专利名称：鸡新城疫浓缩灭活苗的生产方法
技术领域：
本发明涉及的是一种疫苗的生产技术的改进，具体地说，是一种鸡新 城疫浓縮灭活苗浓縮技术的改进方法。属于生物工程领域。
背景技术：
新城疫病毒(Newcastlediseasevirus， NDV)又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡 瘟病毒或禽肺脑炎病毒。在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科 (Paramyxoviridae)、畐U黍占病毒属(Paramyxovirus)中的一个禾中。该病毒主 要危害鸡、珠鸡和火鸡，在被侵袭的鸡群中迅速传播，强毒株可使鸡群全 群毁灭。弱毒株仅引起鸡群呼吸道感染和产蛋量下降，但可迅速康复。人 类可因接触病禽和活毒疫苗而引起结膜炎或淋巴腺炎，但很快便康复。新 城疫病毒被OIE规定为A类疫病，是一种急性、高度接触性传染病，发病 率和死亡率都在90%以上，1935年梁英、马闻天等首次证实我国有该病的 流行[l]，现在本病被我国列为I类疫病。
新城疫病毒是ssRNA病毒，有包膜。病毒颗粒具多形性，有圆形、椭 圆形和长杆状等。成熟的病毒粒子直径100 400mn。包膜为双层结构膜， 由宿主细胞外膜的脂类与病毒糖蛋白结合衍生而来。包膜表面有长12 15mn的刺突，具有血凝素、神经氨酸酶和溶血素。病毒的中心是ssRNA分 子与附在其上的蛋白质衣壳粒，缠绕成螺旋对称的核衣壳，直径约18nm。 成熟的病毒是以出芽方式释放至细胞外。
新城疫病毒对外界环境的抵抗力较强，55'C作用45min和直射阳光下 作用30min才被灭活。病毒在4X:中存放几周，在-20。C中存放几个月或在 -7(TC中存放几年，其感染力均不受影响。在新城疫暴发后8周之内，仍可 在鸡舍、蛋巢、蛋壳和羽毛中分离到病毒。病毒对乙醚敏感。大多数去污剂能将它迅速灭活。氢氧化钠等碱性物
质对它的消毒效果不稳定。3% 5%来苏尔、酚和甲酚5min内可将裸露的 病毒粒子灭活。在37X:的孵卵器内，用O. 1X福尔马林熏蒸6h便可把它灭 活。
新城疫病毒的所有毒株都能凝集多种禽类和哺乳类动物的红细胞。大 多数毒株能凝集公牛和绵羊的红细胞。在病毒的血凝试验中，鸡的红细胞 最为常用。
该病毒可在9 12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜上和尿囊腔中培养，大多数毒株 也可在兔、猪、犊牛和猴的肾细胞以及鸡组织细胞等继代或传代细胞中培 养。鸡胚的成纤维细胞、鸡胚和仓鼠的肾细胞常用于新城疫病毒的培养。
目前，虽然疫苗的使用使该病得到了有效控制,但由于疫苗免疫效果不 理想，以及流行毒株的毒力增强和我国养鸡业水平的参差不齐，使得该病 仍然是严重危害我国养禽业的疾病之一，在我国经常有非典型新城疫的发 生，甚至典型新城疫的爆发。
当前，防制该病所用的疫苗主要有活疫苗和灭活疫苗，其中活疫苗有 弱毒疫苗II系、III系、IV系和中等毒力疫苗I系[2]，弱毒疫苗的缺点 是不能突破母源抗体的干扰，中等毒力疫苗虽能突破母源抗体的影响，能 够快速的产生抗体，但可引起鸡发病，存在散毒的危险，据报道可引起鸡 的非典型新城疫。灭活疫苗主要为油乳剂灭活疫苗，它可以避开母源抗体 的影响，不存在散毒的危险，适合于任何日龄的鸡免疫；但由于目前流行 毒株的毒力增强，使得免疫剂量不断加大，这给免疫带来了不便，并且疫 苗免疫的副反应增强，接种部位往往出现吸收不良或肉芽肿，影响了禽类制 品的质量，给养禽业造成了一定的损失。因此，目前国内养鸡业迫切需求 免疫效果好、免疫剂量小的鸡新城疫灭活疫苗，来解决以上问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种鸡新城疫浓縮灭 活苗的制备方法，使其提供副作用小、免疫产生时间早、免疫力强、免疫 期长的疫苗。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤:
