液，回接到KCMS上，22°C共培养2d(避光）。反面朝上
[011引 3. 2选择培养、再生
[0116] 共培养后，将外植体小屯、的转入MRSU2Z+)上，2~3周后转入MRS2化2Z+)中培 养，选择培养的过程中要及时清理污染的材料，直至长出再生芽。
[0117] 4.再生芽生根、移栽
[0118] 待再生芽长至1cm左右时，将芽切下（可W不切，W免伤害生根部位），放入生根 培养基中生根。2周后对生根良好、长至5cm左右的转化苗进行炼苗，移栽至一次性塑料杯 中，成活后移栽至花盆中，得番茄化fAla基因过表达植株。
[0119] 实施例3
[0120] 构建番茄化fAla基因沉默植株
[0121] 本实施例中用的培养基和抗生素配制方法如下：
[012引YEB培养基的配制；5g牛肉膏，5g蛋白腺，Ig酵母提取物，5g庶糖，0. 5g M拆04? 7&0,用蒸馈水定容至比，调节抑值为7. 0，12rC高压灭菌20min备用。YEB固体 培养基每升加琼脂粉15g，其它分成份同液体培养基。
[012引卡那霉素；50mg/mU过滤除菌，-20°C分装保存。
[0124]利福平；50mg/mL甲醇溶解，过滤除菌，-20°C分装保存。
[012引庆大霉素；25mg/血购于上海生物工程有限公司，-20°C保存。
[0126] 侵染液配制；lOmM氯化儀、lOmM MES，抑=5.7,用时加150UM/L己酷了香酬。
[0127] 侵染方法如下；
[0128] (1)将含有目的基因的农杆菌GV3101 (根癌农杆菌工程菌B)划平板，36-4她出现 单菌落；
[0129] (2)挑取单菌落于含有4血YEB培养基的10血管中摇菌，在28°C条件下20化pm 摇菌2化；
[0130] (3)按1:100的比例将步骤（2)的菌液加入含有卡那霉素、利福平、庆大霉素3种 抗生素的50血Y邸培养基中扩大培至0Dew= 0. 8-1. 0 (约12h);
[0131] (4)4°C，4000g，离屯、lOmin，弃上清；
[0132] (5)预冷灭菌水20血洗漆，4000g，4°C，lOmin离屯、，弃上清；
[0133] 做重复步骤妨一次；
[0134] (7)预冷侵染液溶解沉淀至00日。。=1-1. 5 ;
[0135] (8)室温放置 3h，pTRVl;pTRV2-HsfAla= 1:1 混合侵染，pTRVl;pTRV2 = 1:1 混 合侵染作为对照；
[0136] (9)番茄幼苗两片子叶無平时，W注射法进行侵染。
[0137] 侵染后的番茄置于22/19°C，l化/她光周期，200ymolm-2s-i光强的人工气候室 培养，得到番茄化fAla基因沉默植株，同时制备pTRV空载体转染番茄植株W备对照，五叶 一屯、时开始干旱处理。
[013引 实施例4
[0139] 对实施例2和实施例3制备得到的番茄化fAla基因沉默植株和过表达植株干旱 胁迫处理
[0140] 番茄化fAla基因沉默植株干旱胁迫处理的具体方法如下：
[0141] 将pTRV空载体转染番茄植株及番茄化fAla基因沉默植株分为两组，一组为对照 组（包含pTRV空白对照和沉默植株），一组为实验组（包含pTRV空白对照和沉默植株）。
[0142] 当番茄长至五叶一屯、时实验组和对照组同时诱水至饱和，之后对照组植株正常诱 水，直至实验结束；实验组之后每隔1天ZigWSN记录仪测量一次相对±壤含水量（VWC)并 根据失水量补充水分使沉默植株与pTRV空白对照之间VWC保持一致，直至处理结束，实验 组整个干旱胁迫过程中控制相对±壤含水量从100%缓慢降低至30%左右，干旱胁迫时间 为13天。
[0143] 番茄化fAla基因过表达植株干旱胁迫处理时实验组和对照组中均W未转基因的 野生型番茄Ailsa化aig作为空白对照，其他处理同番茄化fAla基因沉默植株。
[0144] 实验结束即出现表型后拍照并测定电导率。结果如图1~5所示。
[0145] 图1为化fAla基因沉默植株中化fAl族基因表达。
[0146] 图2为Westernblot检测HsfAla过表达植株。其中1#、2#、3#、4#表示四个独立 的株系。
[0147] 图3为番茄化fAla沉默植株干旱胁迫下的表型。pTRV为对照植株，化fAla为沉 默植株，标尺=10cm。
[0148] 图4为番茄化fAla过表达植株干旱胁迫下的表型。WT为未转基因的野生型番茄 Ailsa化aig，0E为化fAla过表达植株，1#和3#为两个株系。标尺=10cm。
[0149] 图5为番茄化fAla沉默植株和过表达植株干旱胁迫下的电导率。pTRV为对照植 株，HsfAla为沉默植株；WT为未转基因的野生型番茄Ailsa&aig，0E为化fAla过表达植 株，1#和3#为两个株系。
[0150] 由图可知，化fAla沉默植株其表达量仅为pTRV的40%，而其同源基因的表达 与pTRV相比无差异，表明沉默植株为化fAla单基因沉默。Westernblotting结果表明， 化fAlaOE植株四个株系均能正常表达，且1#和3#表达量较高。干旱处理后，pTRV植株仅 下部老叶委焉，而pTRV-HsfAla植株严重委焉，说明沉默化fAla后明显降低了番茄对干旱 的抗性。干旱处理后，WT植株出现严重委焉，而化fAlaOE-1#和化fAlaOE-3#仅下部叶片 黄化萎黨，抗旱性明显高于WT植株。在正常水分供应下，所有植株的电解质渗透率相似， pTRV-HsfAla植株的电解质渗透率比pTRV增加了 58. 7%，HsfAlaOE植株显著提高了干旱抗 性，同WT相比，HsfAlaOE-1#和HsfAlaOE-3#的电解质渗透率分别降低47. 1%和53. 3%。
