一种兽用疫苗的免疫佐剂、制备方法及其应用
【技术领域】
[0002] 本发明涉及一种疫苗佐剂，特别涉及一种兽用疫苗的免疫佐剂、制备方法及其应 用。
[0003]
【背景技术】
[0004] 佐剂作为一种非特异性免疫增强剂，可增强机体的免疫应答能力或改变免疫应答 类型。一种免疫效果确实的疫苗往往需要一种与之相匹配的佐剂才能更好地发挥疫苗抗感 染的特性。近年来随着现代生物技术的进步，各种新型疫苗（例如：亚单位疫苗、基因工程 疫苗）的研究逐渐成为热点问题，但免疫佐剂的研究明显滞后，已远远不能满足新型疫苗 发展的需要。传统免疫佐剂如白油佐剂、氢氧化铝胶佐剂等，虽然能一定程度上提高疫苗的 使用效果，但这些传统佐剂均仍存在一定的局限性，在使用过程中不仅易出现副作用，且容 易在注射部位形成肿块，影响畜产品品质，而且这些传统佐剂极少产生免疫刺激性，不能提 高免疫系统的技能；此外，这些佐剂不易被机体吸收，使得有效刺激的抗原量释放缓慢，难 以促使疫苗快速达到预期效果。因此，研发新型、高效、无毒的疫苗佐剂已成为疫苗研究的 当务之急。
[0005] 随着现代医学、细胞生物学及分子生物学的发展，人们逐渐认识到许多疾病的发 生、发展与机体免疫系统功能缺陷和失调有密切的联系，治疗重点已由直接杀伤外源性病 原体转向调整机体自身功能，以提高机体免疫力、抗病力，因此免疫增强剂的应用引起人们 的关注。免疫增强剂能增强机体的非特异性免疫功能，提高机体抗病力：在单独或与抗原 联合使用时能增强机体特异性、非特异性免疫应答，并可降低动物对有害微生物的易感性 及防止动物发生免疫抑制，对流行性疾病防控有积极的作用。近几年家禽养殖业中，由于细 菌、病毒感染引起家禽免疫功能的下降已经对畜牧业造成极大的影响，特别是免疫抑制病 的发生与传播为家禽疫病的流行创造了条件，故而新型免疫调节剂的开发势在必行。理想 的免疫增强剂应能促进抗原引起体液和细胞免疫，增强弱免疫性抗原的抗原性，无毒副作 用；能以不同途径免疫，也能用于不同抗原：能在免疫抑制机体中发挥作用；用于食用动物 不应有药物残留；能有效提高免疫反应质量；使用稳定、便宜且容易生产。天然的中药免疫 增强剂，在解决药残和控制疾病方面取得了非常好的效果，新型植物免疫增强剂的研究与 开发正在成为国内畜牧行业研发的新热点。
[0006] 多糖（Polysaccharide)是由单糖之间脱水形成糖苷键，并以糖苷键线性或分枝连 接而成的链状聚合物，为一类天然大分子化合物，一般由几百个甚至几万个多糖分子组成， 分子量较大，无甜味，无还原性。多糖广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，是自 然界含量最丰富的生物多聚物，也是所有生命有机体的重要组成部分，并与维持生命所需 的多种生理功能有关。近二十年来，随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物 分子具有极其重要的生物功能，多糖与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的 运输、癌症的诊断与治疗等，都有着密切的关系。然而多糖类物质作为免疫佐剂的研究仅限 于对微生物来源的脂多糖和葡萄糖。事实上，多糖是一类十分重要的免疫相关活性物质，一 些多糖分别或同时具有调节淋巴细胞、吞噬细胞、白细胞介素、抗体水平以增强免疫功能； 一些多糖可经化学修饰形成多孔微颗粒，具有浓缩和储存抗原的作用。多糖微粒可耐受胃 肠道的降解，可发展成口服免疫载体。因此，以多糖类物质为佐剂，既可发挥其增强免疫作 用，又具有运载抗原、促进抗原提程的佐剂活性，这是研究佐剂的新趋势。
[0007] 蜂胶能增强体液免疫和细胞免疫，对胸腺、脾脏等免疫器官进行调节，使机体免疫 功能处于最佳状态，是一种天然高效免疫增强剂。有人发现服用蜂胶的家兔，其血中丙种球 蛋白的活性及吞噬细胞的吞噬能力都有所增强，且抗体数目和没有服用蜂胶的家兔相比明 显增加。对感染性疾病的疗效显著，可能有两方面原因：一是由于它本身能抑制致病微生物 的生长和繁殖；二是由于其所具有的免疫增强作用，提高了机体的抗病能力。目前，随着新 型疫苗的开发，迫切需要新型的疫苗佐剂与之配合使用，以增强免疫效果。
[0008]
【发明内容】
[0009] 为了满足开发新型佐剂的需求，本发明提供了一种兽用疫苗的免疫佐剂、制备方 法及其应用。
