一株对茶叶病源真菌具有抗性的深海沉积物来源枯草芽孢杆菌b5的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株对茶叶病源真菌具有抗性的深海沉积物来源枯草芽孢杆菌B5。该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis），其菌种保藏号为：CCTCC?M?2012384。该菌株活菌对常见茶叶病原真菌具有很强的拮抗性，能很好的适应各种环境，其加工产品可湿性粉剂能用于防治茶叶多种真菌病害。为茶园病害生物防治提供了一种新的菌株产品。
【专利说明】一株对茶叶病源真菌具有抗性的深海沉积物来源枯草芽孢
杆菌B5
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株具有抗茶叶多种病原真菌致病性的深海沉积物来源枯草芽孢杆菌B5，该菌对常见茶叶病原真菌致病性具有很强的拮抗效果。
【背景技术】
[0002]中国是茶叶的故乡，福建是主要茶区，茶树病虫种类繁多、发生危害重，茶树害虫达390多种、茶树病害100余种。病虫为害不仅造成茶叶减产、品质下降，如茶园不合理用药，农药残留超标突出，会污染环境，影响消费者健康，也严重阻碍茶叶出口，实施病虫综合治理是发展无公害茶叶生产，确保茶叶优质、高产和可持续发展的重要环节。目前，中国茶叶在世界上是产茶大国，但还不是产茶强国，有很大一部分原因就是因为化学农药残留问题影响了茶叶的出口。为避免茶农盲目用药，生产中应采取预防为主、综合防治的策略，在了解病虫害规律的基础上，采取多种措施进行防治，从而达到经济、无公害的防治效果。微生物农药具有高效率、低残留对人畜无害等特点，是一种非常合适的选择。
[0003]深海占地球表面积的49%，是地球表面最大的生物栖息场所，深海环境中微生物基因资源的开发具有现实、重要的资源及科学价值。典型深海特征为低温(<5°C )和高压(最高达IlOMPa)，据估计在此极端条件下，深海环境中可培养微生物还不到0.01%。深海微生物由于其处于高压、低温(部分区域如热液口为高温)、厌氧、极端PH梯度、高盐浓度、高金属浓度、无光照、寡营养、高卤素等到特殊极端环境中，可产生许多结构新颖、功能独特及毒副作用低的次生代谢产物，各种代谢产物常常导致深海微生物尤其是深海细菌具有独特的对陆生菌抗性。这类具有真菌抗性深海细菌如今也成为了研究开发的热点。
[0004]菌对植物病原真菌的拮抗作用包含多`种机制，一般认为有竞争作用、重寄生作用、抗生作用、诱导抗性以及协同拮抗作用。
[0005]竞争作用，主要为对生存空间和营养的竞争。枯草芽孢杆菌对环境的适应能力强、生长速度远快于病原菌，能与病原菌产生空间和营养的竞争，从而抑制其的生长，降低其种群数量，在抑制病原真菌过程中起着重要作用。酶的溶菌作用，枯草芽孢杆菌可以产生一系列挥发性和非挥发性的次生代谢物，抑制病原菌的生长，主要与3_1，3葡聚糖酶、几丁质酶、木聚糖酶、蛋白酶和纤维素酶等有关，通过酶的作用使真菌细胞壁遭到破坏，继而引起原生质解体。抗生作用，许多芽孢杆菌产生挥发性或非挥发性的抗菌素类物质，这些抗生物质的化学性质各不相同，包括了枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质等几大类。
[0006]1985年，北京农业大学陈延熙等研制的以枯草芽孢杆菌为主要成分的“增产菌”已在全国50多种农作物上推广施用，主要用于防治小麦纹枯病、水稻稻瘟病和油菜菌核病等，作物增产率达10%-50%。1992年，王雅平等利用枯草芽孢杆菌A014菌株对小麦赤霉病进行了防效研究，试验表明该菌株对小麦赤霉病防效达50.6%。1993年，王雅平等从丝瓜根际土壤中分离到枯草芽孢杆菌TG26菌株田间试验表明该菌株对西瓜枯萎病和小麦赤霉病防效分别为79.6%和73.1%，并具有显著的增产效果。1994年，张学君等用分离到的枯草芽孢杆菌B3菌株对小麦纹枯病进行防治试验，田间防效达50%-80%。1997年，陈志谊等用枯草芽孢杆菌B-916防治水稻纹枯病，防效达50%-81%。2002年，顾真荣等用枯草芽孢杆菌G3防治菜豆和茄子苗期的菌核病和炭疽病，防效分别为64.1%和35.4%，对番茄叶霉病防效为78.8%。