[0151] 实施例5
[0152] 番茄化fAla基因沉默植株和过表达植株干旱下自瞻体活性检测
[0153] 干旱胁迫过程同实施例4,番茄化fAla基因沉默植株和过表达植株干旱胁迫6天， 取样用MDC染色和TEM检测自瞻体的活性，W对照植株的自瞻体活性为1，实验结果见图 6~图9。
[0154] 图6A和图她为番茄化fAla沉默植株干旱胁迫下MDC染色。图6A为MDC染色结 果，图6B为对A图的统计结果。pTRV为对照植株，化fAla为沉默植株。标尺=25ym;图7A 和图7B为番茄化fAla过表达植株干旱胁迫下MDC染色。图7A为MDC染色结果，图7B为 对A图的统计结果。WT为未转基因的野生型番茄Ailsa化aig，OE为化fAla过表达植株， 1#和3#为两个株系。标尺=25ym;图8A和图8B为番茄化fAla沉默植株干旱胁迫下TEM 结果。A图为代表性的TEM结果，B图为对A图的统计结果。自瞻体用箭头指示，pTRV为对 照植株，化fAla为沉默植株。标尺=1ym。Cp，叶绿体；S，淀粉；V，液泡；图9A和图9B为 番茄化fAla过表达植株干旱胁迫下TEM结果。图9A为代表性的TEM结果，图9B为对A图 的统计结果。自瞻体用箭头指示，WT为未转基因的野生型番茄Ailsa化aig，OE为化fAla 过表达植株，1#和3#为两个株系。标尺=1ym。Cp，叶绿体；S，淀粉；V，液泡。
[0巧5] 结果表明，干旱可W诱导野生型番茄自瞻体的形成，化fAla基因沉默后阻碍了自 瞻体的诱导，而化fAla基因过表达能显著增加自瞻体活性，因此干旱胁迫下，番茄化fAla通过诱导自瞻体形成从而增强其抗旱性。
【主权项】
1. 番茄HsfAla基因在提高植物自噬体活性及抗旱性中的应用。2. 如权利要求1所述应用，其特征在于，包括如下步骤： (1) 构建含番茄HsfAla基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A和含番茄HsfAla基因 沉默载体的根癌农杆菌工程菌B ; (2) 将所述根癌农杆菌工程菌A介导转化目标植物外植体，制备得到HsfAla基因转基 因植株；将所述根癌农杆菌工程菌B浸染目标植物子叶，制备得到HsfAla基因沉默植株； (3) 将所述HsfAla基因转基因植株和HsfAla基因沉默植株进行干旱胁迫处理，观察植 株自噬体的数目和抗旱表型。3. 根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述番茄HsfAla基因的碱基序列如SEQ TD NO : 1所示。4. 根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述目标植物为双子叶植物或单子叶植物。5. 根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述目标植物为番茄。6. 根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述干旱胁迫处理的步骤为： 当HsfAla基因转基因植株及其空白对照或HsfAla基因沉默植株及其空白对照长至五 叶一心时，均浇水至饱和，之后每隔1~4天测量一次各自的相对土壤含水量并根据失水量 补充水分使Hsf AI a基因转基因植株与其空白对照之间或Hsf AI a基因沉默植株与其空白对 照之间土壤相对含水量保持一致，土直至处理结束。7. 根据权利要求6所述应用，其特征在于，干旱胁迫过程中控制土壤相对含水量从 100%逐步降低至30%。8. 根据权利要求6所述应用，其特征在于，干旱胁迫处理时间10~15天。
【专利摘要】本发明公开了一种番茄HsfA1a基因在提高植物自噬体活性及抗旱性中的应用。包括如下步骤：(1)构建含番茄HsfA1a基因过表达载体的根癌农杆菌工程菌A和含番茄HsfA1a基因沉默载体的根癌农杆菌工程菌B；(2)将所述根癌农杆菌工程菌A介导转化目标植物外植体，制备得到HsfA1a基因转基因植株；将所述根癌农杆菌工程菌B浸染目标植物子叶，制备得到HsfA1a基因沉默植株；(3)将所述HsfA1a基因转基因植株和HsfA1a基因沉默植株进行干旱处理，观察植株自噬体的数目和抗旱表型。本发明研究发现，干旱可以诱导野生型番茄自噬体的形成，HsfA1a基因沉默后阻碍了自噬体的诱导，而HsfA1a基因过表达能显著增加自噬体活性，因此干旱胁迫下，番茄HsfA1a通过诱导自噬体形成从而增强其抗旱性。
【IPC分类】C12N15/84, A01H5/00
【公开号】CN104988175
【申请号】CN201510251108
【发明人】周杰, 王玉, 喻景权
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年5月15日