一株具有抗茶叶致病真菌活性的深海沉积物来源淡紫拟青霉a65的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种具有抗茶叶致病真菌活性的深海沉积物来源淡紫拟青霉A65。该菌为淡紫拟青霉菌，保藏号为：CCTCC?M?2012385，其本身对茶叶致病真菌具有较强的抑制作用，包括抑制致病菌孢子的萌发及菌体的生长。本发明提供的菌株可配制成可湿性粉剂，用于防治茶叶常见致病真菌发病。
【专利说明】一株具有抗茶叶致病真菌活性的深海沉积物来源淡紫拟青 霉A65【技术领域】
[0001]本发明涉及一株具有抗茶叶致病真菌致病性的深海沉积物来源淡紫拟青霉A65。【背景技术】
[0002]中国是茶叶的故乡，福建是主要茶区，茶树病虫种类繁多、发生危害重，茶树害虫达390多种、茶树病害100余种。病虫为害不仅造成茶叶减产、品质下降，如茶园不合理用药，农药残留超标突出，会污染环境，影响消费者健康，也严重阻碍茶叶出口，实施病虫综合治理是发展无公害茶叶生产，确保茶叶优质、高产和可持续发展的重要环节。目前，中国茶叶在世界上是产茶大国，但还不是产茶强国，有很大一部分原因就是因为化学农药残留问题影响了茶叶的出口。为避免茶农盲目用药，生产中应采取预防为主、综合防治的策略，在了解病虫害规律的基础上，采取多种措施进行防治，从而达到经济、无公害的防治效果。微生物农药具有高效率、低残留对人畜无害等特点，是一种非常合适的选择。
[0003]淡紫拟青霉在已有的研究报道中多见用于防治各种根结线虫，自Jatata等(1979)最早报道了淡紫拟青霉(Paecilomyces Iilacinus)可作为根结线虫卵和胞囊线虫卵的有效寄生菌，在实验室测试中5天可破坏南方根结线虫卵的胚胎。以后许多国家相继对淡紫拟青霉的防治效果进行试验但都仅验证了淡紫拟青霉对线虫有防治作用，没有进一步的应用发展。淡紫拟青霉还能产生丰富的衍生物，其一是类似吲哚乙酸产物，它最显著的生理功效是低浓度时促进植物根系与植株的生长，因此如果对植物施药不仅能明显抑制线虫侵染，而且能促进植株营养器官的生长，同时对种子的萌发与生长也有促进作用。
[0004]海洋真菌是海洋微生物的重要组成，真菌通过吸附于有机物质上进行渗透营养生长的异养真核生物，与细菌相比，真菌相对高等，代谢能力更强，生命活动更复杂，并又与海洋中动植物有着非常复杂的生态关系，其具有很多陆生真菌没有的特性，是近年来微生物制剂研究开发的热点来源。
【发明内容】
[0005]本发明的主要目的在于提供一株具有抗茶叶致病真菌致病性的深海沉积物来源淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus) A65。其由中国典型培养物保藏中心保藏(编号:CCTCCM 2012385，保藏日期2012年9月27日，地点:中国武汉，武汉大学)
[0006]本发明的菌株为深海来源的淡紫拟青霉，生长快速，产孢量大，对茶叶生长中常见的致病真菌具有较强的抑制作用，能对茶园病害防治产生积极预防效果。
[0007]本发明的另一目的在于提供所述的淡紫拟青霉A65的用途，其应用于抑制茶叶致病真菌。尤其是轮斑病源菌和炭疽病源菌。
[0008]本发明的再一目的在于提供一种淡紫拟青霉A65的应用方法，其利用所述的淡紫拟青霉A65的分生孢子，加入助剂配制成可湿性粉剂。
[0009]本发明的再一目的在于提供一种抑制茶叶致病真菌的可湿性粉剂，其组分中包括前述的淡紫拟青霉A65的分生孢子。
[0010]在本发明的推荐实施例中，所述的可湿性粉剂，按重量比包括:
[0011 ] 淡紫拟青霉A65分生孢子 10%
[0012]硅藻土70-80% 以及
[0013]助剂10-20%。
[0014]在本发明中所采用的助剂包括本领域配制粉剂时常用的润湿剂、分散剂、稳定剂以及紫外保护剂等。
[0015]本发明 申请人:从西南太平洋深海沉积物中分离得到一株真菌。使用ITS4、ITS5引物扩增得到其ITS序列，经BLAST鉴定该株菌为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。培养过程中发现其能大量产生分生孢子，经活性筛选发现其活菌能较好的抑制常见茶叶致病真菌的生长及致病真菌孢子的萌发。利用A65发酵获得的高孢粉加入特定助剂可以得到对常见茶叶致病真菌具有生防效果的可湿性粉剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1是淡紫拟青霉A65在PDA平板上的菌落形态；
[0017]图2是淡紫拟青霉A65在显微镜下形态；
[0018]图3为淡紫拟青霉A65的ITS电泳图；
