核酸转运体和基因治疗用药学组合物的制作方法

专利名称：核酸转运体和基因治疗用药学组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及向细胞引入治疗基因的核酸转运体以及含有该转运体和治疗基因的基因治疗用药学组合物。更详细地说，本发明涉及核酸转运体、能够将与该核酸转运体相互作用的核酸和/或核苷酸衍生物构成的治疗基因安全高效地引入细胞内、并达到预期作用、且长期表达其作用的基因治疗用药学组合物。
作为基因治疗的临床应用，自1989年美国开始基因治疗的临床实验以来，意大利、荷兰、法国、英国、中国也开始了临床实验。但是，在基因治疗的临床应用中，开发将治疗基因高效安全地引入细胞的最佳基因形式和方法成为一个很大的技术课题。1980年代初期出现微注射等物理学方法应用的尝试，但不能稳定且高效地引入疾病治疗所需的治疗基因，未能进行临床应用。在这之后，开发了作为将治疗基因高效引入细胞的载体的重组病毒(病毒载体)，使基因治疗的临床应用开始成为可能。
目前最引人注目的病毒载体是小鼠白血病病毒(Molony MurineLeukemia Virus，下面称为MoMLV)来源的逆转录病毒载体，是利用了该病毒生活周期的优点。因为逆转录病毒具有在感染宿主后将自身遗传信息重组入基因组DNA的性质(Miller D.G.等，Mol.Cell.Biol.，10，4239，1990)，持续表达治疗基因的情况良好。此外，因其可以感染各种细胞，所以多种细胞可成为使用MoMLV载体治疗的对象。另一方面，此性质决定了病毒载体不能直接给予机体。其宿主范围很广，换而言之，对机体给予时缺乏对靶细胞的聚集性，从治疗效果和副作用等方面考虑不能进行静脉内给药等全身性的给药方法。所以，目前的治疗方法是将靶细胞从机体中分离，在试管内引入基因后，再注回机体而进行治疗的方法(US5399346)(ex vivo基因引入法)。此方法对靶细胞能够确实地向靶细胞引入治疗基因，可望得到治疗作用，但由于需要处理病毒载体的特殊设备、大量培养细胞的设备等，能够实施此治疗的设施很受限制。
基于以上的原因，人们希望开发出能够在体内引入基因的载体。此外，为了稳定地生产病毒载体，以病毒载体生成细胞的生产必需是高效的，但对于目前开发的病毒载体生成细胞(Miller A.D.和Buttlmore C.，Mol.Cell.Biol.，6，2895，1986)，为生产治疗必需量的病毒载体需培养大量细胞，与一般药物生产的花费相比价格太高，有很大缺点。更进一步，使用病毒载体时，有因免疫原性高而不能反复给药(特别是腺病毒载体)、治疗基因有长度限制等缺点。
另一方面，作为导入所需基因以取代此病毒载体的担体，尝试利用合成的多聚氨基酸，将此合成多聚氨基酸和要输送的药物结合，同时进行向靶细胞或细胞内的输送。WO79/00515和US5162505中公开了多聚氨基酸和要输送药物(核苷酸类似物、酶等)共价键结合的复合物。但是，如此任一个多聚氨基酸和药物结合的方法是共价键，摄入细胞内时，对担体和药物必需分离的情况是不适合的。此外，Wu等(G.Y.Wu和C.H.Wu，Advanced Drug Delivery Reviews，12，159，1993)用多聚氨基酸特别是多聚赖氨酸作为基因的担体，调制多聚氨基酸/基因复合物，成功地将其作用于细胞引入基因并表达。但是，以多聚氨基酸特别是多聚赖氨酸作为担体的复合物，浓度增加时容易生产沉淀，使用于实际疾病的治疗时有困难。特别是给予静脉内会生成沉淀样粒子的药液时，成为发生血管栓塞和血栓的原因；此外，即使在局部给药时，也有注射针阻塞、和不能向靶细胞引入治疗必需量基因等问题。
所以，作为能够和治疗基因形成复合物并不生成沉淀的核酸转运物(担体)，WO95/09009中公开了多聚赖氨酸和丝氨酸无规共聚物。但是没有明确公开对实际机体给药时的安全性。
