min、15min和20°C，以除尽杂质；随后在真空度0. 05~0. 07Mpa下减 压浓缩至60~70°C时相对密度为1. 1~1. 15的膏体，向膏体中加入相对于膏体质量8-9 倍的醇浓度为95%的无水乙醇，沉淀8h，高速离心得打碗花多糖沉淀；再用Sevage试剂和 打碗花多糖沉淀质量比为1:3混合均匀，静置1-2h后取上清液真空干燥得打碗花多糖。 [0017] 为了更好地实现发明目的，本发明还提供一种兽用疫苗的免疫佐剂的制备方法， 包括以下步骤：按配方量分别称取各组分混合均匀得混合物，混合物冰水浴2-3h后，用机 械乳化法乳化，得到免疫佐剂，4°C保存备用。
[0018] 所述机械乳化法采用设备为胶体磨或组织匀浆机。
[0019] 为了更好地实现发明目的，本发明还提供一种兽用疫苗的免疫佐剂的应用，在应 用时由质量比为4-11:89-96的免疫佐剂和抗原水溶液混合后使用。
[0020] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是： 1.本发明提供的兽用疫苗的免疫佐剂为植物多糖，对动物无毒副反应，有效解决了疫 苗副反应的问题，且易储存，易于注射，使用方便，作用效果好。
[0021] 2.本发明提供的兽用疫苗的即用型佐剂，制备工艺简单、成本低、得到的剂型稳 定；成分简单、易储存，易于注射，使用方便，作用效果好，无毒副反应，在畜牧业中的开发利 用潜力巨大，具有广阔的应用前景。
[0022]
【附图说明】
[0023] 图1疫苗免疫后各组兔外周血IL-2浓度的比较； 图2疫苗免疫后各组兔外周血IL-4浓度的比较； 图3疫苗免疫后各组兔外周血IL-10浓度的比较； 图4疫苗免疫后各组兔外周血IFN-y浓度的比较。
[0024]
【具体实施方式】
[0025] 针对开发新型佐剂的问题，本发明提供一种兽用疫苗的免疫佐剂、制备方法及其 应用。
[0026] 松花粉多糖由甘露糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖等 单糖组成。现代研究证明，松花粉多糖是保持松花粉特效的营养成份之一，具有非常高的生 物活性，松花粉破壁后多糖提取量显著提高。本发明中于春季采集泰山地区新鲜松花粉，过 筛破壁后用水提醇沉法提取粗多糖，提取过程中用胃蛋白酶和Sevage试剂两种方法除蛋 白，保证了粗多糖较高的纯度。
[0027] 多种植物多糖不仅能激活T细胞、B细胞、巨噬细胞(MO )、自然性杀伤细胞（NK)、 杀伤性T细胞（TL)、淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK)等免疫细胞，还能促进巨噬细胞分泌白 细胞介素1 (IL-1)、肿瘤坏死因子（INF)，促进T淋巴细胞产生白细胞介素2 (IL-2)，激活 白细胞产生干扰素（TFN)，通过不同的途径激活补体系统和网状内皮系统等，从而调节机体 免疫功能。直接皮下注射松花粉多糖能够显著提高小鼠的免疫功能，而且这种增强作用是 非特异性的，并且多糖对机体没有任何毒副作用，不影响疫苗的品质。松花粉多糖的这些优 良特性为将松花粉多糖作为免疫增强剂与疫苗共同使用的可行性奠定了基础。另外，松花 粉多糖为水溶性多糖，具有非常高的亲水性和粘性，混合到组织灭活苗中，可以让抗原缓慢 释放，可以起到免疫佐剂的作用。
[0028] 泰山松花粉，采集自泰山地区，过260目筛，由泰安正信科技有限公司超微粉碎破 壁。
[0029] 蜂胶，市场采购。将蜂胶置于清洁的塑料膜袋中，用锤子敲碎，加入无水乙醇溶 剂搅拌过夜至完全溶解，或加热至60° C搅拌至溶解完全（溶解比例为蜂胶：无水乙醇 Ikg:10L)后冷却至室温，静置，定容。用NN-二甲基乙酰胺调节至pH值为7.0得蜂胶提取 物溶液。将蜂胶提取物溶液经〇. 8mm滤膜抽滤后分装。
[0030] 实施例1佐剂1 一种兽用疫苗的免疫佐剂，免疫佐剂由下列原料以质量份组成：泰山松花粉多糖5份、 蜂胶10份、芦荟多糖5份、覆盆子多糖8份、老君须多糖6份、打碗花多糖9份、亲水性表面 活性剂10份、高分子胶束物质〇. 1份和水40份。
[0031] 其中，亲水性表面活性剂为司班80和普鲁尼克121的混合物；司班80和普鲁尼克 121的质量份数比为司班80为1份、普鲁尼克121为3份。
[0032] 其中，所述高分子胶束物质为壳聚糖和卡波姆971P的混合物；所述壳聚糖和卡波 姆971P的质量份数比为壳聚糖为1份、卡波姆971P为3份。
