0] 在试验中，不经过预培养直接剪取外植体侵染时，采集材料的时间受到限制，剪取 过早的材料会萎黨影响分化，而菌液离屯、后再取材料仍需较长时间，该样影响ODe。。的准确 性，可行性降低。同时，直接剪取材料容易发生污染从而影响实验，而经过2d的预培养，可 提早识别出污染的材料。因此在实际的遗传转化试验中，选择2d作为最佳预培养时间。 [0化1]实施例5
[0052] 鑛貸柳抗性苗的制备方法同实施例1，其中采用不同菌液浓度进行培养，结果如表 5。
[0化3] 表5菌液浓度对遗传转化的影响
[0054]
[0055] 不同生长时期的农杆菌的侵染能力大大不同，对数增长期的农杆菌活力最强。菌 液浓度过高会因为营养不足造成内部竞争加剧，实际具有侵染能力的农杆菌数量减少，降 低转化率，同时过高的浓度会造成植物外植体组织褐化，农杆菌污染严重，在后期的培养中 难W控制。而过低的菌液浓度，菌体数量少，实际具有侵染能力的菌体更少，因此转化率低。 由表5可知，转化效率较高的菌液浓度为ODe。。值为0. 6左右。
[0056] 实施例6
[0057] 鑛貸柳抗性苗的制备方法同实施例1，其中采用不同侵染时间进行培养，结果如表 6。
[005引表6侵染时间对遗传转化的影响
[0059]
[0060] 侵染时间的长短对遗传转化的效果有重要的影响。研究表明，侵染时间过长会诱 导植物细胞自身免疫抗性反应，引起转化率降低。但是如果侵染时间过短，农杆菌不能有效 地侵染外植体，同样会降低转化效率，通过结果分析，确定最适宜的侵染时间为20min。
[0061] 实施例7
[0062] 鑛貸柳抗性苗的制备方法同实施例1，其中采用不同共培养时间进行培养，结果如 表7。
[0063] 表7共培养时间对遗传转化的影响
[0064]
[00化]共培养时间也对遗传转化也有重要影响。农杆菌侵染植物外植体后所携带的外源 基因不会立即转化，其T-DNA转移并且整合到植物体内需要一定的时间。如果共培养时间 过短，农杆菌的生长量不足会造成转化效率降低；而共培养时间过长，则会引起农杆菌过度 生长，造成植物细胞溺死，过量的农杆菌会阻断植物细胞对营养成分的正常吸收，抑制植物 细胞的生长最终导致植物死亡。优选的共培养时间为3d左右。
[0066] 实施例8
[0067] 鑛貸柳抗性苗的制备方法同实施例1，其中采用不同卡那霉素浓度进行培养，具体 如下：
[0068] 1)分化培养中卡那霉素的浓度
[0069] 不同浓度的卡那霉素对外植体的分化会产生不同的影响。在转基因植株抗性芽的 筛选中，过低的卡那霉素浓度会造成假阳性，增加后期分子检测的工作量。在本试验中，将 需要分化的茎段放在加入不同kan浓度的分化培养基中进行培养，30d后进行观察。分析结 果（表8)可知，当卡那霉素化an)浓度为Omg/L时，茎段正常分化，产生大量不定芽且不定 芽生长状况良好；当卡那霉素化an)浓度为lOmg/L时，大部分茎段能够分化出不定芽，分化 率为46%;当卡那霉素化an)的为20mg/L时，茎段开始出现黄化，分化率降低至22%;当卡 那霉素化an)的浓度增加到30mg/L时，外植体茎段黄化严重，呈现黄褐色，不定芽非常少； 进一步增加卡那霉素化an)的浓度至40mg/L时，外植体全部褐化死亡。因此，40mg/L的卡 那霉素化an)浓度可W抑制非转基因芽的生长，所W选择压浓度为卡那霉素化an)40mg/L。
[0070] 表8不同卡那霉素浓度对分化率的影响
[0071]
阳072] 2)生根卡那霉素的浓度
[0073] 不同植物材料对卡那霉素的敏感度不同，植物的不同组织对卡那霉素的敏感度也 不一样，根较其他部位而言，对卡那霉素的敏感度更强，在一定浓度的卡那霉素筛选培养基 上种植野生型植株，很难生根，而转基因植株则能够正常生根。从表9可知，卡那霉素浓度 为Omg/L时，不定芽可W正常生根；当卡那霉素化an)的浓度为lOmg/L时，抗性芽生长缓 慢，生根的不定芽数量大量减少，生根率为42% ;当卡那霉素的浓度增加到20mg/L时，不定 芽黄化，生根的不定芽数量很少；当卡那霉素的浓度增加到30mg/L时，不定芽黄化枯萎，不 生根。30mg/L的卡那霉素浓度可W抑制非转化芽的正常生根，而转化的不定芽则可W正常 生长，因此，生根培养基的看霉素浓度定位30mg/L。
[0074] 表9不同卡那霉素浓度对生根的影响
[0075]
[0076] 实施例9
[0077] 鑛貸柳抗性苗的制备方法同实施例1，其中采用不同头抱霉素类抗生素浓度进行 培养。头抱霉素类抗生素具有广谱抗性，研究表明，其对植物细胞的生长无明显毒害。本实 施例选择头抱霉素（cef)作为遗传转化试验中的抑菌抗生素。一定浓度的头抱霉素（cef) 对存在于外植体表面及浅层组织中的农杆菌起到抑制作用。但浓度过高的头抱霉素可能 会影响植物的正常生长。为确定头抱霉素（cef)本底浓度，设置了 4个梯度；0、100、200、 300mg/L。吸取100y1已活化的含目的基因的农杆菌EHA105菌液，添加到含有不同浓度的 头抱霉素（cef)的3mLLB液体培养基中，恒温摇床28°C，220rpm培养。观察头抱霉素（cef) 对农杆菌生长的抑制情况，W确定其最有效的头抱霉素本底浓度。将未经侵染的鑛貸柳茎 段放入到含不同头抱霉素（cef)浓度的筛选培养基中培养。设置4个浓度水平；0、100、200 和300mg/l，每隔lOd更换一次筛选培养基，培养20d后进行观察。