[0010] 为了实现发明目的，本发明提供一种兽用疫苗的免疫佐剂，所述佐剂由下列原料 以质量份组成：泰山松花粉多糖5-30份、蜂胶5-10份、芦荟多糖5-10份、覆盆子多糖8-14 份、老君须多糖3-6份、打碗花多糖4-9份、亲水性表面活性剂0. 1-10份、高分子胶束物质 0. 1-10份和水40-90份。
[0011] 所述亲水性表面活性剂为司班80和普鲁尼克121的混合物；所述司班80和普鲁 尼克121的质量份数比为：司班80为1-2. 5份、普鲁尼克121为1-3份。
[0012] 所述高分子胶束物质为壳聚糖和卡波姆971P的混合物；所述壳聚糖和卡波姆 971P的质量份数比为：壳聚糖为1-3份、卡波姆971P为2-3份。
[0013] 所述泰山松花粉多糖的提取方法为：将破壁后的泰山松花粉用索氏提取器在 48°C -50°C抽提脂肪2h后得产物1，产物1加入占产物1质量0. 3%的胃蛋白酶在50°C反应 2h除蛋白后，用80-KKTC热水浸提7-10h，随后降温至4°C沉淀8-12h，然后取上清液一以 10000 r/min过滤离心10 min，在200 r/min和60°C条件下减压浓缩，得浓缩液；取Sevage 试剂和浓缩液按质量比为1:3混合均匀后放置3h后，取上清液二；再将上清液二与Sevage 试剂按质量比3:1混合均匀，静置2h后，取上清液三，然后将上清液三用无水乙醇沉淀 7-10h，将沉淀物在-15°C~-20°C冷冻干燥得到松花粉多糖。
[0014] 所述覆盆子多糖的制备方法包括以下步骤：取覆盆子洗净干燥后将果肉粉碎制得 覆盆子干粉，加入质量为覆盆子干粉质量7~9倍的石油醚和醇浓度为95%的乙醇混合物 浸泡并超声处理30~40 min，过滤后，得残渣一；用相对于残渣一质量10~15倍的醇浓 度90%~95%的乙醇浸泡，加热回流1~2h后提取，过滤，得第一过滤液和残渣二；残渣二 中加入相对于残渣二质量10~15倍的去离子水后，加入复合酶A于30-39°C、pH5-6. 5下 酶解5h-6h，酶解结束后灭酶得到提取液；将第一过滤液和提取液混合后在真空度0. 06~ 0. 09Mpa下减压浓缩至50~60°C时相对密度为1. 04~1. 10的膏体，向膏体中加入相对于 膏体质量6-8倍的醇浓度为95%的无水乙醇，沉淀8h，高速离心后真空干燥得覆盆子多糖； 所述复合酶A为酸性木聚糖酶和0 -葡聚糖酶组成的复合酶，酸性木聚糖酶质量用量为覆 盆子干粉质量的2. 0%、0 -葡聚糖酶质量用量为覆盆子干粉质量的4. 5% ;所述石油醚和 醇浓度95 %的乙醇体积比为1:5 ; 和/或所述芦荟多糖的制备方法包括以下步骤：取2-3年芦荟鲜叶洗净，在去离子水中 浸泡20-40min，以除去表皮渗出的黄色液汁，然后切去表皮，将内层凝胶剪碎，用匀浆机匀 浆后取上清液在4°C冷藏8-10h得到芦荟汁；将芦荟汁与去离子水按质量比1:12-15比例 混合，加入复合酶B在32-36°C、pH5. 2-6. 5下酶解5-8h，酶解结束后灭酶得提取液，将提取 液在真空度0. 06~0. 09Mpa下减压浓缩至50~60°C时相对密度为1. 04~1. 10的膏体， 向膏体中加入相对于膏体质量5-7倍的醇浓度为95%的无水乙醇，沉淀8h，高速离心得芦荟 多糖沉淀；再用Sevage试剂和芦荟多糖沉淀质量比为1:3混合均匀静置l_2h，然后取上清 液真空干燥得芦荟多糖；所述复合酶B为酸性木聚糖酶和葡聚糖酶组成的复合酶，酸性 木聚糖酶质量用量为芦荟汁质量的3. 0%、0 -葡聚糖酶质量用量为芦荟汁质量的2. 5%。
[0015] 所述老君须多糖的制备方法包括以下步骤：取老君须洗净干燥后，粉碎制得老君 须干粉，老君须干粉与去离子水按1:15-20混合，80-90°C浸提8h，减压浓缩后离心3次， 每次离心的转速为12000r/m，每次离心的时间为12min，每次离心的温度为15°C，以除尽杂 质；随后在真空度〇. 06~0. 09Mpa下减压浓缩至50~60°C时相对密度为1. 04~1. 10的 膏体，向膏体中加入相对于膏体质量5-7倍的醇浓度为95%的乙醇，沉淀8h，高速离心得老 君须多糖沉淀；再用Sevage试剂和老君须多糖沉淀质量比为1:3混合均匀，静置l_2h后取 上清液真空干燥得老君须多糖。
[0016] 所述打碗花多糖的制备方法包括以下步骤：取打碗花洗净干燥后，粉碎制得打碗 花干粉，打碗花干粉与去离子水按1:18-22混合，85-95°C浸提8h，减压浓缩后离心3次，离 心工艺参数为1 l〇〇〇r/