[0033] 兽用疫苗的免疫佐剂的制备方法，包括以下步骤：按配方量分别称取各组分混合 均匀得混合物，混合物冰水浴2h后，用胶体磨机械乳化，得到免疫佐剂，4°C保存备用。
[0034] 其中泰山松花粉多糖的提取方法为：将破壁后的泰山松花粉用索氏提取器在 48°C抽提脂肪2h后得产物1，产物1加入占产物1质量0. 3%的胃蛋白酶在50°C反应2h除 蛋白后，用80°C热水浸提10h，随后降温至4°C沉淀12h，然后取上清液一以10000 r/min过 滤离心10 min，在200 r/min和60°C条件下减压浓缩，得浓缩液；取Sevage试剂和浓缩液 按质量比为1:3混合均匀后放置3h后，取上清液二；再将上清液二与Sevage试剂按质量比 3:1混合均匀，静置2h后，取上清液三，然后将上清液三用无水乙醇沉淀10h，将沉淀物在 零下15°C冷冻干燥得到松花粉多糖。
[0035] 其中，覆盆子多糖的制备方法包括以下步骤：取覆盆子洗净干燥后将果肉粉碎制 得覆盆子干粉，加入质量为覆盆子干粉质量7倍的石油醚和醇浓度为95%的乙醇混合物浸 泡并超声处理40 min，过滤后，得残渣一；用相对于残渣一质量10倍的醇浓度95%的乙醇 浸泡，加热回流2h后提取，过滤，得第一过滤液和残渣二；残渣二中加入相对于残渣二质量 15倍的去离子水后，加入复合酶A于30°C、pH5下酶解6h，酶解结束后灭酶得到提取液；将 第一过滤液和提取液混合后在真空度0. 〇9Mpa下减压浓缩至60°C时相对密度为1. 10的膏 体，向膏体中加入相对于膏体质量6倍的醇浓度为95%的无水乙醇，沉淀8h，高速离心后真 空干燥得覆盆子多糖；复合酶A为酸性木聚糖酶和葡聚糖酶组成的复合酶，酸性木聚糖 酶质量用量为覆盆子干粉质量的2. 0%、0 -葡聚糖酶质量用量为覆盆子干粉质量的4. 5%; 石油醚和醇浓度95 %的乙醇体积比为1:5 ; 其中，芦荟多糖的制备方法包括以下步骤：取2年芦荟鲜叶洗净，在去离子水中浸泡 20min，以除去表皮渗出的黄色液汁，然后切去表皮，将内层凝胶剪碎，用匀浆机匀浆后取 上清液在4°C冷藏10h得到芦荟汁；将芦荟汁与去离子水按质量比1: 15比例混合，加入 复合酶B在32°C、PH5. 2下酶解8h，酶解结束后灭酶得提取液，将提取液在真空度0. 09Mpa 下减压浓缩至60°C时相对密度为1. 04的膏体，向膏体中加入相对于膏体质量7倍的醇浓度 为95%的无水乙醇，沉淀8h，高速离心得芦荟多糖沉淀；再用Sevage试剂和芦荟多糖沉淀 质量比为1:3混合均匀静置l-2h，然后取上清液真空干燥得芦荟多糖；所述复合酶B为酸 性木聚糖酶和0 _葡聚糖酶组成的复合酶，酸性木聚糖酶质量用量为芦荟汁质量的3. 0%、 0 -葡聚糖酶质量用量为芦荟汁质量的2. 5%。
[0036] 其中，老君须多糖的制备方法包括以下步骤：取老君须洗净干燥后，粉碎制得老君 须干粉，老君须干粉与去离子水按1: 20混合，80°C浸提8h，减压浓缩后离心3次，每次离 心的转速为12000r/m，每次离心的时间为12min，每次离心的温度为15°C，以除尽杂质；随 后在真空度〇. 〇6Mpa下减压浓缩至60°C时相对密度为1. 04的膏体，向膏体中加入相对于膏 体质量7倍的醇浓度为95%的乙醇，沉淀8h，高速离心得老君须多糖沉淀；再用Sevage试 剂和老君须多糖沉淀质量比为1:3混合均匀，静置2h后取上清液真空干燥得老君须多糖。
[0037] 其中，打碗花多糖的制备方法包括以下步骤：取打碗花洗净干燥后，粉碎制得打碗 花干粉，打碗花干粉与去离子水按1: 22混合，85°C浸提8h，减压浓缩后离心3次，离心工 艺参数为ll〇〇〇r/min、15min和20°C，以除尽杂质；随后在真空度0. 07Mpa下减压浓缩至 60°C时相对密度为1. 15的膏体，向膏体中加入相对于膏体质量8倍的醇浓度为95%的无水 乙醇，沉淀8h，高速离心得打碗花多糖沉淀；再用Sevage试剂和打碗花多糖沉淀质量比为 1:3混合均匀，静置lh后取上清液真空干燥得打碗花多糖。
[0038] 蜂胶，购自泰安市蜂场。将蜂胶置于清洁的塑料膜袋中，用锤子敲碎，加入无水乙 醇溶剂搅拌过夜至完全溶解(溶解比例为蜂胶：无水乙醇Ikg:10L)，静置，定容。用NN-二 甲基乙酰胺调节至PH值为7. 0得蜂胶提取物溶液。将蜂胶提取物溶液经0. 8mm滤膜抽滤 后分装。