PT、FHA、PRN抗原； 6) 将步骤5中吸附后的PT、FHA、PRN抗原混合配制成为百日咳疫苗。14. 根据权利要求13所述的制备无细胞百日咳疫苗的方法，其特征在于： 所述步骤5中的铝佐剂为氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝，优选氢氧化铝。
【专利摘要】本发明涉及一种无细胞百日咳疫苗，其包含百日咳鲍特氏杆菌(Bordetella？pertussis)液体培养物上清部分的PT抗原和FHA抗原以及百日咳鲍特氏杆菌液体培养物菌体部分的PRN抗原。其中所述PT抗原和FHA抗原采用过氧化氢作为脱毒剂，甘油作为抗聚集剂，尿素作为保护剂进行脱毒。脱毒后的百日咳原液具有良好的免疫原性，且无对人体有害物质残留，具有良好的免疫原性和更广谱的抗原性。本发明还涉及上述无细胞百日咳疫苗的制备方法，以及包含上述无细胞百日咳疫苗的联合疫苗的制备方法。
【IPC分类】A61K39/08, A61K39/116, C07K14/235, A61K39/10, A61P31/04, A61K39/05
【公开号】CN105106947
【申请号】CN201510430882
【发明人】苏琴, 安文琪, 马小伟, 张勇朝, 潘若文, 范蓓
【申请人】华兰生物工程股份有限公司, 华兰生物疫苗有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年7月21日