1) 将鸡新城疫病毒弱毒株冻干毒复溶，连续传代接种鸡胚9代，分别 冻干保存，作为生产鸡新城疫浓縮型灭活疫苗的基础种毒和生产用种毒；
2) 将病毒液灭活后，使用30KD膜包对病毒超滤浓縮5倍；
3) 在高压乳化泵中将浓縮后的水相与油相按1: 1比例混合乳化，即 成鸡新城疫浓縮灭活疫苗，灭活前的病毒含量>106. 3EID50/0. lml。
在一个具体实施方案中，鸡新城疫病毒弱毒株优选是LaSota，效检用 强毒优选是鸡新城疫病毒强毒北京株(CVCCAV1611株)，均为现行《中华人 民共和国兽药典》中"鸡新城疫灭活疫苗"的生产和检验用毒种，购自中 国兽药监察所。
在一个具体实施方案中，所述的30KD膜购自Millipore公司。 在另一个具体实施方案中，在实施步骤3之前还可在灭活毒液中加入 无菌5%吐温-80，为水相；在10号白油中加入6%司本-80，再加入2%硬脂 酸铝，灭菌后为油相。
本发明的基本原理是，灭活苗的免疫效果除受病毒或毒株本身的影响 外，主要取决于灭活苗的剂型和抗原含量。就病毒性灭活疫苗的剂型来讲， 目前看来油乳剂灭活苗的效果最为确实；就抗原含量来讲，为确保单位容 积疫苗内抗原含量，开始使用抗原浓縮技术。目前通用的抗原浓縮技术主 要有浓縮胶浓縮法、沉淀浓縮法、离心浓縮法、透析浓縮法、冷冻干燥法、 层析浓縮法和过滤浓縮法。由于过滤浓縮法具有成本低，过滤膜能反复使 用，过滤量大，同时对抗原成份能进行一定程度的纯化等优点，已被国内外的研究和生产者普遍采用，其中用Milipore超滤膜浓縮法(Miliporee 超滤浓縮机30KD的浓縮膜及其配件，购自美国Millipore公司)已在国外 很多生产厂家投入生产使用，国内也有不少厂家在研究使用[3]。发明人在 查阅大量的相关文献和分析从新城疫病毒分子大小的基础上，引进国外的 先进的超滤浓縮技术，采用截流分子量为30KD的Milipore超滤膜进行NDV 鸡胚液的浓縮。此技术可在lh内处理数10L抗原液，为规模化生产提供了 方便。同时去除了疫苗中的部分杂蛋白被，增加了疫苗中有效抗原的含量， 使得免疫后可以快速的产生有效的免疫应答，提高了免疫应答的效率。
有益效果
本发明采用标准的鸡新城疫毒株，经鸡胚传代培养，采用Milipore超 滤膜浓縮法浓縮灭活后制成油乳剂疫苗，试验证明30KD的膜能将病毒胚液 中全部抗原成份截留；
超滤浓縮膜的浓縮效果稳定性良好，浓縮后抗原的HA效价与浓縮倍数 成正相关；
生产上对效价偏低的胚液可以通过加大浓縮倍数的方法提高效价。实 际生产中可以根据制品要求通过简便快速的HA试验确定浓縮倍数；
对灭活疫苗来讲，发明人用的主要是其抗原成份，而不是活病毒的含 量，因此在对浓縮后抗原含量测定时应以检测HA效价为主。并且HA效价 测定简便、快捷、易行，在生产中也便于实行；
使用Millipore超滤浓縮膜浓縮抗原，效果好，稳定性强，适于一定 规模的生产使用；
用疫苗免疫鸡后10 14天产生坚强免疫力，免疫期10个月，免疫期 内攻毒保护率100%。
具体实施例方式
本发明将结合具体实施例做进一步的说明，这些实例仅用于说明目的， 而不用于限制本发明范围。
实施例1
