一种簸箕柳抗性苗的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体地说设及一种鑛貸柳抗性苗的制备方法。
【背景技术】
[0002] 鑛貸柳（SalixsuchowensisQieng)，杨柳科（Salicaceae)柳属（Salix)，落叶丛 生多年生灌木植物，枝条呈黄绿色或略带紫色，叶互生，披针形，长度超过10cm，无毛。花先 叶开放，花期为3月，果期在4-5月。产地主要分布在淮河流域，浙江、江苏、山东、河南等地 也有栽培。鑛貸柳个体小，世代周期短，一般一年即可开花，自然变异丰富。该些特点使得 鑛貸柳更适合于开展大规模田间试验，是进行林木遗传研究的理想材料。
[0003] 遗传转化技术是研究基因功能的重要手段，然而到目前为止，人们对木本植物基 因功能的相关研究还很有限，关于柳树的遗传转化研究还停留在再生体系的初步探索阶 段，并未获得突破性的研究成果。因此，研究鑛貸柳组培再生体系，并建立稳定的遗传转化 系统，对于今后大规模开展鑛貸柳乃至杨柳科植物的遗传转化研究，推动林木功能基因组 研究具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 发明目的；针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种鑛貸柳抗性苗 的制备方法，为林木植物基因功能研究和遗传改良提供一个新途径。
[000引技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0006] 一种鑛貸柳抗性苗的制备方法，包括W下步骤：
[0007] 1)将鑛貸柳组培苗置于基本培养基上继代繁殖；
[000引 2)选取继代的组培苗茎，剪成l-2cm长的茎段，剪去周围的叶片，作为外植体接种 于分化培养基上预培养2-3d;分化培养基为WP培养基，附加细胞分裂素6-BA0. 1-1.Omg/L细胞分裂素TDZ0. 005mg/l，生长素IBA0. 01-0. 005mg/l，庶糖 30g/l，水晶洋菜 2g/L;
[0009] 3)挑取农杆菌的菌落接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养后，取部 分转接至LB液体培养基中，待菌体进入指数生长期，通过离屯、得到菌体，取WP液体养基培 养基悬浮菌体，获得侵染菌液.
[0010] 4)将步骤。的预培养后的茎段浸入步骤如的侵染菌液，振荡，浸泡10-20min后， 除去多余菌液，放回分化培养基上进行共培养；
[0011] 5)对共培养后的茎段洗漆除去农杆菌，转移到分化筛选培养基上培养，定期更换 分化筛选培养基，直至分化出可见卡那霉素抗性芽；
[0012] 6)将卡那霉素抗性芽连转移到不定芽伸长筛选培养基上继续培养；
[0013] 7)待抗性芽伸长至l-2cm，将每个抗性芽分离独立，移入生根筛选培养基中培养， 经过一段时间的继代培养即可得到完整的抗性苗。
[0014] 步骤1)中，所述的基本培养基为1/2WP，附加庶糖25-30g/l，水晶洋菜2g/L，pH 5. 8,121 ± 1°C，灭菌 18min。
[0015] 步骤2)中，所述的预培养条件为，培养温度25±2°C，光照3000-40001UX，光照时 间1化/d。
[0016] 步骤2)中，所述分化培养基为WP培养基，附加细胞分裂素6-BA0.5mg/l，细胞分 裂素TDZ0. 005mg/l，生长素IBA0.Olmg/l，庶糖 30g/l，水晶洋菜 2g/L。
[0017] 步骤如中，所述的LB液体培养基中卡那霉素的浓度为40mg/L。
[00化]步骤扣中，所述WP液体培养基悬浮菌体的ODe。。值为0. 6。
[0019] 步骤5)中，所述分化筛选培养基为在分化培养基中，附加头抱霉素浓度为200mg/ L，卡那霉素浓度为40mg/L。
[0020] 步骤6)中，所述不定芽伸长筛选培养基为WP，附加细胞分裂素6-BA0. 5mg/l，生 长素IBA0.Olmg/L，头抱霉素200mg/L，卡那霉素40mg/L。
[0021] 步骤7)中，所述生根筛选培养基为1/2WP，头抱霉素浓度为lOOmg/l，卡那霉素的 浓度为40mg/l，庶糖25g/L，水晶洋菜2g/L。
[0022] 有益效果；与现有技术相比，本发明的鑛貸柳抗性苗的制备方法，确定了鑛貸柳采 用农杆菌介导的转基因基本方法W及合适的转化、培养条件，为林木植物基因功能研究和 遗传改良提供一个新途径。
【附图说明】
[0023] 图1是茎段分化培养图；
[0024] 图2是芽伸长培养图；
[0025] 图3是生根培养图；
[0026] 图4是完整的抗性植株图。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，该实施例可W使本领域技术人员 更全面地理解本发明，但不W任何方式限制本发明。
