一种利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物组织培养及遗传转化，具体设及一种利用农杆菌侵染玉米幼胚的 遗传转化方法。
【背景技术】
[0002] 玉米是世界=大粮食作物之一，也是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要 原料，它的遗传转化研究一直受到各国科学家的重视。现今主要采用的方法是W玉米幼胚 为受体的农杆菌转化法，但是玉米为单子叶植物，不是农杆菌的天然宿主，因此农杆菌介导 玉米转化难度较大。
[0003] 经检索发现，公开号为CN103114106的发明专利申请公开了一种农杆菌侵染玉米 幼胚的方法，在侵染过程中对玉米幼胚先进行热激处理，再进行农杆菌侵染和共培养，该样 可W大大提高农杆菌的侵染效率。
[0004][0005] 但是现有的遗传转化方法不能保证转化效率，且有农杆菌侵染过度导致的染菌问 题。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种转化效率稳定、简单易行的利用农杆菌侵染玉米幼胚的 遗传转化方法。
[0007] 为达到上述目的，具体采用如下的技术方案：
[000引一种利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，具体包括如下步骤：
[0009] (1)制备农杆菌侵染液；取农杆菌菌斑溶于抑值为4. 8~5. 6的侵染液中，室温 (19~25°C)慢摇3~化，调0〇55。为0. 5~0. 55,得农杆菌侵染液；
[0010] (2)侵染与共培养：用所述侵染液对玉米幼胚侵染，侵染液：玉米幼胚=ImL: (100~150)个，侵染结束后去除侵染液，加入所述农杆菌侵染液，避光5~15min，侵染结 束后，将幼胚盾面朝上，放入共培养培养基中，19~23°C暗培养1~4天。
[0011] 在本发明的技术方案中，侵染液的组分如下；N6培养基1. 99~3. 98g/L，2, 4-二 氯苯氧己酸1. 0~1. 5mg/l，脯氨酸0. 5~0. 7g/l，庶糖68. 4~75g/l，葡萄糖36~40g/ L2-吗咐己横酸0. 3~0. 5g/l，己酷了香酬100~150mM/L。
[0012] 优选地，侵染液的组分如下；N6培养基1. 99g/l，2, 4-二氯苯氧己酸1. 5mg/l，脯氨 酸0. 7g/l，庶糖68. 4g/l，葡萄糖36g/l，2-吗咐己横酸0. 5g/l，己酷了香酬lOOmM/L。
[0013] 最优选地，当侵染液的抑值为5. 2时，能够有效促进农杆菌活性，提高侵染效率。
[0014] 更加具体的，侵染液的制备方法为：将N6培养基、2, 4-二氯苯氧己酸、脯氨酸、庶 糖、葡萄糖和2-吗咐己横酸加入蒸馈水中彻底溶解，调节抑值后，冷却至50°C，加入抽滤灭 菌保存的己酷了香酬，之后揽拌均匀，倒入无菌培养皿中，40-50皿/L。本发明提供的侵染 液的制备方法能够最大程度的保持各组分的活性，有利于提高侵染效率。
[0015] 在本发明的步骤（2)中，所述共培养培养基的组分如下N6培养基1. 99~3. 98g/ L，2, 4-二氯苯氧己酸1. 0~1. 5mg/L，脯氨酸0. 5~0. 7g/l，庶糖30~35g/L，2-吗咐己横 酸0. 3~0. 5g/l，植物凝胶3~4g/l，己酷了香酬100~150mM/L，硝酸银5~7mM/L，半脱 氨酸盐酸盐300~400mg/L，抑值为5. 8~6. 0。
[0016] 优选地，所述共培养培养基的组分如下；N6培养基1.99g/l，2,4-二氯苯氧己酸 1. 5mg/l，脯氨酸0. 7g/l，庶糖30g/l，2-吗咐己横酸0. 5g/l，植物凝胶3g/l，己酷了香酬 lOOmM/L，硝酸银5mM/L，半脱氨酸盐酸盐400mg/L，抑值为5. 8。当W此作为共培养培养基 时，可防止在共培养过程中农杆菌过快繁殖，侵染过度，造成幼胚死亡。
[0017] 更加具体的，共培养培养基的制备方法为：将N6培养基、2, 4-二氯苯氧己酸、脯 氨酸、庶糖、2-吗咐己横酸混合，定容至抑5. 8~6. 0后加入植物凝胶，然后高温高压灭菌 (优选为121°C高温高压灭菌30min)，最后冷却至50-45°C加入抽滤灭菌的己酷了香酬、硝 酸银、半脱氨酸盐酸盐，在磁力揽拌器上揽拌均匀，分装到无菌培养皿中即得。本发明提供 的共培养培养基的制备方法保证了培养基各组分的活性不会丧失，浓度精确，无菌安全。 [001引在本发明的技术方案中，当侵染结束后，优选将幼胚盾面朝上，放入共培养培养基 中，19~23°C暗培养1~3天，更加优选在22°C培养3天，此时可W显著提高玉米幼胚的转 化率。
