专利名称：转基因表达调控的新系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及控制细胞中核酸表达的新组合物和方法。本发明更具体地适于控制体外及体内神经细胞中的核酸表达。
控制细胞中的核酸表达在生物技术的所有领域中都有巨大的吸引力。这样可以在体外或离体改善重组蛋白的表达条件、对基因功能或调节的研究、病毒颗粒的生产、用于植入体内之细胞的制备等。在体内，这可以改善动物模型的特性、更精确地研究化合物的生物利用度或毒性或基因的功能、或更有效地控制化合物的生产，例如治疗或疫苗目的的化合物。本发明的组合物和方法可用于所有这些生物技术领域。
现有技术中已提出了各种途径试图控制基因表达。这特别涉及利用具有组织特异性的载体或转录启动子。但这些系统不总具有所期望的特异性，特别是在体内，而且它们不能在时间上控制表达。
Gossen等(PNAS 89(1992)5547；Science 268(1995)1766)描述了一种复杂的系统，其一方面利用四环素调控的反式激活蛋白tTA，另一方面利用tTA敏感的启动子。虽然提供了时间上调控表达方面的优点，迄今报道的这种系统总有一些缺陷限制其应用。这些缺陷特别是细胞毒性、所观察到的表达渗漏、需要使用两种载体等。
本发明现提供一种与现有技术系统相比稳定性、特异性和易操纵性改善的受控新表达系统。
因此，本发明的第一方面涉及含有如下元件的基因构建体，所述元件的性质和特定布置能保证基因表达的严格控制。
本发明的另一方面涉及含有这些遗传构建体的载体，特别是病毒载体。
本发明的另一方面涉及用本发明遗传构建体或载体遗传修饰的细胞、含有这些细胞的组合物、以及它们用于体外、离体或体内生产目的产物的应用。
本发明的另一方面涉及在体外、离体或体内细胞中受控表达核酸的方法和组合物，特别是在神经细胞中。本发明的另一方面还涉及在体内受控转移和表达核酸的方法，包括体内植入(或移植)用本发明构建体或载体遗传修饰的细胞(特别是神经祖细胞)。
本发明更具体地描述一种基于使用tTA并具有改善特性的新的受控表达系统。该系统在腺病毒的情形下特别有效，能在体外及体内有效和受调节地表达，特别是在神经系统中。
本发明的另一个目的更具体地涉及一种核酸，其特征在于它包含a)含中等启动子控制下之四环素调控系统反式激活蛋白tTA编码核酸的第一区，和b)含tTA敏感性启动子控制下之目的核酸的第二区，其中a)和b)两个区以相同的转录方向放置。
更优选，本发明的核酸另外包含置于a)和b)两个区之间的第三个区c)，其限制a)和b)区间的转录干扰。
本发明实际上基于，证明了这种构建体特别在控制体内基因表达、特别是控制神经细胞中表达的有利特性。本发明还表明这些构建体的有利特性部分来自各种遗传元件的选择和其间的布置。
因此，在本发明核酸的a)区中，用于控制反式激活蛋白tTA基因表达的启动子是一种中等启动子。“中等启动子”在本发明中指本领域技术人员认为其活性水平中等的启动子，即活性低于强启动子。更具体地讲，本发明中的中等启动子是能使得以生理水平表达的非病毒启动子。
因此，与现有技术(Gossen等，PNAS 89(1992)5547)中描述的系统不同(其中所用启动子是强病毒启动子(特别是hCMV))，本发明的构建体使得以对哺乳动物非毒性的水平组成性合成反式激活蛋白tTA。申请人现证明在细胞中保持中等水平的tTA可以获得对基因表达的精细得多的调节，特别是在神经细胞中。
更优选地，所用启动子是一种细胞启动子，即来自在细胞中表达之基因的启动子。有利地，该启动子的来源(衍生)细胞与待引入该遗传构建体的细胞来自相同的物种。因此，当本发明的构建体用于在动物中引入核酸时，所用的中等细胞启动子优选衍生自该相同动物种的细胞，或衍生自相关或相近物种的细胞。当然，可能利用衍生自不同生物的启动子，例如一种鼠启动子用于人体中的表达，只要所用的启动子是功能性的。
更优选，所用的启动子是一种组成型中等细胞启动子。本申请实际上表明，当所用启动子是组成型时获得本发明系统的最佳特性，组成型即保证细胞中存在并维持稳定的tTA水平。
适于本发明的组成型中等细胞启动子的具体实例特别为遍在型启动子如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、二氢叶酸还原酶(DHFR)或延伸因子1α(EF1α)的内务(“管家”)基因的启动子。其他可用于本发明的中等细胞启动子是组织特异性启动子，如对神经胶质特异的GFAP(“神经胶质特异性原纤维酸性蛋白”)基因的启动子，对神经元特异的NSE(“神经元特异性烯醇化酶”)基因启动子，对心肌特异的β-肌动蛋白、β-珠蛋白、MHCα(“瞳孔缩小重链α”)基因的启动子，或复合启动子如NRSE-PGK型。
因此，本发明的中等启动子有利地为这样的细胞启动子，其保证组成性、遍在性或局限于某些组织或细胞类型的表达，优选能获得生理水平的表达。PGK启动子(或其变体)的应用代表本发明的一个优选实施方案。下文给出的实施例表明，该启动子的应用可以保持目的核酸在引入构建体后体内表达至少一个月。在此期间没有观察到表达目的核酸之细胞数目的任何减少。这种表达稳定性代表了本发明与现有技术系统相比重要的优势。而在植入用强启动子(RSV病毒的LTR启动子)控制下编码β-半乳糖苷酶的腺病毒感染的神经祖细胞时，植入后至少一个月内观察到表达水平的明显下降。这表明在稳定性方面本发明的有利特性，这出人意料地与使用中等启动子指导tTA基因表达有关。
本发明构建体的另一重要特征在于a)和b)两区的布置。例如，这两个区域最好(i)以相同的转录方向放置，(ii)被限制其转录干扰的c)区分隔开。