[00測 实施例1
[0029] 鑛貸柳组培苗W茎段分化不定芽的方式继代繁殖。培养所用的基本培养基为 1/2WP，庶糖25-30g/L，抑5. 8,水晶洋菜2g/L，121 ±rC，灭菌18min。附加的生长素、细胞分 裂素和抗生素均为过滤灭菌，加入高压灭菌后冷却到40°C左右的培养基中。在继代约1个 月的试管苗上选取生长状态基本一致的幼嫩茎段，剪成约l-2cm长的茎段作为外植体，接 种到分化培养基中预培养，如图1所示。培养温度为25±2°C，光照3000-40001UX，光照时 间16h/d，预培养2-3d。挑取农杆菌D册a的单菌落接种到LB液体培养基中，加入卡那霉素 40mg/L，于28°C振荡培养（220-230巧m)，过夜；次日取1血转接50血的LB液体培养基。培 养至一定浓度（进入指数生长期）；500化pm离屯、5-lOmin收集菌体，取适当WP液体培养基 悬浮菌体至ODe。。值为0. 6左右备用。将预培养后的外植体茎段浸入侵染菌液，超声波10s， 轻微振荡，充分浸泡10-20min左右，在无菌滤纸上吸去多余菌液，接种到分化培养基（不含 抗生素）上进行共培养。暗中共培养2-4d后，用加入头抱霉素的无菌水洗漆6-8次W除去 农杆菌，无菌滤纸吸去多余的水分，接种到分化培养基（含相应量的头抱霉素和卡那霉素） 上培养。lOd左右更换一次分化培养基，直至分化出可见卡那霉素抗芽，如图2所示。将卡 那霉素抗性芽连同原外植体一同移入不定芽伸长筛选培养基，20d左右更换一次芽伸长培 养基。待抗性芽伸长至l-2cm左右，将每个抗性芽分离独立接入生根筛选培养基继续培养， 如图3所示，经过一段时间的继代培养即可得到完整的抗性苗，如图4所示。
[0030] 使用的各培养基，具体配方为：基本培养基；1/2WP+庶糖25g/L+水晶洋菜2g/L; 鑛貸柳茎段分化培养基；WP+6-BA0. 5mg/L+TDZ0. 005mg/L+NAA0. 01mg/L+ 庶糖 30g/L+ 水 晶洋菜2g/L;分化筛选培养基；分化培养基+头抱霉素（cef)100mg/L+卡那霉素化an)40mg g/L;适合芽伸长的培养基配方为WP+6-BA0. 5mg/L+IBA0. 01mg/L+庶糖30g/L+水晶洋菜 2g/L;芽伸长筛选培养基；芽伸长培养基+头抱霉素（cef) 100mg/L+卡那霉素化an)40mg/ L;适合生根的培养基配方为1/2WP+庶糖25g/L+水晶洋菜2g/L;生根筛选培养基；生根培 养基+头抱霉素（cef) 100mg/L+卡那霉素化an) 30mg/L。
[0031] 实施例2
[0032] 基本培养基只能维持植物的生存W及最低的生理活动需求，因此需要在基本培养 基中添加细胞分裂素KT和6-BA。鑛貸柳抗性苗的制备方法同实施例1，其中采用不同浓度 的细胞分裂素进行不定芽诱导，各浓度和结果如表1和表2所示。
[0033] 表16-BA对鑛貸柳不定芽诱导的影响
[0034]
[0037] 出芽率（％ )=萌芽的外植体个数/接种的外植体总个数X 100%。
[0038] 褐化率（％ )=褐化的外植体个数/接种的外植体总个数X 100%。
[0039] 通过对表1、表2结果分析可W得出，不同浓度的细胞分裂素对不定芽的诱导有不 同的影响。随着6-BA浓度的增加，鑛貸柳外植体的出芽率不断增加，6-BA浓度达到一定值 之后，出芽率开始降低，呈抛物线式的规律，同时随着6-BA浓度的增加，外植体的褐化率不 断增加；当KT浓度增加时，鑛貸柳外植体的出芽率也呈抛物线式变化，褐化率会随之升高； 比较两组实验结果，添加6-BA出芽率略高，因此本申请添加的6-BA浓度最优为0. 5mg/L。
[0040] 实施例3
[0041] 基本培养基只能维持植物的生存W及最低的生理活动需求，因此需要在基本培养 基中添加TDZ和NAA。鑛貸柳抗性苗的制备方法同实施例1，其中采用不同浓度的TDZ和 NAA进行培养，结果如表3。
[0042] 表3不同浓度的TDZ、NAA组合对不定芽增殖的影响
[0043]
[0044] 芽增殖系数=增殖外植体数/外植体总数X100%。
[0045] 从表3可知，TDZ浓度对不定芽增殖有非常显著的影响，能够有效的诱导外植体产 生不定芽。NAA促进细胞伸张，芽的生长，对不定芽的生长有重要作用。利用不同的TDZ与 NAA浓度组合能够显著促进不定芽分化。不同的TDZ和NAA浓度组合对芽增殖有不同的促 进作用，由结果得出合适的TDZ和NAA的组合浓度分别为0. 005mg/L、0.Olmg/L。
[0046] 实施例4
[0047] 鑛貸柳抗性苗的制备方法同实施例1，其中采用不同预培养时间进行培养，结果如 表4。
[0048] 表4预培养时间对转化率的影响
[0049]
[005