装置处理后的病毒抗原液，将病毒液浓缩至原体积的1/2。
[0040] 3.加入10%甲醛灭活，NDV灭活16小时，AIV灭活24小时。
[0041] 4.油佐剂灭活苗的制备：
[0042] (1)将浓缩灭活后的NDV及AIV病毒液，按（V/V) 1 : 1的比例混合，取混合后的抗 原液96份，加入灭菌的吐温-804份混合，制成水相。
[0043] (2)白油94份、硬脂酸铝2份和司本-806份（质量比）混合，制成油相。
[0044] (3)按质量比7份油相与3份水相混合，高速乳化，即得鸡新城疫、禽流感二联灭活 油佐剂疫苗。本发明使用T50高剪切分散乳化机进行乳化，购自德国IKA集团。
[0045] 5?分装：定量分装，加盖密封，贴标签。
[0046] 实施例2
[0047] 禽流感新城疫二联苗广品检验
[0048] 疫苗的质量检验按《中国兽药典》规定进行（中国兽药典委员会编，中华人民共和 国兽药典三部二〇一〇年版，中国农业出版社，2011，以下本发明称《中国兽药典》）。
[0049] 1.疫苗的剂型、稳定性和粘度检测均证明制备的疫苗合格。过滤处理的水相料液 澄清度明显高于原工艺处理的料液。
[0050] 2.疫苗的安全性检验
[0051] 试验分两组进行，A组采用原纯化方法制备疫苗，B组采用本发明所用工艺制备疫 苗。
[0052] 用21~35日龄SPF鸡10只，各肌肉或皮下注射疫苗1.0ml，观察14日，两组未出 现因注射疫苗而引起的局部和全身不良反应，结果见表1。
[0053] 表1两种工艺制备的疫苗安全性测定结果
[0054]
[0055] 3?效力检验
[0056] 试验分两组进行，A组采用原纯化方法制备疫苗，B组采用本发明所用工艺制备疫 苗。
[0057] (1)鸡新城疫部分
[0058] 血清学方法：用21日龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗20 yl，另 5只作对照。接种后21日，每只鸡采血、分离血清，进行HI抗体效价测定，结果见表2。
[0059] 各组平均值如下，
[0060] 表2两种工艺制备的疫苗HI抗体效价检测
[0061]
[0062] (2)禽流感部分
[0063] 血清学方法：用21日龄SPF鸡15只，10只各颈部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另 5只作对照。接种后21日，每只鸡采血、分离血清，进行HI抗体效价测定，结果见表3。
[0064] 表3两种工艺制备的疫苗HI抗体效价检测
[0065]
[0066] 实施例3
[0067] -一禽流感灭活疫苗制备
[0068] 1.本发明疫苗生产用禽流感病毒为WD株，系北京市农林科学院畜牧兽医研究所 动物免疫与预防研究室1998年从河北省望都分离。将禽流感病毒WD株接种10日龄SPF 鸡胚培养获得抗原液。
[0069] 2.用于深层过滤的装置使用硅藻土作助滤剂，病毒抗原液与深层过滤装置接触， 以300L/m 2/hr~500L/m2/hr的流速过滤具有大粒径分布的蛋壳碎片、壳膜和血液，分离目 的抗原与杂质。本实施例所用的深层过滤装置适用病毒抗原液最佳流速为300L/m 2/hr。
[0070] 3?加入10%甲醛灭活24小时。
[0071] 4.油佐剂灭活苗的制备：
[0072] (1)按质量比取浓缩灭活后的禽流感病毒液96份，加入灭菌的吐温-804份混合， 制成水相。
[0073] (2)白油94份、硬脂酸铝2份和司本-806份（质量比）混合，制成油相。
[0074] (3)按质量比7份油相与3份水相混合，高速乳化，即得禽流感灭活疫苗。本发明 使用T50高剪切分散乳化机进行乳化，购自德国IKA集团。
[0075] 实施例4
[0076] -一新城疫灭活疫苗制备
[0077] 1.本发明疫苗生产用新城疫病毒La Sota株。将该种毒接种10日龄SPF鸡胚培 养获得抗原液。
[0078] 2.用于深层过滤的装置使用硅藻土作助滤剂，病毒抗原液与深层过滤装置接触， 以300L/m 2/hr~500L/m2/hr的流速过滤具有大粒径分布的蛋壳碎片、壳膜和血液，分离目 的抗原与杂质。本实施例所用的深层过滤装置适用病毒抗原液最佳流速为300L/m 2/hr。