本申请首次表明，为了获得本发明系统的更好的效力(即更好地控制表达)，将a)和b)两个盒子以相同的转录方向放置特别有利。这些结果是相当出人意料的，因为经常发现当两个盒子以相反方向放置时能更好地控制表达。而在本发明中，当两盒子方向相同时似乎没有发生任何表达渗漏，甚至在腺病毒的情形中亦如此，而已报道反平行方向构建体的这种表渗漏(Kojima等，Biochem.Biophys.Res.Commun 238(1997)569)。
另外，为了进一步改善本发明构建体的特性，在上述a)和b)两个区之间引入一个限制a)和b)之间转录干扰的第三个区c)特别有利。“转录干扰”指a)区的启动子对b)核酸转录的任何影响及反过来b)对a)的影响。更具体地讲，“转录干扰”指b)区分离时和与a)区功能性连接时可能存在的表达差异。一种这样的c)区优选含有转录终止子，优选UMS序列。UMS序列(上游小鼠序列)是一种基因组序列，发现于鼠c-mos基因的上游(McGeady等，Dna 5(1986)289)。该序列可作为转录终止子。本发明现证明这些序列可以有利地用于控制体内基因表达的效率，特别是在神经系统中，更具体在腺病毒的情形中。
本发明的系统因此依赖于同一核酸中两个盒子(区域)的存在，一个在可调节的条件下表达能激活表达的转录因子，在第二个盒子中为目的核酸。因此在第二个盒子中(b)区)，选择与本发明基因构建体适配的转录启动子很重要。在b)区中所用的启动子是对反式激活蛋白tTA敏感的启动子，即在所述反式激活蛋白存在时活性提高的启动子。从结构角度看，这样的启动子在其序列中或距其序列的一个功能性距离处至少含有一个tTA因子结合位点(Gossen等，1992)。该结合位点或操纵区(Op或tetOp)例如可以具有图6中所示序列或其功能性变体。变体例如可以是通过突变、缺失或加入一个或多个碱基对被遗传修饰但保留反式激活蛋白tTA结合能力的序列。优选地，这些修饰至少含有图6中所示序列的10％。另外，Op序列可以以一个或多个拷贝存在于b)区中，例如1-10个、优选3-10个、更优选3-8个拷贝。在一个特别优选的实施方案中，b)中所用启动子包含7个操纵序列。为了很好地控制目的核酸的表达，更优选(极力推荐)b)中所用启动子具有很弱的基础活性，甚至没有。这样，该启动子的活性只有在tTA存在时才能观察到，因此调控很严格。最好b)中所用的启动子是对反式激活蛋白tTA敏感的最小启动子。“最小”的特征指启动子的基础活性很弱，甚至没有。这样的启动子通常包含对转录启动子功能必不可少的最少元件(例如TATA盒)，而没有天然与例如其启动子强度或其调节相关的其它区域。这种启动子可以通过缺失和/或添加元件(“沉默子”)从不同类型的启动子制得。b)中优选的启动子是在无tTA时基本无活性、在有反式激活蛋白tTA时被激活、并在哺乳动物细胞中有功能的启动子。“基本无活性”指没有按常规技术可检测到的产物表达(多肽)，常规技术特别指酶测定、免疫组织化学技术、微透析或HPLC。该术语不排除通过PCR或其他很敏感的检测技术可检测到的mRNA的存在，但其浓度水平实际停留在非显著水平。
b)中所用启动子可以是天然来源的，可以有不同的特性。所用启动子的选择实际上取决于所追求的应用和目的基因。因此，该启动子例如可以来自强的或弱的、遍在性的或组织/细胞特异的、或生理状态或病生状态特异的(活性取决于细胞分化状态或细胞周期的某些阶段)的启动子。所述启动子可以源自真核细胞、原核细胞、病毒、动物、植物、人工合成或源自人等。启动子的具体实例是CMV立即早期基因启动子、TK、GH、EF1-α、APO等启动子或人工启动子。为了用于本发明，这些启动子被改造成“最小”，即依赖于tTA的存在。为此，可以用酶消化来源启动子并测定其活性，优选在与一个或多个Op序列功能性连接后测定其活性。tetOp序列的数目以及其相对于所选择启动子的距离可以由本领域技术人员调装，以便所述启动子的表达是严格tTA依赖性的。优选，b)中所用启动子是巨细胞病毒(CMV)(优选人CMV，hCMV)立即早期基因的最小启动子，如Corti等(Neuroreport 7(1996)1655)中所述，后者作为参考文献引入本文。
本发明可根据所希望的应用用于不同目的核酸的表达。因此，在b)区中，目的核酸最好是编码目的蛋白或多肽的核酸。在本发明的目的产物中，更具体地可以举出酶，血液衍生物，激素如生长激素，细胞因子，淋巴因子白介素、干扰素、TNF等(法国专利9203120号)，生长因子如血管生成因子、例如VEGF或FGF，神经递质或其前体或合成酶(酪氨酸羟化酶TH)，营养因子，特别是用于治疗神经变性疾病、有神经系统损伤之创伤、或视网膜变性的神经营养因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、αFGF、NT3、NT5、HARP/多能营养蛋白，或骨生长因子，造血因子等，肌营养不良蛋白或小肌营养不良蛋白(法国专利9111947号)，编码凝血因子的基因第VII、VIII、IX因子，自杀基因(胸苷激酶，胞嘧啶脱胺酶)，参与细胞周期的蛋白如p21、或其他依赖性激酶的抑制性蛋白、Rb、Gas-1、Gas-6、Gas-3、Gad45、Gad153、细胞周期蛋白A、B、D，或限制平滑肌中细胞增殖的GAX蛋白(治疗再狭窄)，诱导细胞凋亡的蛋白或其他肿瘤抑制蛋白如p53、Bax、BclX-s、Bad或Bc12和Bc1X-1的任何其他拮抗剂，血球蛋白或其他蛋白转运蛋白的基因，参与脂代谢之蛋白的基因，选自A-I、A-II、A-IV、B、C-I、C-II、C-III、D、E、F、G、H、J和apo(a)的载脂蛋白，代谢酶如脂蛋白脂酶、肝脂酶、卵磷脂胆固醇酰基转移酶、7α胆固醇羟化酶、磷脂酰酸性磷酸酶，或脂肪转移蛋白如胆固醇酯的转移蛋白和磷脂的转移蛋白，HDL结合蛋白，或选自LDL受体、残余乳糜微粒受体和清除剂受体的受体等。
在目的产物中，强调抗体、单链抗体的可变片段(ScFv)或具有识别能力的任何其他抗体片段的免疫治疗应用是重要的，例如用于治疗感染性疾病、肿瘤(抗RAS、抗-p53或抗GAP抗体)、自身免疫疾病如斑形硬化(抗独特型抗体)。