[0007]可湿性粉剂是农药中技术比较成熟的剂型，是农药的四大剂型之一，广泛应用于农药病害防治。可湿性粉剂一直处于稳步发展的状态，目前已形成了较大的生产能力。近年来不断有新的助剂、新的载体应用到可湿性粉剂的创制上，质量不断得到提高，在农业生产中发挥了重要作用。可湿性粉剂由原药、填料、表面活性剂、辅助剂等混合后粉碎到一定的细度而制成的制剂。表面活性剂包括分散剂、润湿剂等，辅助剂包括热稳定剂、光稳定剂、警戒剂等。可湿性粉剂使用时加水稀释，能够形成稳定的悬浮液，喷雾施用，与水具有高度亲和性，故称为“可湿性”，也有称为水和性，称为“水和剂”或“可分散性粉剂”。
【发明内容】
[0008]本发明的主要目的在于提供一株具有抗茶叶致病真菌致病性的深海沉积物来源枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B5。其由中国典型培养物保藏中心保藏(编号:CCTCCM2012384，保藏日期2012年9月27日，地点:中国武汉，武汉大学)。
[0009]本发明的菌株为深海来源，生长快速，芽孢率高，对茶叶生长中常见的致病真菌具有较强的抑制作用，能对茶园病害防治产生积极预防效果。
[0010]本发明的另一目的在于提供所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) B5的用途，其应用于抑制茶叶致病真菌。尤其是轮斑病源菌和炭疽病源菌。
[0011]本发明的再一目的在于提供一种枯草芽孢杆菌B5的应用方法,其利用所述的枯草芽孢杆菌B5菌体和芽孢体，加入助剂配制成可湿性粉剂。
[0012]本发明的再一目的在于提供一种抑制茶叶致病真菌的可湿性粉剂，其包括前述的枯草芽孢杆菌B5。
[0013]在本发明的推荐实施例中，前述的可湿性粉剂，按重量比包括:
[0014]枯草芽抱杆菌B580~90%
[0015]硅藻土10-15% 以及
[0016]助剂5-10%
[0017]在本发明中所采用的助剂包括本领域配制粉剂时常用的润湿剂、分散剂、稳定剂以及紫外保护剂等。
[0018]本发明 申请人:从西南太平洋深海沉积物中分离得到一株细菌。使用16S 1、16S II引物扩增得到16S序列，经BLAST鉴定该株菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，经抑菌活性筛选发现其活菌对常见茶叶病源真菌具有良好生长抑制作用。经过碳氮源和无机盐的单因子筛选以及四因素三水平的正交试验确定了枯草芽孢杆菌B5的最佳发酵培养基配方。通过对其活菌进一步研究，利用发酵获得的活菌按照一定比例加入特定助剂配制了对常见茶叶致病真菌具有生防效果的可湿性粉剂。
【专利附图】
【附图说明】[0019]图1是枯草芽孢杆菌B5在LB平板上的菌落形态；
[0020]图2是枯草芽孢杆菌B5在显微镜下形态；
[0021]图3为枯草芽孢杆菌B5的16S电泳图；
[0022]图4是枯草芽孢杆菌B5对茶叶致病真菌的抑制效果，其中
[0023]A为轮斑病源菌抑制效果，中间:茶叶致病真菌；两边B5 ；
[0024]B为炭疽病源菌抑制效果，中间:茶叶致病真菌；两边B5。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
[0026]A本发明所涉及菌株的分离鉴定
[0027]本发明 申请人:从西南太平洋盆地1584m深海沉积物中板分离了 32株细菌，以分离自茶叶病斑的茶叶致病真菌，茎点霉属LH2(Phoma sp.),茶轮斑病源菌LH13 (Pestalotiopsis theae),茶炭疽病源菌 LH30 (Colletotrichum gloeosporioides),葡座球腔菌 LH107 (Neofusicoccum sp.),链格孢属 LH129 (Alternaria sp.),拟盘多毛属LH162 (Pestalotiopsis sp.)为指示菌，采用平板对峙法检测了这32株深海来源细菌的抑制茶叶致病真菌活性，其中I株枯草芽孢杆菌B5表现出较好的抑制效果，其对LH13、L30的抑制距离分别达到15. 45mm、14.62mm。
[0028]该菌株B5经分类学研究和分子生物学研究鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，并由中国典型培养物保藏中心保藏(编号:CCTCC M 2012384，保藏日期2012年9月27日，地点:中国武汉，武汉大学)。