[0019]图4是淡紫拟青霉A65对茶叶致病真菌的抑制效果，其中
`[0020]A为轮斑病源菌抑制效果，中间:茶叶致病真菌；两边:A65 ；
[0021]B为炭疽病源菌抑制效果，中间:茶叶致病真菌；两边:A65。
【具体实施方式】
[0022]实施例1
[0023]A本发明所涉及菌株的分离鉴定
[0024]利用PDA+氯霉素+链霉素平板从20份太平洋海底深海沉积物中分离了 28株真菌，以分离自茶叶病斑的茶叶致病真菌，茎点霉属LH2(Phoma sp.),茶轮斑病源菌LH13 (Pestalotiopsis theae),茶炭疽病源菌 LH30 (Colletotrichum gloeosporioides),葡座球腔菌 LH107 (Neofusicoccum sp.),链格孢属 LH129 (Alternaria sp.),拟盘多毛属LH162 (Pestalotiopsis sp.)为指示菌,采用平板对峙法检测了这28株深海来源真菌的抑制茶叶致病真菌活性，其中I株丝状真菌A65表现出较好的抑制效果，其对LH13的抑制距离达到15.08mm。
[0025]该菌株A65经分类学研究和分子生物学研究鉴定为淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)，并由中国典型培养物保藏中心保藏(编号:CCTCC M 2012385，保藏日期2012年9月27日，地点:中国武汉，武汉大学)。
[0026]采用常规方法，研究了该菌的主要培养特性。该菌有轮状分枝的分生孢子梗。分生孢子多数稍呈椭圆形，少数近梭形或圆形，单细胞，无色。生长和产孢的最适温度范围为25-300C ;适宜的培养基pH为4-8。马铃薯、蛋白陈、蔗糖、硝酸钙、磷酸氢二钠组成的培养基是该菌生长和发酵产孢最佳而比较廉价的培养基。
[0027]该菌的微生物学特征为:A65真菌在PDA平板培养生长速度较快，平均每天能达到8.36mm.。养3天，菌落颜色呈浅紫红色，突起，表面粉质，轮纹明显。菌丝无色，有隔膜。分生孢子梗轮状分枝，2-3轮层，一层具2-5个分生孢子小梗，小梗瓶状或基部稍膨大，顶端稍细长。分生孢子链状着生，远方的孢子先成熟，大小为2.75-3.0O X 1.6 μ m，单孢、无色、多数稍呈梭形，少数椭圆形，表面光滑，见图1和图2。
[0028]在PDA液体培养中，按每200ml接种I块6mm菌块的比例接种发酵培养基，28 V、180rpm摇培3天可见白色菌丝球出现,第4天开始大量产孢,到第7天产孢达到一个小高潮，随后在第9天产孢达到最大。随着培养时间的延长，菌丝球从白色最终变成浅紫色，液体培养基颜色也相应地变紫灰色。
[0029]B淡紫拟青霉A65的基因组DNA提取
[0030](I)将保种或已纯化的真菌接种到PDA平板上，28°C生长5_7天后，用无菌的牙签挑取少量菌丝体至EP管，放入液氮中冻30-60min ；
[0031](2)取出冷冻的菌体，每管加入400 μ I 65°C预热的CTAB buffer抽提液，65°C振荡水浴摇床中保温45-60min ；
[0032](3)加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，充分混匀，13000r/min离心20-30min，将上层水相移入新管；
[0033](4)重复第(3)步；
[0034](5)上清加入0.7v异丙醇,于4°C中静置30min或者过夜；
[0035](6) 13000r/min离心15min,除去上清,沉淀用70%乙醇洗漆2次,吹干；
[0036](9)以 2Oul DDW 溶解沉淀，_20°C保存。
[0037]取5 μ L DNA与I μ L溴酚蓝；在0.8%的琼脂糖凝胶检测其纯度和浓度。
[0038]C菌株鉴定
[0039]通过引物ITS45，-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3，和 ITS55，-GGA AGT AAAAGTCGT AAC AAG G-3’对 Α65 基因组 DNA 进行扩增，PCR 为 94°C预变性 3min 94°C变性 lmin，53°C复性45s，72°C延伸45s:32个循环，72°C延伸10min，4°C保温。将扩增片段用T载克隆转化到DH5 α。跑胶验证得到阳性克隆(见图3)。
[0040]阳性克隆进行测序，获得淡紫拟青霉Α65的ITS序列如下
[0041]TCCTCCGCTT ATTGATATGC TTAAGTTCAG CGGGTATTCC TACCTGATCC GAGGTCAACT 60