其他目的蛋白(非限制性地)为可溶性受体，如用于抗HIV治疗的可溶性CD4受体或TNF的可溶性受体，用于治疗肌无力的乙酰胆碱的可溶性受体；底物肽或酶抑制剂，或受体或粘附蛋白的拮抗或激动剂肽如用于治疗哮喘、血栓形成和再狭窄人工的、化学的或截短的蛋白。在重要的目的激素中，可以举出用于糖尿病的胰岛素、生长激素和降钙素。
所述核酸还可以是反义基因或序列，其在靶细胞中的表达可以控制细胞基因的表达或mRNA的转录。这种序列例如可以在靶细胞中转录成细胞mRNA的互补RNA，并阻止其翻译成蛋白质，见欧洲专利140308号中描述的技术。治疗基因还可以含有编码核酶的序列，后者可选择性破坏靶RNA(欧洲专利321201号)。
所述核酸还可以含有编码抗原性、能在人或动物中造成免疫应答的肽的一个或多个基因。在该具体实施方案中，本发明可以制备疫苗，或进行用于人或动物的免疫治疗，特别是抗微生物、病毒或癌的治疗。这特别关系到E-B病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(欧洲专利185573号)、伪狂犬病病毒、“合胞体形成病毒”、及其它病毒的特异性抗原肽，或肿瘤的特异性抗原如MAGE蛋白(欧洲专利259212号)。
所述核酸还可以编码细胞毒性产物，特别是条件性细胞毒性(如胸苷肌酶，胞嘧啶脱胺酶等)。
其他有意义的基因特别报道于Mc Kusick，V.A.Mendelian(Inheritance in man，catalogs of autosomaldominant，autosomal recessive，and X-linked phenotypes，第8版，John Hopkins University Press(1988))和Standbury，J.B.等(The metabolic basis of inherited disease，第5版，McGraw-Hill(1983))。这些有意义的基因包括参与氨基酸、脂类和其他细胞成分代谢的蛋白质。
另外，b)区还可以在目的核酸的3′含有一个转录终止子。最后，所述核酸可以包含多个编码区，任选地由IRES分隔开，从而产生多个目的产物。
由于本发明构建体特别适于调节神经系统中的表达，目的核酸更优选编码神经递质或其前体或合成酶(酪氨酸羟化酶TH)，营养因子，特别是用于治疗神经变性疾病、有神经系统损伤的创伤、或视网膜变性的神经营养因子。
在一个具体实施方案中，本发明涉及一种核酸，其特征在于它含有a)在PGK基因启动子控制下含有四环素调控系统反式激活蛋白(tTA)的编码核酸的第一区，和b)在经修饰含有1-10、优选3-8、特别是7个tetOp序列的最小CMV启动子控制下含有目的核酸、特别是编码人酪氨酸羟化酶的核酸的第二区，c)含有UMS序列的第三区，其中a)和b)两区域以相同的转录方向放置。
本发明核酸可以是DNA或RNA，特别是基因组DNA(gDNA)或互补DNA(cDNA)。本发明的核酸可以按本领域技术人员熟知的技术制备，例如涉及核酸的合成、文库筛选、连接、酶切、扩增、克隆等，如实施例中所述(见Maniatis等)。a)、b)和c)三个区可以分别合成，然后以功能性方式组装，即以相同的转录方向。a)和b)区之间的距离是可变的，只要不损害本发明构建体的效力。例如，这些区域可以间隔例如0-3000bp，一般0-1000bp，最好至少500bp。a)和b)区间的该距离一般由c)区(当其存在时)的长度和所用载体的克隆容量决定。这易于由本领域技术人员来调整。本发明的核酸可以含有各种来源的元件，特别是来自原核、真核(动物、植物、病毒等)、合成或半合成的核酸。
本发明还涉及含有如上所定义核酸的任何载体。这可以是本领域技术人员已知的任何载体，如质粒、粘粒、噬菌体、YAC、HAC、转座子、附加体、病毒等。本发明优选的一类载体是病毒载体，例如腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、或一些逆转录病毒(特别是慢病毒)。特别优选对神经细胞、特别是神经祖细胞有趋向性的病毒。对此，本发明中特别优选的载体是腺病毒。
用于实施本发明的腺病毒最好是缺陷性重组病毒，即其基因组包含外源核酸、不能在细胞中自主复制。更优选，本发明的腺病毒是至少E1和E2区全部或部分缺陷的。
这还可以是第3代缺陷性重组腺病毒，即E1和E4区全部或部分缺陷，可能还有E3区缺陷。
本发明的具体方案中，使用带有影响如下区域全部或功能部分之缺失的腺病毒—E1、E4和E3，—E1、E4和E2，—E1、E4、E2和E3，—以上区域以及编码腺病毒晚期功能之基因(L1-L5)的全部或部分，或—整个病毒编码区。
在文献中大量报道了腺病毒基因组的结构。对此，腺病毒Ad5的基因组已被完全测序，并可在数据库中得到(特别见GeneBankM73260)。同样，已对其他腺病毒基因组(Ad2、Ad7、Ad12、狗腺病毒(CAV-2等)的部分、甚至全部测序。另外，缺陷性重组腺病毒的构建也已在文献中有描述，例如，专利申请WO 94/08152、WO95/02697和WO 96/22378描述了E1和E4区中的不同缺失。同样，专利申请WO 96/10088描述了带有lva2基因修饰的载体，WO 94/26914描述了动物来源的腺病毒，WO 95/29993描述了涉及腺病毒E2区的缺失。
用于本发明的重组腺病毒最好含有影响E1a和E1b区的基因组E1区中的缺失。作为一个具体的实例，可以提到涉及如下核苷酸的缺失454-3328；382-3446或357-4020(参照Ad5基因组)。
另外，E4区中的缺失优选涉及全部开放读码框架，例如33466-35535或33093-35535的缺失，或仅缺失E4区的一部分(例如ORF6或ORF3)，如专利申请WO 95/02697和WO 96/22378中所述，这些专利申请引入本文作为参考。