S.Ferrari等报道(Gene Therapy，4，1100，1997)聚乙亚胺能高效地引入基因。但是，聚乙亚胺是机体本来不存在的物质，对机体的给药困难。
此外，特开平9-173067号报道了使用1～20个阳离子性氨基酸上加成脂肪酸的脂肽以引入基因，作为此脂肪酸加成的氨基酸，在赖氨酸、鸟氨酸、二氨基丁酸、二氨基丙酸中，二氨基丁酸效果最好。但是该公报只公开了将二氨基丁酸上加成C10～14脂肪族酰基的担体和二油酰基磷脂酰乙醇胺的脂质体同时给予培养细胞，缺乏实用性；而且存在含二氨基丁酸的担体和脂质体同时使用时操作复杂、花费高等问题。
所以，现在人们热切期望研究开发出能够往机体内安全、高效地引入治疗基因、且充分表达其作用的核酸转运体、和应用其的基因治疗用药学组合物。
本发明者们为解决上述课题进行了努力深入研究，结果发现，作为转运治疗基因的核酸转运体，使用二氨基丁酸和/或其可药用盐构成的担体能够高效、安全地往细胞内引入治疗基因，而且引入的基因的功能能够长期表达，从而完成了本发明。这里的“安全”是指不生成不溶性的沉淀，还有低抗原性。
具体地说，本发明提供含有碱性氨基酸和/或其可药用盐构成的多肽的核酸转运体。
此外，本发明提供含有二氨基丁酸和/或其可药用盐构成的多肽的核酸转运体。
更进一步，本发明提供含有二氨基丁酸和/或其可药用盐构成的多肽与聚乙二醇的嵌段共聚物的核酸转运体。
还有，本发明提供了上述核酸转运体，其特征在于上述多肽由残基数20个以上280个以下二氨基丁酸和/或其可药用盐构成。
此外，本发明提供含有上述任一种核酸转运体和治疗基因的基因治疗用药学组合物。
此外，本发明提供全身给药时、在肝脏特异性表达治疗基因的上述基因治疗用药学组合物。
更进一步，根据本发明提供了上述基因治疗用药学组合物，其特征在于它是全身给药时保持良好持续性的基因治疗用药学组合物，特别是上述持续性至少50天以上直至约210天。
此外，本发明提供上述基因治疗用药学组合物，其特征在于上述治疗基因为各种核酸(包括天然产物来源的和化学合成的)、或各种核苷酸衍生物(包括其化学修饰的衍生物)。
还有，本发明提供上述基因治疗用药学组合物，其特征在于上述核苷酸衍生物为反义或TFO(Triplex Forming Oligonucleotide三链寡聚核苷酸)。
此外，本发明提供基因治疗用药学组合物，其特征在于上述基因治疗用药学组合物更为低免疫原性。
本发明的基因治疗用药学组合物根据需要也可含有其它成分。
还有，本发明的基因治疗用药学组合物可含有以高效、组织特异性摄取为目的的、与能够特异性识别该组织的各种配基结合的核酸转运体。
图2表示实施例2测定的、表达的虫荧光素酶的活性测定结果。图中12、26、49、62、170、348分别表示表2的合成例1、2、3、4、5、7所得的MW(分子量)1900、4200、7800、9900、27200、55700的pDBA。
图3表示实施例3测定的、表达的虫荧光素酶的活性测定结果。图中pDBA为表2合成例3所得的，pDBApeg为合成例8所得的。
图4表示实施例4测定的、表达的虫荧光素酶的活性测定结果。图中non-T.f.表示没有转染。此外，12、26、49、62、170分别表示表2的合成例1、2、3、4、5所得的MW(分子量)1900、4200、7800、9900、27200的pDBA。
图5表示实施例5所得的结果。图5A表示2天后的结果，图5B表示21天后的结果。图中pDBA-49表示表2合成例3所得的。
图6表示实施例6所得的结果。
图7表示实施例7所得的结果。图中12、26、49、62、170分别表示表2的合成例1、2、3、4、5所得的MW(分子量)1900、4200、7800、9900、27200的pDBA。
图8表示实施例8所得的结果。图中pDBA表示表2合成例3所得的。
图9表示实施例10所得的、静脉内给药后至1小时的出现症状的观察结果。


图10表示实施例10所得的、静脉内给药30分钟后皮肤出现的色素斑直径的测定结果。
