番茄HsfA1a基因在提高植物自噬体活性及抗旱性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设一种番茄化fAla基因在提高植物自瞻体活性 及抗旱性中的应用。
【背景技术】
[0002] 进入21世纪W来，现代农业发展已经成为世界农业发展的主流。设施农业作为现 代农业主要形式，已经成为各国农业发展重点。据统计，2011年中国蔬菜产值达到1. 26万 亿元，首次超过粮食总产值，成为中国产值最大的农产品。我国设施农业的总体发展水平还 不高，设施结构简单，资金投入不足，设施装备落后，抵御自然灾害的能力差，近年来，全球 气候恶化，二氧化碳升高，全球气候变暖，干旱等自然灾害频繁发生，对农业的产量及品质 造成了极大的威胁。
[000引 番茄（SolanumlycopersicumL.)是茄科（Solanaceae)茄属中的一年生或多年 生草本植物，别名西红柿、洋柿子，是世界范围内栽培最广、消费量最大的蔬菜作物。番茄品 种类型丰富，既可鲜食作蔬菜又可作水果，番茄中的番茄红素成分可预防各种癌症，是世界 上最流行的健康食品之一。番茄在设施蔬菜中占有重要地位，因此提高番茄应对不良环境 的能力，培育抗性品种具有重要的实际生产意义。
[0004] 热激转录因子化eatstresstranscriptionfactor,Hsf)广泛存在于动植物 体内，是植物应答高温等逆境胁迫的重要信号转导元件，能够识别特定的热激元件化eat stresselements,服Es)，主要调节热激蛋白化eatshockproteins，Hsps)的表达，在蛋白 质的折叠、分布及降解中热激蛋白作为重要的分子伴侣发挥重要的作用。当植物细胞受到 如高温、低温、干旱、机械伤等逆境后，Hsf会被磯酸化激活，转至细胞核与下游逆境响应基 因启动子上的服E特异性结合，加速该些基因的转录表达，从而增强植物对逆境胁迫的抗 性。植物Hsf是一个复杂的基因家族，在拟南芥中有21个，水稻中有25个，番茄有24个。 根据它们的结构将其分为A、B和CS类。
[0005] 目前对化f的研究主要集中在其对逆境胁迫的响应及对下游热激蛋白的调控上。 拟南芥的A地sfAla、A地sfA化能被高温诱导，而A地sfA2基因缺失后，使植株的耐热性显著 下降，关于番茄的化f的研究主要集中在A族及其在高温胁迫中的作用。番茄化fAla在高 温胁迫中是主要的调节因子，在热胁迫下，化fAla、化fA2和化巧1会结合形成=聚体诱导 Hsp70和化p90等化P的表达，化fAlaRNAi植株在热激后化fA2和化巧1的表达显著降 低，因此抗热性减弱。番茄化fAla在高温W外的其它胁迫中的作用尚未报道，因此深入研 究化fAla的功能，对研发抗性品种具有一定的理论指导意义。
【发明内容】
[0006] 本发明提供一种番茄化fAla基因在提高植物自瞻体活性及抗旱性中的应用，研 究番茄化fAla在高温W外的其它胁迫中的应用。
[0007] 番茄化fAla基因在提高植物自瞻体活性及抗旱性中的应用。包括如下步骤：
[000引 （1)构建含番茄化fAla基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A和含番茄化fAla 基因沉默载体的根癌农杆菌工程菌B;
[0009] (2)将所述根癌农杆菌工程菌A介导转化目标植物外植体，制备得到化fAla基因 转基因植株；将所述根癌农杆菌工程菌B浸染目标植物子叶，制备得到化fAla基因沉默植 株；
[0010] (3)将所述化fAla基因转基因植株和化fAla基因沉默植株进行干旱胁迫处理，观 察植株自瞻体的数目和抗旱表型。
[ocm] 本发明的应用是指碱基序列如SEQ TD NO ;1所示的化fAla基因编码的蛋白在调 控植物自瞻体活性和干旱抗性中的至少一种应用。具体表现为自瞻体数目增加或减少W及 干旱抗性增强或降低。
[0012] 化fAla基因在植物中的表达量越低，在干旱胁迫下所述植物叶片内自瞻体的数目 越少，对干旱越敏感；HsfAla基因在所述植物中的表达量越高，在干旱胁迫下所述植物叶 片内自瞻体的数目越多，增强干旱的抗性。
[001引本发明所提供的培育抗旱转基因植物的方法，具体可分为如下（A)或炬）；
[0014] (A)培育具有自瞻体数目增加和/或植株抗旱性增强目的性状的转基因植物，包 括如下步骤：
[0015] a)向目标植物中导入碱基序列如SEQ TD NO ;1所示化fAla基因进行过表达，得 到化fAla基因过表达的转基因植株；
[0016]b)将化fAla基因过表达的转基因植株与未处理的目标植物相比，得到具有自瞻 体数目增加和/或植株抗旱性增强目的性状的转基因植物。
[0017] 做培育具有自瞻体数目减少和/或植株抗旱性减弱目的性状的转基因植物，包 括如下步骤：
[0018] a)向目标植物中导入碱基序列如SEQ TD NO ;1所示化fAla基因进行抑制表达， 得到化fAla基因沉默转基因植株；
[0019]b)将化fAla基因沉默转基因植株与未处理的目标植物相比，得到具有自瞻体数 目减少和/或植株抗旱性减弱目的性状的转基因植物。