对于还缺乏晚期功能(“最小”载体)或缺乏整个编码区(“无肠”载体)的腺病毒，其构建已由例如Parks等，PNAS 93(1996)p.13565和Lieber等，J.Virol.70(1996)p.8944报道。
本发明的核酸可以插入在重组腺病毒的不同位点上。可以插入在E1、E3或E4区中，取代缺失的序列或额外加入。还可以插入在病毒顺式生产的必需序列(ITR序列和衣壳化序列)以外的其他位点。
另外，重组腺病毒可以是人或动物来源的。关于人源腺病毒，优选C组中的那些，特别是2型腺病毒(Ad2)、5型腺病毒(Ad5)；或腺病毒7(Ad7)或腺病毒12(Ad12)。在动物来源的多种腺病毒中，优选来自狗的腺病毒，特别是腺病毒CAV2的所有株[例如manhattan株或A26/61株[ATCC VR-800]。其他动物来源的腺病毒特别见于专利申请WO 94/26914中，后者作为参考文献引入本文。
重组腺病毒在衣壳化细胞系中生产，即能够反式补充重组腺病毒基因组中缺陷的一个或多个功能的细胞系。在本领域技术人员已知的衣壳化细胞系中，例如可以提到293细胞系，其中整合了腺病毒基因组的一部分。更准确地讲，293细胞系是一种人胎肾细胞系，含有5型腺病毒(Ad5)基因组的左端(约11-12％)，包括左侧ITR、衣壳化区、E1区(包括E1a和E1b)、pIX蛋白编码区和pIVa2蛋白编码区的一部分。该细胞系能够反式补充E1区缺陷的(即缺少E1区的全部或部分)重组腺病毒，并能产生高滴度病毒原种。该细胞系还能够在有效温度(32℃)下产生另外含有热敏感性E2突变的病毒原种。也已报道了一些其他能补充E1区的细胞系，特别是基于人肺癌细胞A549(WO94/28152)或基于人成视网膜细胞的那些(Hum.Gen.Ther.(1996)215)。另外还报道了能够反式补充腺病毒多种功能的细胞系。具体讲，可以举出补充E1和E4区的细胞系(Yeh等，J.Virol.Vol.70(1996)p559-565；Cancer Gen.Ther.2(1995)322；Krougliak等，Hum.Gen.Ther.6(1995)1575)和补充E1和E2区的细胞系(WO 94/28152，WO 95/02697，WO 95/27071)或衍生自这些细胞并可用于产生最小腺病毒的细胞系，特别是由于它们还表达参与这种病毒构建的位点特异性重组酶活性。
一般通过将病毒DNA引入衣壳体细胞，然后约2或3天后(腺病毒的动力学周期为24-36小时)裂解这些细胞的方法生产重组腺病毒。为了实施该方法，引入的病毒DNA可以是完整的重组病毒基因组，任选地在细菌(WO 96/25506)或在酵母中(WO 95/03400)构建，并转染到细胞中。还可能涉及一种用于感染衣壳化细胞系的重组病毒。病毒DNA还可以以片段的形式被引入，该片段每个带有重组病毒基因组的一部分，并有同源性区域，使得在引入衣壳化细胞中后通过不同片段间的同源重组重建重组病毒的基因组。
在细胞裂解后，可以通过任何已知技术分离重组病毒颗粒，例如氯化铯梯度离心或层析法。专利申请FR 9608164中报道了一种替代方法，该申请引入本文作为参考。
本发明的另一个目的涉及含有如上所定义载体、优选如上所定义缺陷重组腺病毒的组合物。在该实施方案中，本发明组合物可以含有不同量的重组腺病毒，这易于由本领域技术人员根据具体的应用(例如体外、离体或体内)来调节，一般而言，组合物含有105-1015p.v.、优选107-1012p.v.的重组腺病毒。术语p.v.指组合物中存在的病毒颗粒的数目。
本发明的载体和组合物可用于直接在体外或体内向细胞中转移并有控制地表达核酸，或用于在细胞中引入核酸以便将其植入(移植)体内。
本发明的另一目标涉及含有如上所定义核酸或载体的任何细胞。优选，该细胞为哺乳动物细胞，优选人细胞。在一个特别优选的方案中，该细胞是一种神经细胞，特别是神经祖细胞。这种细胞群例如是人神经祖细胞，如Buc等(Neurobiol.Dis.2(1995)37)所述。
对此，本发明一个具体实施方案包括用含如上所定义核酸的重组腺病毒遗传修饰的神经祖细胞。
本发明还涉及含有如上所述细胞的组合物。
本发明还涉及如上所定义的核酸或载体或组合物制备用于体内表达目标核酸的组合物的应用。
本发明还涉及如上所定义核酸或载体或组合物制备用于体内在神经系统中表达目的核酸的组合物的应用。
在一个具体方案中，本发明涉及一种在神经系统中有控制地表达核酸的方法，包括在主体神经系统中植入如上所定义的细胞，通过给予该主体四环素或四环素类似物控制表达。
本发明的组合物可以有不同的形式，如溶液、凝胶、粉末等。组合物一般呈溶液形式，优选为无菌溶液，例如等渗盐水溶液(磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、或氯化镁等，或这些盐的混合物)，或为干组合物，特别是冻干品，根据情况加入无菌水或生理盐水可以构成溶液。也可以使用其他赋形剂，例如水凝胶。该水凝胶可以从任何生物相容性非细胞毒性聚合物(均聚或异聚)制备。这样的聚合物例如已在专利申请WO 93/08845中描述。另外，本发明的组合物可以装在任何适当类型的装置中，如小管、安瓿、小袋、注射器、小圆底瓶等。
如上所述，本发明的组合物可以在体外、离体或体内使用。
对于体外或离体应用，可以在适当的装置(板、盒、袋等)中在如上所定义载体的组合物存在下直接培养细胞。对于这种应用，含有腺病毒的组合物可以以每细胞10-1000p.v.、优选100-2000p.v.的感染复数(MOI)使用。
