~0. 55,所述侵染液的抑值为5. 2 ;
[0036] 似侵染与共培养；将玉米幼胚放到含有ImL侵染液的1. 5mL离屯、管中，集齐约 100个幼胚，离屯、管上下颠倒10次，放入避光处静止lOmin，去侵染液，加入ImL农杆菌侵染 液，避光lOmin，侵染结束后，将幼胚盾面朝上，放入共培养培养基中，22°C暗培养3天。
[0037] 所述侵染液的组分如下；N6培养基粉末1. 99g/l，2, 4-二氯苯氧己酸1. 5mg/l，脯 氨酸0. 7g/l，庶糖68. 4g/l，葡萄糖36g/l，2-吗咐己横酸0. 5g/l，己酷了香酬lOOmM/1，pH 值为5. 2。
[003引所述农杆菌固体培养基的组分如下；蛋白腺lOg/l，化C1 15g/l，酵母提取物lOg/L，琼脂15g/L，利福平50mg/l，壮观霉素50mg/l，卡那霉素50mg/l，抑值为7. 0。
[0039] 所述共培养培养基的组分如下；N6培养基粉末1.99g/l，2,4-二氯苯氧己酸 1. 5mg/l，脯氨酸0. 7g/l，庶糖30g/l，2-吗咐己横酸0. 5g/l，植物凝胶3g/l，己酷了香酬 lOOmM/1，硝酸银半脱氨酸盐酸盐400mg/L。
[0040] 实施例2
[0041] 本实施例与实施例1的区别仅在于：在本实施例中侵染液的pH值为4. 8。
[0042] 实施例3
[0043] 本实施例与实施例1的区别仅在于：在本实施例中侵染液的抑值为5. 6。
[0044] 实施例4
[0045] 本实施例与实施例1的区别仅在于；在本实施例中其共培养培养基的组分如下：
[0046] N6培养基粉末3. 98g/l，2, 4-二氯苯氧己酸1. 5mg/l，脯氨酸0. 7g/l，庶糖30g/l， 2-吗咐己横酸0. 5g/l，植物凝胶3g/l，己酷了香酬lOOmM/1，硝酸银半脱氨酸盐酸盐 400mg/L〇
[0047] 实施例5
[0048] 本实施例与实施例1的区别仅在于；在本实施例中，步骤（2)暗培养的时间为1 天。
[0049] 实施例6
[0050] 本实施例与实施例1的区别仅在于；在本实施例中，步骤（2)暗培养的时间为2 天。
[0化1] 实施例7
[0052] 本实施例与实施例1的区别仅在于；在本实施例中，步骤（2)暗培养的时间为4 天。
[0化3] 实施例8
[0054] 本实施例与实施例1的区别仅在于：在本实施例中其侵染液的组分如下；N6培养 基3. 98g/l，2, 4-二氯苯氧己酸1. 5mg/l，脯氨酸0.7g/l，庶糖68. 4g/l，葡萄糖36g/l，2-吗 咐己横酸0.5g/l，己酷了香酬lOOmM/L。
[0化5] 对比例1
[0056] 本对比例与实施例1的区别仅在于，在对比例1中，其侵染液的组分与CN103114106A实施例1表1中的侵染培养基的配方相同。
[0057] 实验例；
[0化引利用0 -葡萄糖巧酸酶染色法测实施例1~实施例7的转化率，具体步骤为：将暗 培养结束后的幼胚用綴子取下，无菌双蒸水洗掉培养基，在滤纸上吸干水分；W皿为单位分 别放入2ml离屯、管中，每管加入1. 5ml0 -葡萄糖巧酸酶染色液，37°C暗培养，16小时，如染 色情况不好时，可25°C再培养1-2天，分别用75%，85%，95% (v/v)酒精脱色后，染色细胞 直观可见。
[0059] 所述0 -葡萄糖巧酸酶染色液的组分如下；ImM5-漠-4-氯-3-嘲噪-0 -D-葡 萄糖巧，lOOmM抑值为7. 0磯酸钢缓冲液，lOmM己二胺四己酸二钢，0. 5mM铁氯化钟，0. 5mM 亚铁氯化钟，0.1% (体积比）聚己二醇辛基苯基離。
[0060] 幼胚转化率=染色幼胚数/总幼胚数，测试结果如下：
[0061]
[0062] 阳06引说明，由于共培养时间过长，实施例7中有约40%的幼胚染菌，无法进行0 -葡萄 糖巧酸酶染色。
[0064] 从上表中的数据可W看出，实施例1-8对于农杆菌介导的玉米遗传转化均有作 用，其中实施例1的效果最好。
[00化]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，该对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的该些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 制备农杆菌侵染液：取农杆菌菌斑溶于pH值为4. 8~5. 6的侵染液中，室温慢摇 3~4h，调0055。为0? 5~0? 55,得农杆菌侵染液； (2) 侵染与共培养：用所述侵染液对玉米幼胚进行侵染，侵染液：玉米幼胚=ImL: (100~150)个，侵染结束后去除侵染液，加入所述农杆菌侵染液，避光5~15min侵染，侵 染结束后，将幼胚盾面朝上，放入共培养培养基中，19~23°C暗培养1~4天。