[0019] 在本发明的技术方案中，农杆菌菌斑的制备方法可为现有技术中的任意方法，优 选采用如下的方法；用接种环挑取农杆菌菌株在农杆菌固体培养基画线，25~30°C暗培养 2~3天（优选为28°C暗培养2天），将农杆菌固体培养基保存在-80°C的环境中，每次挑 取一个菌斑涂于农杆菌培养基固体培养基中，20~25°C暗培养2~4天（优选为22°C暗培 养3天）后即可得到农杆菌菌斑。
[0020] 其中，采用的农杆菌菌株为EHA101含质粒PTF102,含bar基因、0-葡萄糖巧酸 酶报告基因，获取自吉林省农业科学院农业生物技术研究所转基因植物环境安全研究课题 组。
[0021] 所述农杆菌固体培养基的组分如下；蛋白腺lOg/L化C1 15g/l，酵母提取物lOg/ L，琼脂15g/L，利福平50mg/l，壮观霉素50mg/l，卡那霉素50mg/L。酵母提取物可选有市售 产品，例如sigma公司的Y1625。
[0022] 更加具体的，农杆菌固体培养基的制备方法为：将蛋白腺、化C1、酵母提取物、琼脂 混合，调节抑值（优选为抑值为7. 0)，12rc高温高压灭菌后冷却至50°CW下加入利福平、 壮观霉素、卡那霉素50mg/L。本发明提供的农杆菌固体培养基的制备方法保证菌体能够正 常生长，抗生素的加入对菌体进行有效的筛选，保证了后续转化试验的效率
[0023] 本发明所述玉米幼胚的剥取方法为；选取自花授粉9~11天的幼穗，灭菌，在幼穗 的窄端将綴子尖端插入幼穗中，使用手术刀片从窄端到宽端削掉幼粒1/3~2/3,用刀背在 幼粒的宽端进刀，向窄端用力挑取幼胚。
[0024] 本发明利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法的最佳实施方式能使玉米幼胚 的转化率达到48. 6%，具体包括如下步骤；
[0025] (1)制备农杆菌侵染液；取农杆菌菌斑溶于侵染液中，室温慢摇3~化，调0〇55。= 0. 5~0. 55,所述侵染液的抑值为5. 2;
[0026] (2)侵染与共培养；用所述侵染液对玉米幼胚进行侵染，侵染液：玉米幼胚=ImL: (100~150)个，侵染结束后去除侵染液，加入所述农杆菌侵染液，避光lOmin侵染，侵染结 束后，将幼胚盾面朝上，放入共培养培养基中，22°C暗培养3天；
[0027] 其中，所述侵染液的组分如下；N6培养基1. 99g/L，2, 4-二氯苯氧己酸1. 5mg/L，脯 氨酸0. 7g/l，庶糖68. 4g/l，葡萄糖36g/l，2-吗咐己横酸0. 5g/l，己酷了香酬lOOmM/1，pH 值为5. 2;
[002引所述共培养培养基的组分如下；N6培养基1. 99g/l，2, 4-二氯苯氧己酸1. 5mg/l， 脯氨酸0. 7g/l，庶糖30g/l，2-吗咐己横酸0. 5g/l，植物凝胶3g/l，己酷了香酬lOOmM/1，硝 酸银5mM/L，半脱氨酸盐酸盐400mg/L，抑值为5. 8。
[0029] 本发明提供的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，明确了侵染液、共培养 培养基的配方及抑值，农杆菌菌液的制备方法及共培养的时间，其培养方法简便、体系成 熟，转化结果准确稳定高效。
【具体实施方式】
[0030]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中采用的原料 均可选用市售的产品。
[0031] 实施例1
[0032] 在本实施例中玉米幼胚取自玉米自交系化II幼穗，化II幼穗由吉林省农业科学 院农业生物技术研究所转基因植物环境安全研究课题组提供，农杆菌菌株EHA101含质粒 PTF102,含bar基因、0-葡萄糖巧酸酶报告基因。
[0033] 其中，玉米幼胚的制备方法为；选取自花授粉9~11天的幼穗，剥取幼穗的巷叶， 将7-8个幼穗放入灭菌的量杯中，加入75% (体积比）酒精，用綴子揽拌，去除附着在幼穗 上的气泡，灭菌10分钟，倒出酒精。用无菌綴子夹幼穗入钢盘中，在幼穗的窄端将綴子尖端 插入幼穗中，使用手术刀片从窄端到宽端削掉幼粒1/3~2/3,用刀背在幼粒的宽端进刀， 向窄端用力挑取幼胚。
[0034] 本实施例利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，包括W下步骤：
[0035] (1)制备农杆菌侵染液；将农杆菌甘油管从-80°C冰箱中取出，接种环调菌在农杆 菌培养基固体培养基画线，28°C，暗培养2天，将培养基存于4°C冰箱，每次挑取一个菌斑涂 于农杆菌培养基固体培养基中，19°C，暗培养3天。刮一个直径3mm的菌斑溶于5mL的侵染 培养基中，室温慢摇3~4小时，调0〇55。= 0. 5