对于体内应用，可以配制本发明的组合物，以便能以表皮、口服、胃肠外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内、透皮、肿瘤内等途径给药。在此应用中，特别是对于细胞组合物，所用的组合物最好含有104-106细胞，更优选105-106个细胞。另外，植入的组合物优选含有高密度的细胞(约每微升105-106个)。实施例中所示结果，实际上表明，高密度细胞的应用有利于移植物的留存和所植入细胞的存活。另一方面，为了更有利于体内移植物的存活，还可能同时或预先(甚至随后)给予一种或多种免疫抑制化合物/治疗(Neuroscience 78(1997)685)。
为此，本发明还涉及体内转移核酸的方法，包括给予如上所述的组合物。本发明可以用于例如动物，以建立病理模型、研究基因的调节，或用于人体，以研究标记、生物利用度，或用于医疗目的。
为了调控表达，本发明组合物最好含有四环素或能够对反式激活蛋白tTA活性起作用的任何四环素类似物。一种这样的类似物例如由强力霉素构成(Kistner等，PNAS 93(1996)10933)。可用于本发明的其他类似物例如见于Alvarez等(Gene Ther.4(1997)993)，后者引入本文作为参考。类似物的用量易于由本领域技术人员根据所用类似物和构建体而确定。例如，O.1ng/ml剂量的强力霉素足以在体外完全阻断本发明构建体中核酸的表达。
本发明特别适于治疗(即部分或完全减退)神经变性疾病，尤其是帕金森氏病(MP)。MP是一种以黑质中多巴胺能神经元进行性丧失为特征的疾病。进行了L-DOPA(L-多巴)治疗以图控制该病的症状，但其效力随着疾病的进展而下降。本申请提供了一种治疗该病的有利的替代方法，其中引入参与体内多巴胺合成的基因(酪氨酸羟化酶，TH)。用多巴胺能化合物进行的长期药物治疗试验表明，这些治疗诱导一种不受调控的全身化作用，在多数病例中导致运动神经元的很令人不安的波动。本发明特别适合于这类状态，因为它能精确地局部控制L-多巴的合成，这对获得能生理再现多巴胺能刺激复杂机制的运动反应是必需的。
本申请将在下述实施例中做详细描述，这些实施例应视为说明性的而限制性的。
图1含本发明核酸的腺病毒基因组的结构示意图，显示了反向末端重复序列(ITR)和衣壳化序列(4)。pIX代表编码腺病毒蛋白IX的序列。
图2图2A以不同的MOI用腺病毒AdPGK.tet.hTH-1感染人神经祖细胞。所显示的数值为四个实验的平均值。
图2B和2CTH在人神经祖细胞中的体外生产，以MOI＝140感染后7天通过免疫细胞化学法测定。图2B无处理，图2C是在感染后立即开始到第7天用强力霉素(10ng/ml)处理。放大倍数为360(图B)和220(图C)。
图3在第O天(感染后第5.5天)加入(a)或收回(b)强力霉素(5ng/ml)后，腺病毒AdPGK.tet.hTH1(MOI＝40)感染的培养物中hTH活性消失(a)和再现(b)的动力学。在第0天未处理的培养物中的hTH活性确定为100％。(c)不同剂量的强力霉素对hTH表达的影响，在感染后第11天测定。
图4腺病毒AdPGK.tet.hTH-1(MOI＝40)感染的人神经祖细胞纹状体内植入物中，与TH的免疫反应性，在(a)未处理动物和(b)每天用强力霉素处理的动物15μm大脑恒冷箱切片上，用抗TH免疫组织化学法测定。(a)和(b)的紫色标记揭示存在与洋地黄毒苷标记之alu探针杂交的人细胞，与偶联有碱性磷酸酶的抗洋地黄毒苷抗体保温，然后用特异性底物显色。放大倍数为110。
图5腺病毒AdPGK.tet.hTH1(MOI＝40)感染的人神经祖细胞移植物中的TH免疫反性性，在(a)未处理动物和(b)每天用强力霉素处理的动物15μm大脑恒冷箱切片上，用抗TH免疫组织化学法和用S35标记的HTH-1特异性反义寡核苷酸原位杂交法测定。切片用甲酚紫反染。放大倍数为450。
图6tTA基因(A)、UMS序列(B)、Op序列(C)和CMV最小启动子(D)的核苷酸序列。
实施例I.材料和方法1.腺病毒AdPGK.tet.HTH-1的构建含有四环素调控系统反式激活蛋白(tTA)和人巨细胞病毒最小启动子(PhCMV)的编码序列的DNA片段通过用酶Xho I和Sca I消化从质粒pUMS-luc(Corti等，Neuroreport 7(1996)1655)中切出，并插入在BglII/Cla I酶消化的穿梭质粒pCMVlucIX(由M.C.Geoffroy提供)中。获得载体ptetIX。含后边接有SV40病毒多腺苷酸化信号的人酪氨酸羟化酶(hTH-1)cDNA(Grima B.等，Nature 1987，326707-711)的BglII/HindIII片段插入在ptetIX载体的Cla I和EcoRV位点之间，生成载体ptetIX hTH-1。在载体ptetIXhTH中控制tTA表达的人巨噬细胞立即早期启动子(phCMV)被替换为鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的遍在型启动子(Adra等，Gene 1987；60-65)。将含有PGK启动子的Xho I/Spl I片段连在载体ptetIXhTH-1的Spe I和Spl I位点之间，生成质粒pPGKtetIXhTH-1。为了进行同源重组(Stratford等，J.Clin.Invest.(1992)626)，将载体pPGKtetIXhTH-1用Xmn I线性化并与腺病毒Adβgal的Cla I大片段共转染到能反式补充E1区的293细胞系中。通过板上实验将重组腺病毒AdPGK.tet.hTH-1纯化两次。通过在293细胞中扩增获得了病毒原种，在氯化铯梯度上纯化、然后在Sephadex柱上纯化。在293细胞上板上滴定测定的病毒滴度为3.5×1010pfu/ml。
2.人神经祖细胞的增殖和培养按已报道的方法(Buc等，Neurobiol.10(1995)37)获取人胎脑原代细胞并在补有碱性FGF的无血清培养中繁殖。
