浓缩后离心3次，每次离心 的转速为12000r/m，每次离心的时间为12min，每次离心的温度为15°C，以除尽杂质；随后 在真空度0. 〇7Mpa下减压浓缩至55°C时相对密度为1. 08的膏体，向膏体中加入相对于膏体 质量6倍的醇浓度为95%的乙醇，沉淀8h，高速离心得老君须多糖沉淀；再用Sevage试剂 和老君须多糖沉淀质量比为1:3混合均匀，静置lh后取上清液真空干燥得老君须多糖。
[0055] 其中，打碗花多糖的制备方法包括以下步骤：取打碗花洗净干燥后，粉碎制得打碗 花干粉，打碗花干粉与去离子水按1:20混合，90°C浸提8h，减压浓缩后离心3次，离心工艺 参数为11000r/min、15min和20°C，以除尽杂质；随后在真空度0. 06Mpa下减压浓缩至65°C 时相对密度为1. 12的膏体，向膏体中加入相对于膏体质量9倍的醇浓度为95%的无水乙 醇，沉淀8h，高速离心得打碗花多糖沉淀；再用Sevage试剂和打碗花多糖沉淀质量比为1:3 混合均匀，静置2h后取上清液真空干燥得打碗花多糖。
[0056] 蜂胶，购自泰安市蜂场。将蜂胶置于清洁的塑料膜袋中，用锤子敲碎，加入无水乙 醇溶剂加热至60° C搅拌至溶解完全（溶解比例为蜂胶：无水乙醇Ikg: 10L)后冷却至室 温，静置，定容。用NN-二甲基乙酰胺调节至pH值为7.0得蜂胶提取物溶液。将蜂胶提取 物溶液经0. 8_滤膜抽滤后分装。
[0057] 对比试验 1. 1试验动物及生物制剂 獭兔，泰山种兔厂提供。选取5-6周龄体重lkg左右非免疫苗的健康雄兔60只，每笼 10只，在同等条件下饲养。
[0058] 兔病毒性出血症组织灭活苗，按常规方法制作。选择血凝效价多101og2的兔出血 症病毒病料与生理盐水按质量比1:10的比例混合，充分匀浆后得到抗原液，并分装，向分 装的抗原液中分别加入制备的佐剂，充分混匀，然后用终浓度0. 4%的甲醛灭活48h，从而 制备成含有不同佐剂的兔病毒性出血症组织灭活苗。
[0059] 1. 2试剂和仪器 胎牛血清，郑州佰安生物工程有限公司产品，批号200511003;伴刀豆素球蛋白 (ConA)，Amresco公司产品，用无血清RPMI 1640培养液配制成0. 025 mg/ml，过滤除菌，分 装，-20 °C 保存；060370 胃蛋白酶（1:3000) Amresco,分装为活力单位 3000-3500 y .mg1; RPMI1640培养液，Gibco公司产品；PI染料，Amresco公司产品；F0120淋巴细胞分离液，上 海沪峰生物科技有限公司产品；人"0"型血，由泰安市中心医院提供，自制成1%红细胞备 用。
[0060] 全自动动物血细胞分析仪，PE-6800VET型，深圳普康电子有限公司产品；流式细 胞仪，GuavaTechnologies公司产品，型号GuagaEasyCyteMini;FSH_2 组织勾衆机，金 坛市城西天竟实验仪器厂生产；96孔细胞培养板，海门市优耐特实验器材发展有限公司产 品；96孔V形微量血凝板，江苏姜堰市高康健生化器具厂产品。
[0061] 1.3试验设计及检测指标 将兔随机分为6组，每组10只。
[0062] 试验分组： I组：使用本发明实施例1的免疫佐剂，免疫佐剂与抗原水溶液质量比为4:96。
[0063] II组：使用本发明实施例2的免疫佐剂，免疫佐剂与抗原水溶液质量比为11:89。
[0064] HI组：使用本发明实施例3的免疫佐剂，免疫佐剂与抗原水溶液质量比为7:93。
[0065] IV组：使用白油作为佐剂，白油与抗原水溶液质量比为10:90。
[0066] V组：为无佐剂兔病毒性出血症疫苗组。
[0067] VI组为空白对照组。
[0068] 疫苗注射：实验组疫苗注射剂量为每只1ml，空白对照组注射等量生理盐水。分别 在免疫后〇、3、7、14、21、28、35、42d采血，用血凝（HA)与血凝抑制（HI)试验检测血清抗体 效价、全自动血细胞分析仪测定外周血淋巴细胞比率、PI染色法检测血液淋巴细胞增值率； 并用ELISA法检测血清中细胞因子的水平。同时，疫苗免疫后动物的副反应被监测记录。
[0069] 1. 3. 1血清抗体水平的检测 对每只兔耳缘静脉采血，分离血清，用HA与HI检测兔血清抗体水平。