鸡新城疫病毒弱毒LaSota株作为毒种，接种10日龄SPF鸡胚，收获 接种后72-120小时死亡且病痕明显的鸡胚液，采用截流分子量为30KD的 Milipore超滤膜进行NDV鸡胚液的浓縮，浓縮后加入福尔马林液使含量达 0.2%。摇匀后37"C灭活16小时。在灭活前，按部颁标准进行病毒含量的测 定，病毒含量〉108.8EID50/0. lml。取灭活病毒液接种于SPF鸡胚6个， 观察5日，鸡胚非特异性死亡不超过1个。对所有胚液分别测定血凝价， 均不出现血凝时备用。在灭活毒液中加入无菌5%吐温-80，为水相；在10 号白油中加入6%司本-80，再加入2%硬脂酸铝，灭菌后为油相。在高压乳 化泵中将水相和油相按l: l比例混合乳化，即成鸡新城疫浓縮灭活苗，病 毒含量〉108. 8EID50/0. lml。
该疫苗经性状测定和安全性试验表明，为油包水类型，稳定性良好， 粘度适中，安全可靠。该疫苗在4"C保存12个月不出现分层。同时测定其 浓縮前和浓縮后的 EID50 从 106. 31EID50/0. lml 升高到 108. 84EID50/0. lml;血凝价从29上升到211。试验鸡接种本疫苗后10 14天产生坚强的免疫力，免疫期10个月，免疫期内的攻毒保护率为100%。
实施例2
鸡新城疫病毒弱毒LaSota株接种10日龄SPF鸡胚，收获接种后72-120 小时死亡且病痕明显的鸡胚液，采用截流分子量为30KD的Milipore超滤 膜进行NDV鸡胚液的浓縮，浓縮后加入福尔马林液使含量达0. 2%。摇匀后37"C灭活16小时。对灭活后的病毒液做灭活检验，灭活完全的毒液备用。 在灭活毒液中加入无菌5%吐温-80，为水相；在10号白油中加入6%司本-80， 再加入2%硬脂酸铝，灭菌后为油相。在高压乳化泵中将水相和油相按l: 1 比例混合乳化，即成鸡新城疫浓縮灭活苗，病毒含量〉108.8EID50/0. lml。 本苗适用于各养禽场对禽类的免疫接种，安全可靠。疫苗免疫鸡后10 14天产生坚强的免疫力，免疫期10个月，免疫期内的攻毒保护率为100%。
权利要求
1. 一种鸡新城疫浓缩灭活苗的生产方法，包括以下步骤1)将鸡新城疫病毒弱毒株冻干毒复溶，连续传代接种鸡胚9代，分别冻干保存，作为生产鸡新城疫浓缩型灭活疫苗的基础种毒和生产用种毒；2)将病毒液灭活后，使用30KD膜包对病毒超滤浓缩5倍；3)在高压乳化泵中将浓缩后的水相与油相按11比例混合乳化，即成鸡新城疫浓缩灭活疫苗，灭活前的病毒含量>106.3EID50/0.1ml。
2. 权利要求1所述的方法，其中在实施步骤3之前还可在灭活毒液中加入无菌5%吐温-80，为水相；在10号白油中加入6%司本-80，再加入2°/0硬脂酸铝，灭菌后为油相。
3. 权利要求1或2所述的方法，其中鸡新城疫病毒弱毒株优选是LaSota，效检用强毒优选是鸡新城疫病毒强毒北京株(CVCCAV1611株)。
全文摘要
本发明提供一种改进的鸡新城疫浓缩灭活苗的生产方法，包括病毒接种传代、超滤浓缩、水相和油相混合等步骤。其中，使用30KD膜进行超滤浓缩，并在高压乳化泵中将浓缩后的水相与油相按1∶1比例混合乳化。由于本发明利用超滤膜浓缩和抗原成份，而不是活病毒的含量，因此所疫苗免疫鸡后10～14天产生坚强免疫力，免疫期10个月，免疫期内攻毒保护率100％，具有广阔的应用前景。
文档编号A61K39/155GK101474401SQ200810153998
公开日2009年7月8日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者杨保收, 蕊 熊 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司