3.人神经祖细胞的感染为了进行体外研究，将细胞以6-7×105个细胞/孔的密度接种在12孔组织培养板上，并与病毒以所选择的感染复数(MOI)在400μl无血清的已知成分培养液(DS-FM)中培养。6小时后，除去上清液并用等体积的DS-FM更换。在感染后的不同时间，收集并离心(4000RPM，5分钟)细胞，将沉淀物-80℃冷冻，待用于酶试验(Reinhardt等，生命科学(life Science)，(1986)21-85)。
为了移植，将细胞以5×106细胞/板的密度接种在直径6cm的组织培养板上，并以40pfu/细胞的MOI与病毒AdPGK.tet.hTH-1一起保湿6小时。感染的当天，如前人所述(Sabaté等，Nature Genetics，9(1995)256)回收细胞，以每微升4×105细胞的密度重悬于DS-FM培养基中，在整个移植操作过程中保持在冰上。
4.大脑内的损伤和移植在大脑内移植前5-6周，如前人所述(Horellou等，Neuron 5(1990)，393)以立体定位方式在成年Sprague-Dawley大鼠(Chaarles-River)的中纹状体左上多巴胺能通道中注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)。在麻醉下给16只大鼠进行植入，用800μl/kg氯胺酮(UVA)和Rompun(Bayer)的1∶1混合物麻醉。在受损纹状体的以下立体定位坐标的2个位点，每处用10μl Hamilton注射器注射1μl细胞悬液前囟前(AB)+0.7，中线外侧(LM)+2.5，硬脑膜表面腹侧(V)5；及AB+1.5，LM-2.5，V5(起始线固定于0)。每天给动物注射10mg/kg的环孢菌素。
5.原位杂交和免疫组织化学移植后4周，如前人所述(Sabaté，同上)灌注动物。回收大脑并在4％pfa中固定，在PBS培养基、20％蔗糖中保存。随后，获得15μm的切片。
使用以带洋地黄毒苷尾的核苷酸标记的人alu特异性引物(5′-XTTgCAgTgAgCCgAgATCgCgCC-3′)杂交，从而检测人细胞。在初始变性步骤(搅拌下95％甲酰胺、0.1×SSC中75℃20分钟)后，如前人所述(Dumas等，J.Chem.Neuroanat.5(1992)11)处理切片。使用S35标记的针对人TH第一外显子的寡核苷酸(5′-TgCCTgCTTggCgTCCAgCTCgACA-3′)在移植物中检测到了人TH-1的RNA。杂交条件与Lanèce等(J.Neurochem.66(1996)1819)所述的相同。对于免疫组织化学法，切片按常规技术处理。
II.结果1.在本发明调控系统控制下编码人TH-1之腺病毒(AdPGK.tet.hTH-1)的制备为了从仅一个腺病毒载体获得hTH-1转基因的受控表达，修改了原先基于使用两种载体的四环素tet-关闭负调控系统。将对四环素敏感的反式激活蛋白tTA和人TH-1的cDNA插入了E1和E3区缺失的腺病毒Ad5的框架中。在载体AdPGK.tet.hTH-1中，tTA的表达处于磷酸甘油酸激酶(PGK)鼠基因的遍在型启动子控制之下，而人TH的转录受tTA敏感的最小启动子(CMV启动子)的控制。在tTA和CMV启动子之间插入了UMS序列，以限制这两个转录单元之间的转录干扰。2.AdPGK.tet.hTH-1对人神经祖细胞的感染体外受控表达为了确定腺病毒Ad PGK.tet.hTH-1能否导致人神经祖细胞中活性TH的合成，以不同的感染复数感染了细胞(图2a)。所得结果表明，被感染细胞中的TH活性根据所用载体的剂量而提高，这证明腺病毒Ad PGK.tet.hTH-1是功能性的。
在该腺病毒感染的细胞中研究了用强力霉素调控hTH-1基因表达的可能性。当在感染后立即向培养液中加入(10ng/ml)该抗生素时，在任何时刻都没能检测到任何TH活性，甚至在最高病毒剂量下亦如此。另外，没有检到任何具有TH免疫反应性的细胞(图2b和2c)。
随后检查了在已表达该转基因的细胞中基因表达被随后中止的可能性。为此，在感染后5.5天向培养基中加入了强力霉素，此时细胞中已可检测到TH活性。所得结果表明，酶活性逐步下降，在加入强力霉素后5.5天几乎完全消失(图3a)。因此，TH-1基因在本发明条件下在人神经祖细胞中的转录可以被很有效地负调控。
为了检验是否可能重新诱导该转基因的活性，在从感染细胞的培养基中收回强力霉素后追踪TH活性(图3d)。所得结果表明，在这些细胞中TH活性逐步提高，这表明强力霉素对转基因的抑制是可逆的。
为了确定抑制基因表达所需的最低抗生素剂量，感染后立即将细胞与不同浓度的强力霉素保温(图3c)。当0.01ng/ml量的TH活性可以被检测到时，0.1ng/ml的抗生素浓度足以阻止TH活性的出现。3.向大脑中移植腺病毒AdPGK.tet.hTH-1感染的人神经祖细胞体内表达调控本实施例证明本发明系统，特别是腺病毒感染的人神经祖细胞调节体内人TH表达的能力，以及本发明系统尤其经强力霉素调节该体内表达的能力。将细胞用腺病毒AdPGK.tet.hTH-1感染，然后植入在大鼠的纹状体中，该纹状体已通过注射毒素6-OHDA造成了多巴胺能通道的单侧损伤。为了有利于移植物的留存，给每只动物移植高密度(4×105/μl)悬浮的大量细胞(8×105)。移植后，不处理动物(n＝8)或用强力霉素(水中1mg/ml)每天处理(n＝8)。移植后四周，将大鼠处死，分析大脑中TH的表达。
用针对人alu特异性重复序列的寡核苷酸原位杂交证明，在所有检测的大脑中含有人细胞的存活移植物(图4a)。在用强力霉素处理的动物和未处理的动物间，没有观察到移植物大小或外观上的任何差异。