[0070] 血凝（HA)试验：取96孔板，取2排每孔各加50 y 1生理盐水，吸50 y 1兔出血症 病毒液于第1排第1孔，混匀后取50 y 1至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50 y 1，经倍比 稀释，病毒的稀释倍数为2i-212,第2排不加病毒作为对照，然后每孔各加1%人"0"型红细胞 50 y 1，震荡混匀，室温静置10_30min，观察结果，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集 的最高稀释倍数作为病毒的血凝价（2 n)，用nlog2表示。
[0071] 血凝抑制（HI)试验：按HA试验测出的兔出血症病毒血凝价除以4即为4个单位 血凝素的稀释度，按照稀释倍数配制4单位抗原液。取96孔板，每排1-12孔各加生理盐水 50 y 1，于每排第1孔中分别加入50 y 1不同兔的待检血清，反复吹吸混匀后，取50 y 1至第 2孔混匀，依次稀释至第12孔，弃去50 y 1，经倍比稀释，血清的稀释倍数为2i-212。每排每 孔各加4单位抗原50 y 1，震荡混匀，室温静置20min。每排每孔各加1%人"0"型红细胞 50 y 1，震荡混匀，室温静置10_30min，观察记录抗体效价（2n)，用nlog2表示。
[0072] 1.3. 2外周淋巴细胞比率的测定 在含50 y 1血液稀释液的离心管中加入立即采集的等量血液混匀，制备预稀释抗凝 血，用全自动动物血细胞分析仪测定兔外周淋巴细胞比率。
[0073] 1. 3. 3外周血淋巴细胞转化率的测定 耳中央动脉无菌采集抗凝血lml，用淋巴细胞分离液分离血液中的淋巴细胞，并计数， 用含血清RPMI1640培养液调整细胞密度为1X 106个/ml，加入到96孔板中，100 y 1/孔， 然后加入ConA，终浓度为20 y g/ml，同时设不加ConA的阴性对照孔。
[0074] 培养48 h后将上述加ConA的6组淋巴细胞和不加ConA的淋巴细胞各自吹打混 合制成悬液，然后分别移到离心管中作为实验管和对照管，离心弃上清，再用PBS洗2次，最 终将淋巴细胞悬浮于lml PBS液中并计数，调整至每管1 X 106个细胞后加入50 y g PI染 料，避光放置30 min再用PBS洗1次，用流式细胞仪在488nm激光激发下检测实验管与对 照管进入S期的细胞百分率，加ConA管进入S期的百分率（SPF)代表淋巴细胞转化程度， 计算公式为： SPF=S/ [ (G0+G1)+S+ (G2+M)]X100% 1. 3. 4外周血细胞因子的测定 在免疫后7d，采集兔耳缘静脉血，离心收集血清，用商品化ELISA检测试剂盒检测各组 兔血液中的IFN-y、IL-2、IL-4和IL-10的含量。
[0075] 1.3.5攻毒保护试验 在免疫后42d，对各组兔用103 TCID5。剂量的兔出血症病毒进行鼻腔接种，观察记录攻 毒兔的临床症状和死亡率。参考的临床症状包括短暂兴奋(如尖叫、挣扎、抽搐、狂奔等)、鼻 孔流血、精神不振，被毛粗乱、消瘦、发烧、食欲减退、饮欲增加等。
[0076] 1. 3. 6数据处理 数据以平均数土SD表示，用SPSS 14. 0软件进行Duncan's多重比较分析。
[0077] 2结果与分析 2. 1血清兔瘟抗体效价的变化 所有疫苗免疫组免疫后抗体水平在21d达到峰值。从免疫后7d开始，四个佐剂疫苗组 (I、II、III、IV)的抗体效价均显著高于无佐剂疫苗对照组（V) (P〈0. 05)。然而，I、II组 在免疫后14、21、28、35d显著高于白油佐剂疫苗组（IV) (P〈0. 05)，III组在免疫后14、28、 35d显著高于白油佐剂疫苗组（IV) (P〈0. 05)。值得注意的是，I组在免疫后14、21、28、35d 显著高于所有疫苗免疫组（P〈〇. 05)，抗体水平最高。结果见表1。
[0078] 表1疫苗免疫后兔血清抗体效价的变化（log2)
注：同行、列数据上标字母完全不相同者差异显著（P〈〇. 05)。
[0079] 2. 2外周血淋巴细胞比率的变化 所有疫苗免疫组免疫后血液淋巴细胞比率在21d达到峰值。从免疫后14d开始，四个 佐剂疫苗组（I、II、III、IV)的淋巴细胞比率均显著高于无佐剂疫苗对照组（V) (P〈0. 05)。 I、II、III从免疫后7d至35d淋巴细胞比率均高于白油佐剂疫苗组（IV)，但是II、III组 与IV之间差异不显著。值得注意的是，I组从免疫后