[0042]CTAAGAMGT TGGGCGTTTT ACGGCGTGAC CGCCTCCGCG CTCCGGTGCG AGGTGTGTGC 120
[0043]TACTACGCAG GGGAGGCTGC GGCGGGGTCG CCACTGCATT TCGGGGGCGG CTGGTGTGCC 180
[0044]GTCCCCCAAC ACCGAGGCCC CGGGGGGGGC TCGAGGGTTG AAATGACGCT CGAACAGGCA 240
[0045]TGCCCGCCAG MTGCTGGCG GGCGCMTGT GCGTTCAAAG ATTCGATGAT TCACTGAATT 300
[0046]CTGCAATTCA CATTACTTAT CGCATTTCGC TGCGTTCTTC ATCGATGCCA GAACCAAGAG 360
[0047]ATCCGTTGTT GAAAGTTTTG ATTCATTTGT TTTTGCTTGT GCAACTCAGA GAAGAAATTC 420
[0048]CGCCCGCTGG GCGTAATGCA AGAGAGTTTG GGGTCCCTGC GGCGGGCGCC TGGGTCCGGC 480
[0049]GCCGGCGCGG GGGCAGGCGG CCGGGGCGTT CCCGCCGAGG CAACTGAGGT AAGGTTCACA 540
[0050]GTGGGTTTGG GAGTTGTATA ACTCGGTAAT GATCCCTCCG CTGGTTCACC AACGGAGACC 600
[0051]TTGTTACGAC TTTTACTTCC620
[0052]对淡紫拟青霉Α65的ITS序列进行BLAST分析，结果显示该序列和Paecilomyceslilacinus strain B59ACGENE Bank ID:ΗΜ242263.I)相似度最高，达到99%。故可鉴定该株菌属于淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。
[0053]实施例2淡紫拟青霉A65对茶叶致病真菌致病性的抑制作用
[0054]真菌淡紫拟青霉A65接种到PDA培养基28°C培养7天后，用加有0.1%吐温-10的灭菌水在平板内把分生孢子冲洗下来，装入EP管中，血细胞计数器计数，逐级稀释孢子浓度到1 X 1O6个/ml制备成A65孢子悬浮液。采用平板对峙法测定A65对茶叶致病真菌的抑制作用。
[0055]平板对峙法:在平板底部划垂直交叉十字，在PDA平板距离中心等距离处放置滤纸块，纸块上接种20 μl的孢子悬液；在平板中央接种直径6mm的指示病原菌菌饼，28°C下培养5-7d，至拮抗菌与各指示菌菌落间产生明显抑菌带时测量拮抗带宽度。以不接种拮抗菌，只接指示菌做对照(图4)。
[0056]实施例3淡紫拟青霉A65可湿性粉剂的配制
[0057]单因素测定法:利用单一变量法从待选的各种载体、助剂中逐一筛选出合适的剂型载体为硅藻土，其他助剂若干。
[0058]正交实验法:用正交表安排多因素试验的方法，称为正交试验设计法。其特点为:①完成试验要求所需的实验次数少数据点的分布很均匀；③可用相应的极差分析方法、方差分析方法、回归分析方法等对试验结果进行分析，引出有价值的结论。
[0059]正交试验设计方法是用正交表来安排试验的。
[0060]经实验，最后得出本发明的最佳配方为可湿性粉剂配方是10%淡紫拟青霉A65分生孢子，70%-80%硅藻土，其他助剂10%-20%。
【权利要求】
1.一种深海沉积物来源淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)A65,保藏号为:CCTCCM2012385。
2.如权利要求1所述的淡紫拟青霉A65的用途，其特征在于，应用于抑制茶叶致病真菌。
3.如权利要求2所述的淡紫拟青霉A65的用途，其特征在于，所述的茶叶致病真菌为轮斑病源菌或炭疽病源菌。
4.一种淡紫拟青霉A65的应用方法，其特征在于:利用权利要求1所述的淡紫拟青霉A65的分生孢子，加入助剂配制成可湿性粉剂。
5.一种抑制茶叶致病真菌的可湿性粉剂，其包括权利要求1所述的淡紫拟青霉A65的分生孢子。
6.如权利要求5所述的一种抑制茶叶致病真菌的可湿性粉剂，按重量比包括: 淡紫拟青霉A65分生孢子 10% 硅藻土70-80%以及 助剂10-20%。`
【文档编号】A01N25/14GK103789211SQ201210432272
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年10月31日 优先权日:2012年10月31日
【发明者】汤熙翔, 邓钦文, 易志伟 申请人:国家海洋局第三海洋研究所