未处理动物中的移植物具有强TH免疫反应性(图4a)。移植物中表达HT的细胞数估计在5-10％之间。移植后在无血清培养基中培养6天的细胞中相似的百分比也具有TH免疫反应性。这些结果清楚地表明，在与体外相同的条件下基因在体内表达。
而在接受强力霉素的移植动物中没有检测到任何对TH免疫活性的细胞(图4b)。因此，强力霉素有效地抑制了移植物中免疫组织化学可检测量TH的出现。
为了确定强力霉素的效应是否反映在转录水平对遗传表达的严格控制，用TH-1信使RNA特异的寡核苷酸对切片进行原位杂交。未处理动物中的移植物被强烈标记。该标记与免疫反应性细胞共同定位(图5a)。相反，在被处理动物的移植物中设检测到任何特异性标记(图5b)。
结论，可以说由人神经祖细胞移植引入的腺病毒情形下，本发明系统中转基因的转录被强力霉素有效抑制。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称RHONE-POULENC RORER SA(B)街道Raymand Aron大道20号(C)城市安东尼(E)国家法国(F)邮编92165(H)传真33155717291(ii)发明名称转基因表达调控的新系统(iii)序列数1(iv)计算机可读形式(A)载体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PetentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度2502碱基对(B)类型核苷酸(C)链数单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟否(iv)反义否(ix)特征(A)名称/关键词-tTA(A)(B)位置1..1040(ix)特征(A)名称/关键词-UMS(B)(B)位置1041..2069(ix)特征(A)名称/关键词-7 OP(C)(B)位置2069..2362(ix)特征(A)名称/关键词-1 OP(B)位置2070..2110(ix)特征(A)名称/关键词-CMV最小启动子(D)(B)位置2363..2502(xi)SEQ ID NO.1的序列描述CTCGAGGAGC TCGAATTCAT ATGTCTAGAT TAGATAAAAG TAAAGTGATT AACAGCGCAT60TAGAGCTGCT TAATGAGGTC GGAATCGAAG GTTTAACAAC CCGTAAACTC GCCCAGAAGC120TAGGTGTAGA GCAGCCTACA TTGTATTGGC ATGTAAAAAA TAAGCGGGCT TTGCTCGACG180CCTTAGCCAT TGAGATGTTA GATAGGCACC ATACTCACTT TTGCCCTTTA GAAGGGGAAA240GCTGGCAAGA TTTTTTACGT AATAACGCTA AAAGTTTTAG ATGTGCTTTA CTAAGTCATC300GCGATGGAGC AAAAGTACAT TTAGGTACAC GGCCTACAGA AAAACAGTAT GAAACTCTCG360AAAATCAATT AGCCTTTTTA TGCCAACAAG GTTTTTCACT AGAGAATGCA TTATATGCAC420TCAGCGCTGT GGGGCATTTT ACTTTAGGTT GCGTATTGGA AGATCAAGAG CATCAAGTCG480CTAAAGAAGA AAGGGAAACA CCTACTACTG ATAGTATGCC GCCATTATTA CGACAAGCTA540TCGAATTATT TGATCACCAA GGTGCAGAGC CAGCCTTCTT ATTCGGCCTT GAATTGATCA600TATGCGGATT AGAAAAACAA CTTAAATGTG AAAGTGGGTC CGCGTACAGC CGCGCGCGTA660CGAAAAACAA TTACGGGTCT ACCATCGAGG GCCTGCTCGA TCTCCCGGAC GACGACGCCC720CCGAAGAGGC GGGGCTGGCG GCTCCGCGCC TGTCCTTTCT CCCCGCGGGA CACACGCGCA780GACTGTCGAC GGCCCCCCCG ACCGATGTCA GCCTGGGGGA CGAGCTCCAC TTAGACGGCG840AGGACGTGGC GATGGCGCAT GCCGACGCGC TAGACGATTT CGATCTGGAC ATGTTGGGGG900ACGGGGATTC CCCGGGTCCG GGATTTACCC CCCACGACTC CGCCCCCTAC GGCGCTCTGG960ATATGGCCGA CTTCGAGTTT GAGCAGATGT TTACCGATGC CCTTGGAATT GACGAGTACG1020GTGGGTAGGG GGCGCGAGGA TCTCAGATTT GTGCATACAC AGTGACTCAT ACTTTCACCA1080ATACTTTGCA TTTTGGATAA ATACTAGACA ACTTTAGAAG TGAATTATTT ATGAGGTTGT1140CTTAAAATTA AAAATTACAA AGTAATAAAT CACATTGTAA TGTATTTTGT GTGATACCCA1200GAGGTTTAAG GCAACCTATT ACTCTTATGC TCCTGAAGTC CACAATTCAC AGTCCTGAAC1260TATAATCTTA TCTTTGTGAT TGCTGAGCAA ATTTGCAGTA TAATTTCAGT GCTTTTAAAT1320TTTGTCCTGC TTACTATTTT CCTTTTTTAT TTGGGTTTGA TATGCGTGCA CAGAATGGGG1380CTTCTATTAA