[0079] 3?加入10%甲醛灭活16小时。
[0080] 4.油佐剂灭活苗的制备：
[0081] (1)按质量比取浓缩灭活后的新城疫病毒液96份，加入灭菌的吐温-804份混合， 制成水相。
[0082] (2)白油94份、硬脂酸铝2份和司本-806份（质量比）混合，制成油相。
[0083] (3)按质量比3份油相与1份水相混合，高速乳化，即得鸡新城疫灭活疫苗。本发 明使用T50高剪切分散乳化机进行乳化，购自德国IKA集团。
[0084] 实施例5
[0085] -一鸡减蛋综合症灭活疫苗制备
[0086] 1.本发明疫苗生产用产蛋下降综合症病毒（CVCC AV70,中国兽医药品监察所中国 兽医微生物菌种保藏管理中心编著中国兽医菌种目录，第二版，中国农业科学技术出版社， 2002, pl32)。将CVCC AV70株接种10日龄SPF鸭胚培养获得抗原液。
[0087] 2.用于深层过滤的装置使用硅藻土作助滤剂，病毒抗原液与深层过滤装置接触， 以300L/m2/hr~500L/m 2/hr的流速过滤具有大粒径分布的蛋壳碎片、壳膜和血液，分离目 的抗原与杂质。本实施例所用的深层过滤装置适用病毒抗原液最佳流速为300L/m 2/hr。
[0088] 3.加入10%甲醛灭活16小时。
[0089] 4.油佐剂灭活苗的制备：
[0090] (1)按质量比取浓缩灭活后的禽产蛋下降综合症病毒CVCC AV70病毒液100份，加 入灭菌的吐温-804份混合，制成水相。
[0091] ⑵白油94份、硬脂酸铝2份和司本-806份（质量比）混合，制成油相。
[0092] (3)按质量比6份油相与4份水相混合，高速乳化，即得鸡减蛋综合症灭活疫苗。 本发明使用T50高剪切分散乳化机进行乳化，购自德国IKA集团。
【主权项】
1. 一种鸡新城疫、禽流感二联灭活苗的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤： 制苗用病毒液的制备，使用深层过滤装置进行过滤，病毒液的浓缩与灭活，油佐剂灭活苗的 制备，分装。2. 如权利要求1所述的鸡新城疫、禽流感二联灭活苗的制备方法，其特征在于具体包 括以下步骤： (1) 病毒液的制备：将生产用种毒接种SPF鸡胚，收获鸡胚液。 (2) 病毒液经深层过滤装置处理，即：鸡胚液与深层过滤装置接触，以300L/m2/hr~ 500L/m2/hr的流速过滤具有大粒径分布的蛋壳碎片、壳膜和血液，分离目的抗原与杂质； (3) 病毒液的浓缩与灭活：使用截留分子量为IOOkd的膜包（购自德国默克密理博）将 病毒液浓缩至原体积的1/2,加入10%甲醛灭活； (4) 油佐剂灭活苗的制备：白油、硬脂酸铝和司本-80混合，加入两种抗原等量混合的 抗原液，即得油佐剂疫苗。3. 如权利要求1所述的一种鸡新城疫、禽流感二联灭活苗疫苗的制备方法，其特征 在于步骤（4)所述白油、硬脂酸铝与司本-80的体积比为94:2:6,病毒液与油相体积比为 3:7〇4. 如权利要求1和2所述的一种鸡新城疫、禽流感二联灭活苗的制备方法，其特征在于 其中的病毒经深层过滤装置和病毒超滤浓缩系统处理方法在用禽蛋作为病毒复制原料制 备的灭活疫苗中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种鸡新城疫、禽流感二联灭活苗的制备方法。该方法包括以下步骤：(l)制苗用毒液的制备；(2)病毒的细胞培养液使用深层过滤装置以300L/m2/hr～500L/m2/hr的流速进行过滤；(3)使用超滤系统进行抗原液的超滤浓缩；(4)使用10％甲醛灭活；(5)油佐剂灭活苗的制备，分装。此方法制备的疫苗产量和安全性得到提高且具有良好的免疫效果。
【IPC分类】A61P31/14, A61K39/295, A61P31/16
【公开号】CN105106949
【申请号】CN201510676034
【发明人】何召庆, 赵颖慧, 马明杰, 郭翠平, 宋宝敏, 张澍
【申请人】北京健翔和牧生物科技有限公司, 山西隆克尔生物制药有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年10月19日