2. 根据权利要求1所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，所 述侵染液的组分如下：N6培养基1. 99~3. 98g/L，2, 4-二氯苯氧乙酸I. 0~I. 5mg/L，脯氨 酸0? 5~0? 7g/L，鹿糖68. 4~75g/L，葡萄糖36~40g/L，2-吗啉乙磺酸0? 3~0? 5g/L，乙 酰丁香酮100~150mM/L。3. 根据权利要求2所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，所 述侵染液的组分如下：N6培养基I. 99g/L，2, 4-二氯苯氧乙酸I. 5mg/L，脯氨酸0. 7g/L，鹿 糖68. 4g/L，葡萄糖36g/L，2-吗啉乙磺酸0? 5g/L，乙酰丁香酮100mM/L。4. 根据权利要求2或3所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于， 所述侵染液的pH值为5. 2。5. 根据权利要求1-4任一项所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征 在于，所述共培养培养基的组分如下：N6培养基1. 99~3. 98g/L，2, 4-二氯苯氧乙酸I. 0~ I. 5mg/L，脯氨酸0? 5~0? 7g/L，鹿糖30~35g/L，2-吗啉乙磺酸0? 3~0? 5g/L，植物凝胶 3~4g/L，乙酰丁香酮100~150mM/L，硝酸银5~7mM/L，半胱氨酸盐酸盐300~400mg/L， pH值为5. 8~6. 0。6. 根据权利要求5所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于， 所述共培养培养基的组分如下：N6培养基1.99g/L，2,4-二氯苯氧乙酸1.5mg/L，脯氨酸 〇. 7g/L，蔗糖30g/L，2-吗啉乙磺酸0. 5g/L，植物凝胶3g/L，乙酰丁香酮100mM/L，硝酸银 5mM/L，半胱氨酸盐酸盐400mg/L，pH值为5. 8。7. 根据权利要求1-4任一项所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征 在于，步骤（2)侵染结束后，将幼胚盾面朝上，放入共培养培养基中，22°C暗培养3天。8. 根据权利要求1-4任一项所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征 在于，步骤（1)所述农杆菌菌斑的制备方法为：用接种环挑取农杆菌菌株在农杆菌固体培 养基画线，25~30°C暗培养2~3天，将农杆菌固体培养基保存在-80°C的环境中，每次挑 取一个菌斑涂于农杆菌培养基固体培养基中，20~25 °C暗培养2~4天后即可得到农杆菌 菌斑。9. 根据权利要求8所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，所 述农杆菌固体培养基的组分如下：蛋白胨10g/L，NaCl 15g/L，酵母提取物10g/L，琼脂15g/ L，利福平50mg/L，壮观霉素50mg/L，卡那霉素50mg/L。10. 根据权利要求1所述的利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，其特征在于，所 述玉米幼胚的剥取方法为：选取自花授粉9~11天的幼穗，灭菌，在幼穗的窄端将镊子尖端 插入幼穗中，使用手术刀片从窄端到宽端削掉幼粒1/3~2/3,用刀背在幼粒的宽端进刀， 向窄端用力挑取幼胚。
【专利摘要】本发明涉及植物组织培养及遗传转化，具体涉及一种利用农杆菌侵染玉米幼胚的遗传转化方法，具备包括如下步骤：(1)制备农杆菌侵染液：取农杆菌菌斑溶于pH值为4.8～5.6的侵染液中，室温慢摇3～4h，调OD550为0.5～0.55，得农杆菌侵染液；(2)侵染与共培养：用所述侵染液对玉米幼胚进行侵染，侵染液：玉米幼胚＝1mL：(100～150)个，侵染结束后去除侵染液，加入所述农杆菌侵染液，避光5～15min侵染，侵染结束后，将幼胚盾面朝上，放入共培养培养基中，19～23℃暗培养1～4天。本发明提供的转化方法简便、体系成熟，转化结果准确稳定高效。
【IPC分类】C12N15/84, A01H5/00
【公开号】CN104988178
【申请号】CN201510368037
【发明人】王大铭, 宋新元, 王柏凤, 武奉慈, 尹俊琦
【申请人】吉林省农业科学院
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2015年6月29日