AATATTCCAT GGCTTACATT TTTAATGTTT TGTTCTCTTA ATATGTTCAA1440AGCTACTCAA CTTTTATTCC CGAAAAATGT TTACTTTAAT TATTCTAATT TCTTACATAA1500AGCATTGAGG TGCTAACAAT TATATACTAT GTACAAGATG GCAGACTAAA TCATATCATA1560CCATCAAGTA GAAACCTGGA GTTTGGTGAA CTTTGAGTTG TTTATATGTC TCTCCTTTAT1620TGTCTTCTCA AAACCTGTGA TTCTGAAGTC AAAGGGACAC AGCTGTCACA TGAAAAGTGA1680TCACTTATCA CCTGTATGCG TAAAACACCT TACCAAGCAG CTAAGAGGAG TAACTCCTAG1740CCACTTTGAG AAACGTTTTT GAATAAACAG AGCAAGGCTC TTCCCCATTC TCCCAGAGAT1800ATAGCATAAA ACTGAGCGCA TTTTTATAAA ACAAAAAAGG AGGAATGTGT GGTTTGATGG1860CCAGACCCTG AATTTGAGTT CAGCATCTGC TTTTCCATAT TATAGATGGG TACCAGTGAT1920TCTGAGCCAT GTCTATTTCT CCTGACTTTT CCTCTGTTTT CCCACGCTTG CTGATATTTA1980CAGCCGTGGT CATCACAATC ACCTTTGTTC CTTTCTTCCT TCCTCCAACT CTGCATTAAA2040TTCCAGGAAC TTGCTTTCTG TGAAGTCTGA GTTTACCACT CCCTATCAGT GATAGAGAAA2100AGTGAAAGTC GAGTTTACCA CTCCCTATCA GTGATAGAGA AAAGTGAAAG TCGAGTTTAC2160CACTCCCTAT CAGTGATAGA GAAAAGTGAA AGTCGAGTTT ACCACTCCCT ATCAGTGATA2220GAGAAAAGTG AAAGTCGAGT TTACCACTCC CTATCAGTGA TAGAGAAAAG TGAAAGTCGA2280GTTTACCACT CCCTATCAGT GATAGAGAAA AGTGAAAGTC GAGTTTACCA CTCCCTATCA2340GTGATAGAGA AAAGTGAAAG TCGAGCTCGG TACCCGGGTC GAGTAGGCGT GTACGGTGGG2400AGGCCTATAT AAGCAGAGCT CGTTTAGTGA ACCGTCAGAT CGCCTGGAGA CGCCATCCAC2460GCTGTTTTGA CCTCCATAGA AGACACCGGG ACCGATCCAG CC 250权利要求
1.一种核酸，其特征在于含有a)含中等启动子控制下之四环素调控系统反式激活蛋白(tTA)编码核酸的第一区，和b)含tTA敏感性启动子控制下之目的核酸的第二区，其中a)和b)两区以相同的转录方向放置。
2.权利要求1的核酸，其特征在于另外含有置于a)和b)两区之间，限制a)和b)两区间之转录干扰的第三区c)。
3.权利要求2的核酸，其特征在于c)区含有一个转录终止子，优选UMS序列。
4.根据以上权利要求任一项的核酸，其特征在于在a)区中所述中等启动子是一种细胞启动子，优选组织特异性组成型细胞启动子。
5.权利要求4的核酸，其特征在于所述中等细胞启动子选自PGK、DHFR、EF1α、β-肌动蛋白、β-珠蛋白和MHCα基因的启动子。
6.根据以上权利要求任一项的核酸，其特征在于在b)区中所述目的核酸是一种编码目的蛋白或多肽的核酸。
7.权利要求6的核酸，其特征在于所述目的蛋白或多肽选自神经递质或其前体或合成酶和营养因子。
8.根据上述权利要求任一项的核酸，其特征在于b)区中所述启动子是一种在哺乳动物细胞中有功能的启动子。
9.一种核酸，其特征在于包含a)含PGK基因启动子控制下之四环素调控系统反式激活蛋白(tTA)编码核酸的第一区，b)在经修饰含1-10个tetOp序列的最小CMV启动子控制下含有人酪氨酸羟化酶编码核酸的第二区，和c)含UMS序列的第三区，其中a)和b)两区以相同的转录方向放置。
10.含有权利要求1-9任一项之核酸的载体。
11.权利要求10的载体，其特征在于其为一种病毒载体，优选腺病毒。
12.含有权利要求1-9任一项的核酸或权利要求10的载体的细胞。
13.权利要求12的细胞，其特征在于它是一种哺乳动物细胞，优选人细胞。
14.权利要求13的细胞，其特征在于它是一种神经细胞。
15.用含有权利要求9之核酸的重组腺病毒遗传修饰的神经细胞。
16.含有权利要求12-15任一项之细胞的组合物。
17.权利要求1-9的核酸或权利要求10的载体或权利要求16的组合物制备用于体内表达目的核酸之组合物的用途。
18.权利要求1-9的核酸或权利要求10的载体或权利要求16的组合物制备用于在神经系统中体内表达目的核酸之组合物的用途。
全文摘要
本发明涉及控制细胞中核酸表达的新组合物和方法。更具体讲,本发明涉及一种核酸,其特征在于含有:a)含中等启动子控制下之四环素调控系统反式激活蛋白(tTA)编码核酸的第一区,和b)含tTA敏感性启动子控制下之目的核酸的第二区。本发明特别适于控制神经细胞中体外或体内表达核酸,例如人酪氨酸羟化酶。
文档编号C12N5/10GK1352694SQ99813858
公开日2002年6月5日 申请日期1999年11月9日 优先权日1998年11月9日
发明者J·马利特, O·科迪 申请人:阿文蒂斯药物股份有限公司