[007引通过试验发现，头抱霉素浓度为200mg/L时，对农杆菌有良好的抑制效果且不影 响外植体的正常生长。
【主权项】
1. 一种簸箕柳抗性苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将簸箕柳组培苗置于基本培养基上继代繁殖； 2) 选取继代的组培苗茎，剪成1-2 cm长的茎段，剪去周围的叶片，作为外植体接种于分 化培养基上预培养2-3d;分化培养基为WP培养基，附加细胞分裂素6-BA 0. 1-1.0 mg/L，细 胞分裂素11)2 0.005 11^/1，生长素184 0.01-0.00511^/1，蔗糖30§/1，水晶洋菜2 8/1; 3) 挑取农杆菌的菌落接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，振荡培养后，取部分转 接至LB液体培养基中，待菌体进入指数生长期，通过离心得到菌体，取WP液体养基培养基 悬浮菌体，获得侵染菌液； 4) 将步骤2)的预培养后的茎段浸入步骤3)的侵染菌液，振荡，浸泡10-20min后，除去 多余菌液，放回分化培养基上进行共培养； 5) 对共培养后的茎段洗涤除去农杆菌，转移到分化筛选培养基上培养，定期更换分化 筛选培养基，直至分化出可见卡那霉素抗性芽； 6) 将卡那霉素抗性芽连转移到不定芽伸长筛选培养基上继续培养； 7) 待抗性芽伸长至l_2cm，将每个抗性芽分离独立，移入生根筛选培养基中培养，经过 一段时间的继代培养即可得到完整的抗性苗。2. 根据权利要求1所述的簸箕柳抗性苗的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的基 本培养基为1/2WP，附加蔗糖25-30 g/L，水晶洋菜2 g/L，pH 5.8，121±1°C，灭菌18 min。3. 根据权利要求1所述的簸箕柳抗性苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的预 培养条件为，培养温度25±2°C，光照3000-4000 lux，光照时间16 h/d。4. 根据权利要求1所述的簸箕柳抗性苗的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述分化 培养基为WP培养基，附加细胞分裂素6-BA 0. 5 mg/L，细胞分裂素TDZ 0.005 mg/L，生长素 IBA 0.01 mg/L，鹿糖 30 g/L，水晶洋菜 2 g/L。5. 根据权利要求1所述的簸箕柳抗性苗的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的 LB液体培养基中卡那霉素的浓度为40 mg/L。6. 根据权利要求1所述的簸箕柳抗性苗的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述WP 液体培养基悬浮菌体的〇D_值为0. 6。7. 根据权利要求1所述的簸箕柳抗性苗的制备方法，其特征在于，步骤5)中，所述分化 筛选培养基为在分化培养基中，附加头孢霉素浓度为200 mg/L，卡那霉素浓度为40 mg/L。8. 根据权利要求1所述的簸箕柳抗性苗的制备方法，其特征在于，步骤6)中，所述不定 芽伸长筛选培养基为WP，附加细胞分裂素6-BA 0. 5 mg/L，生长素IBA 0.01 mg/L，头孢霉素 200 mg/L，卡那霉素 40 mg/L。9. 根据权利要求1所述的簸箕柳抗性苗的制备方法，其特征在于，步骤7)中，所述生根 筛选培养基为1/2WP，头孢霉素浓度为100 mg/L，卡那霉素的浓度为40 mg/L，蔗糖25 g/L， 水晶洋菜2 g/L。
【专利摘要】本发明公开了一种簸箕柳抗性苗的制备方法，包括外植体和制备和预培养、侵染菌液的制备、侵染、共培养、洗菌，分化筛选培养直至分化出可见卡那霉素抗性芽，转移到不定芽伸长筛选培养基上继续培养，待抗性芽伸长至1-2cm，将每个抗性芽分离独立，移入生根筛选培养基中培养，经过一段时间的继代培养即可得到完整的抗性苗。该方法包括从外植体选择、培养基筛选、激素调配、抗生素敏感性、培养条件等方面建立出簸箕柳抗性苗的系统制备方法，为林木基因功能研究提供新途径。
【IPC分类】A01H5/00, A01H4/00, C12N15/84
【公开号】CN104988180
【申请号】CN201510379029
【发明人】诸葛强, 杜明会, 尹佟明, 潘惠新, 李大为, 孙伟博
【申请人】南京林业大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年7月1日