图11表示实施例11所得的、流式细胞计测定的结果。图11A表示只用作为对照的FITCOligo时的结果。此外，图11B表示使用FITC Oligo和pDBA#49(表2合成例3所得的MW(7800)的物质)时的结果。图11C表示使用FITC Oligo和pDBA#170(表2合成例5所得的MW(27200)的物质)时的结果。
图12表示实施例11所得的、评价引入的细胞的比例的结果。图中12、49、170分别表示表2合成例1、3、5所得的MW(分子量)1900、7800、27200的pDBA。
发明实施的最佳形式(核酸转运体的结构)本发明核酸转运体具有的结构为二氨基丁酸构成的多肽，为含有式(1)所示(这里n表示自然数)结构的物质。 式(1)此外，本发明的核酸转运体具有的其它结构为二氨基丁酸可药用盐构成的多肽，为含有式(2)(这里n表示自然数)所示结构的物质。 式(2)更进一步，本发明的核酸转运体可以以任意比例含有上述两种结构。即，包括以任意比例以二氨基丁酸或其盐的形式存在的物质。
还有，上述二氨基丁酸可能存在光学异构体的D体和L体，本发明的核酸转运体为包括D体、L体、或它们任意混合的多肽的物质。即，包括聚L-二氨基丁酸、聚D-二氨基丁酸和聚DL-二氨基丁酸中任一个的多肽。
作为本发明中核酸转运体的残基，意指形成该多肽的单体二氨基丁酸(或其盐)基团；残基数意指这些分子的数目(以上述式的n表示)。本发明中核酸转运体的优选残基数为至少10个残基以上。更优选至少20个残基以上，最优选25个残基以上。此外，本发明中核酸转运体的优选残基数优选280个残基以下。此外，更优选250个残基以下。残基数太多时，合成困难而且处置不方便。此外残基数太少时，作为核酸转运体的性能不佳。还有，优选的残基数可根据使用的治疗基因或同时使用的成分的性质，由本领域技术人员进行容易、最适的选择。
作为二氨基丁酸盐，只要是可药用盐，并没有特殊的限定，优选盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐，乙酸、丙酸、柠檬酸、乳酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、丙二酸、富马酸、苹果酸等有机酸的盐，其中特别优选乙酸盐。还有，核酸转运体的多肽为聚二氨基丁酸·乙酸盐时，因二氨基丁酸·乙酸盐分子量为160，也可以用上述残基数表示分子量。
本发明核酸转运体的其它形式包括具有上述说明的二氨基丁酸构成的多肽与聚乙二醇的嵌共聚物结构的物质，以式(3)表示(这里n、m分别表示自然数)。 式(3)更进一步，因上述多肽具有一个羧酸基团，具有上述嵌段共聚物结构的物质也可以为式(4)所示的共聚物(这里n、n’、m分别表示自然数)。 式(4)这里关于聚乙二醇的分子量(或数m)没有特殊的限定，根据后述的原因通常优选200～25000左右。(核酸转运体的合成方法)以具有上述说明结构为特征的本发明核酸转运体的合成方法没有特殊的限定，优选应用包括通常周知的各种多肽合成方法(《新实验化学讲座》19，高分子化学I，1980年发行，丸善株式会社)在内的有机化学反应。更具体地说，在本发明中优选将单体成分适当反应使之聚合得到核酸转运体。此时，作为使用的单体，优选二氨基丁酸、γ氨基引入保护基团的二氨基丁酸、或具有可形成肽键的活化氨基和/或羧基的二氨基丁酸。在本发明中特别优选γ氨基保护了的、且容易形成肽键的二氨基丁酸酸酐化的物质(《新实验化学讲座》19，高分子化学I，1980年发行，丸善株式会社)。
对于单体的聚合，可使用各种、适当量的引发剂。具体地说，可以使用各种胺化合物、醇化合物。上述胺化合物中优选烷基胺，特别是丁胺。此外，作为醇化合物，如使用聚乙二醇可得到加成聚乙二醇基团的本发明核酸转运体。