[0020] 在上述方法（A)中，HsfAla基因可通过含有所述基因的重组表达载体导入目的植 物中，重组表达载体可用已有的pFG巧941、PCAMBIA1300和地1121等或其它衍生植物表达 载体，使用植物表达载体构建重组载体时，可W使用组成型、组织特异型或诱导型启动子。
[0021] 在上述方法炬）中，在目的植物中对，HsfAla基因进行抑制表达，可为任何可降低 目的植物中所述化fAla基因的表达的方法。在本发明中，在目的植物中对化fAla基因进 行抑制表达是通过病毒诱导的基因沉默的方式实现的。
[0022] 所述番茄化fAla基因选自W下两种中任意一种：
[002引 a、所述番茄化fAla基因的碱基序列如SEQTDNO;1所示；
[0024]b、任一其碱基序列与SEQTDNO;1所示序列有90%W上同源性且编码如SEQTD NO;2所示氨基酸序列的DNA分子。
[0025] 所述根癌农杆菌工程菌A和根癌农杆菌工程菌B的制备方法如下：
[0026] (a)从番茄幼嫩叶片中提取总RNA;
[0027] (b)将步骤（a)中获得的番茄总RNA反转录成cDNA ;
[002引（C)W步骤化）获得的cDNA为模板，SlHsfAlaOEF(SEQ TD NO ;3)和S化sfAlaOER(SEQ TD N0;4)为引物（含AscI和化nl限制性酶切位点）对化fAla基因进 行扩增，连接到PFGC1008-HA载体得0E载体；S化sfAlaF(SEQ TD N0;5)和SlHsfAlaR(SEQ TD NO ;6)为引物（含甜al和BamHI限制性酶切位点）对化fAla基因进行扩增，连接到 PTRV2载体得VIGS载体；
[0029] (d)将步骤（C)获得的0E载体转入根癌农杆菌EHA105中，获得含化fAla基因植 物过表达载体的根癌农杆菌工程菌A ;将步骤（C)获得的VIGS载体转入根癌农杆菌GV3101 中，获得含化fAla基因沉默载体的根癌农杆菌工程菌B。
[0030]从番茄幼嫩叶片中提取总RNA采用Tiangen Plant total RNA extraction kit, 其步骤为：
[0031] (1)取0.Ig叶片在液氮中磨碎，加1血裂解液，祸旋混匀；
[0032] (2)将均浆样品在15-30°C放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；
[0033] (3)4°C，12, 000巧m离屯、5min，弃上清，转入一个新的无RNase的离屯、管中。
[0034] (4)加入200化氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min ;
[0035] 巧)4°C，12, 00化pm离屯、lOmin，样品会分为S层；黄色的有机相，中间层和无色的 水相，RNA主要在水相中，水相的体积约为所用裂解液RZ试剂的50%。把水相转移到新管 中，进行下一步操作；
[0036] (6)缓慢加入0.5倍体积的无水己醇，混合均匀（此时肯能会出现沉淀）。将得到 的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3,4°C，12, 00化pm离屯、30s，弃掉收集管中的废液；
[0037] (7)向吸附柱CR3中加入500化去蛋白液畑，4°C，12, 000巧m离屯、30s，弃废液；
[003引 做向吸附柱CR3中加入600yL漂洗液RW，室温静止2min，4°C，12, 000巧m离屯、 30s，弃废液；
[0039] (9)重复操作步骤做；
[0040] (10)将吸附柱放入2血收集管中，4°C，12, 00化pm离屯、2min，去除残余废液；
[0041] (11)将吸附柱CR3转入一个新的离屯、管中，加入50yLRNase-Free (1地2〇,室温 放置 2min，4°C，12, 000巧m离屯、2min;
[0042](。）用紫外分光光度计测定0〇26。/〇〇28。检验RNA样品含量与纯度，并用琼脂糖凝 胶电泳对RNA的质量进行检验。
[004引将番茄总RNA反转录成cDNA采用Toyobo ReverTra Ace qPCR RT Kit。
[0044] 所用引物序列如下：
[0045] SlHsfAla犯F ;5< -TTGGCGCGCCATGGAGCCGAATTCTTAT-3f (沈Q TD NO ;3)，
[0046] SlHsfAla犯R的序列为；5'-GGGGTACCGATCATATGTTTTTGTTG-3'(沈Q TD NO ;4)，
[0047] SlHsfAlaF ;5' -GCTCTAGACATCTCAGTCATCATCTC-3'(沈Q TD NO ;5)，
[0048] SlHsfAlaR;5'-CGCGGATCCGCGCCGTCTGCAACATTG-3'(沈Q TD NO ;6)。
[0049] 本发明中自瞻体数目的观察方法如下：
[0050] 采用单丹横酷尸胺（monodansylcadaverine，MDC)染色和透射电镜 (transmission electron microscopy，TEM)。
[CK)5U MDC染色，具体方法为；
[0化引a)将番茄叶片剪成2111111>&