[0029]该菌的微生物学特征为:在LB平板上37°C培养48h后，菌落呈现淡黄色，淡营养条件下为污白色，菌落边缘不整齐稍显粗糙不透明，随着生长时间增长菌落呈褶皱状，褶皱中间向空中凸起(图1)。细菌单个或链状排列，单细胞0.6-0.8X2.2-3.5微米，着色均匀。无荚膜，革兰氏阳性菌，芽孢0.6-0.9X1.8-2.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌，发酵过程大量耗氧。采用孔雀绿番红复合染色后可以看到红色的杆状枯草芽孢杆菌B5的菌体和绿色的芽孢体(图 2)。
[0030]该芽孢杆菌对环境适应能力很强，4°C _42°C均能生长，在pH3这种强酸的条件下也能够生长，直到PH9都能较好的生长，在pH6-8之间能很好的生长，其发酵液含菌量达到顶峰，pHIO时细菌生长急剧恶化，维持在低生物量水平。
[0031]发酵该菌时采用本发明中的发酵培养基，按1%的接种量，在37°C，200r/min的条件下发酵48h能达到最佳的发酵结果。
[0032]B枯草芽孢杆菌B5的基因组DNA提取
[0033]SDS法提取枯草芽孢杆菌B5的基因组DNA:
[0034]I)菌株在37°C摇床(200r/min)培养过夜；
[0035]2)取ImL菌液,8000r/min离心5min,弃上清；加入500 μ LSTE重悬；
[0036]3) 8000r/min离心5min,弃上清；加入600 μ L TE用枪头反复吹打重悬；
[0037]4)加入质量分数 20% 的 SDS 25 μ L，20mgl/mL 蛋白酶K，I μ L RNase, 100 μ L IOmg/mL的溶菌酶，混匀，37°C恒温水育120min ；[0038]5)加入等体积的V(酚):V(氯仿):V (异戊醇)=25: 24: I混合液混匀，放置20_30s, 12000r/min离心IOmin,将上清再移至新管中；
[0039]6)加入0.7倍体积的异丙醇轻轻混合，4°C静置120min ；
[0040]7)12000r/min离心20min，弃上清，加入体积分数70%的乙醇洗涤，12000r/min离心2min，弃上清液，重复洗涤后取100 y L的ddH20重悬DNA，一 20°C保存备用。
[0041]C菌株鉴定
[0042]通过引物16S 15’ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’ 和 16S II 5’ GGT TAC CTTGTTACGACT T-3’对枯草芽孢杆菌B5基因组DNA进行扩增，PCR为94°C预变性5min 94°C变性90s，55°C复性90s，72°C延伸90s ;32个循环，72°C延伸10min，4°C保温。将扩增片段用T载克隆转化到DH5ci。跑胶验证得到阳性克隆(见图3)。
[0043]对阳性克隆进行测序，获得枯草芽孢杆菌B5的16S序列如下
【权利要求】
1.一株深海沉积物来源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B5，保藏号为:CCTCCM2012384。
2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B5的用途，其特征在于，应用于抑制茶叶致病真菌。
3.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌B5的用途，其特征在于，所述的茶叶致病真菌为轮斑病源菌或炭疽病源菌。
4.一种枯草芽孢杆菌B5的应用方法，其特征在于:利用所述的枯草芽孢杆菌B5的菌体和芽孢体，加入助剂配制成可湿性粉剂。
5.一种抑制茶叶致病真菌的可湿性粉剂，其包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌B5。
6.如权利要求5所述的一种抑制茶叶致病真菌的可湿性粉剂，按重量比包括: 枯草芽孢杆菌B5 80-90% 硅藻土10-15%以及 助剂5-10%。`
【文档编号】A01P3/00GK103789220SQ201210432271
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年10月31日 优先权日:2012年10月31日
【发明者】汤熙翔, 邓钦文, 易志伟 申请人:国家海洋局第三海洋研究所