本发明中多肽的合成特别优选按图1所示的合成路线进行。即，优选将γ氨基以适当保护基保护，且氨基酸部分用光气制成酸酐，作为缩聚的单体(图1的(10))使用。此外，使用此单体的缩聚反应可用适当的引发剂，可引入优选数目的单体。引发剂没有特殊的限定，优选各种胺化合物，特别优选使用丁胺。此外，使用适当的乙二醇作为引发剂，同样可得到具有优选数目单体的多肽且具有乙二醇基团的嵌段共聚物。具体地说，可以按照Helv.Chim.Acta，43,270(1960)或〔《新实验化学讲座》19，高分子化学I，1980年发行，丸善株式会社〕记载的方法进行。(核酸转运体的检测)本发明核酸转运体的结构具有如上所述的特征。所以，基于此结构上的特征，能够检测出本发明的核酸转运体。此外，本发明核酸转运体自身或应用其的基因治疗用药学组合物以各种形式使用时，可以实施适当的预处理，同样能检测出本发明的核酸转运体。必要前处理的选择对本领域技术人员是容易的。
检测方法没有特殊的限定，可以应用各种通常周知的多肽分析方法(J.Controlled Release 54，39-48，1998)。具体地说，可以应用以多肽的氨基酸分析方法进行二氨基丁酸的定性和定量分析，以各种液相色谱的分子量测定确定残基数，检测聚乙二醇基团存在的光谱分析(红外吸收光谱、核磁共振吸收光谱)、质谱或化学定性分析方法等。(基因治疗用药学组合物、治疗基因)本发明的基因治疗用药学组合物至少包括上述说明的本发明核酸转运体和治疗基因。这里的治疗基因意指下面说明的各种核酸和/或核苷酸衍生物。
核酸转运体和治疗基因可以以各种比例形成复合物，调制基因治疗用药学组合物；但治疗基因/核酸转运体(重量(w)/重量(w))在2/1～1/50的范围内可得到有效的作用，更优选治疗基因/核酸转运体(w/w)在1/1～1/30的范围内混合得到有效作用。治疗基因/核酸转运体(w/w)如果在1/50以上，和治疗基因复合物无关的游离核酸转运体量增加，如果在2/1以下，则和要引入细胞的细胞表面的亲和力降低导致治疗基因引入效率降低，均不可取。
因本发明的核酸转运体具有正电荷，可以和主要具有负电荷的治疗基因(例如核酸)保持静电结合。所以输送入靶细胞或细胞内后，能够有效地游离该治疗基因，表达治疗基因。此作用可通过适当选择治疗基因/核酸转运体的电荷比而受到控制。本发明中，例如在1/1～1/40的范围内可得到更好的效果。电荷比如果在1/1以下，和细胞表面和亲和力降低，导致治疗基因引入效率降低；如果在1/40以上则和治疗基因复合物无关的游离核酸转运体量增加。
对于本发明的基因治疗用药学组合物，往细胞内引入的治疗基因的核酸和/或核苷酸衍生物的种类、分子量、形状、编码基因的序列等没有特殊的限定。具体地说，核酸的分子量可以从20个碱基的寡聚核苷酸至数十千碱基的粘粒基因，没有特殊的限定。
对于核酸的形状，可以应用单链基因、双链基因、形成三链的基因、DNA、RNA、DNA/RNA嵌合型基因、硫代磷酸酯型基因、直链基因、环状基因等，没有特殊的限定。编码基因的序列除了治疗基因外，可以使用促进治疗基因转录的启动子、增强子、Poly A信号，引入了基因的细胞标记物和/或用于选择的标记基因、往细胞基因组DNA序列内高效插入基因的病毒来源基因序列，使作为药物作用的物质往细胞外分泌和/或滞留于细胞内局部的信号序列等的任一个。
治疗基因使用与疾病相对应的基因，即对疾病有拮抗作用的基因和对疾病的缺陷补足的基因。例如，对于炎症疾病，有编码SOD、抗炎性细胞因子、拮抗细胞粘附分子作用的多肽的基因；对于酶缺陷症，有编码正常酶的基因；对于受体缺陷症，有编码正常受体的基因；对于病毒感染症，有编码杀伤病毒感染细胞的胸苷激酶、白喉毒素等毒素的基因和编码抑制病毒复制的反义、三链螺旋、核糖体、假、反式显性突变体(transdominant mutant)等的基因；对于癌症，有编码杀伤癌细胞的胸苷激酶、白喉毒素等毒素的基因和钝化癌基因的反义、核糖体、三链螺旋等的基因、以及使癌细胞正常化的p53等抑癌基因，编码使涉及对抗癌药多药抗性的基因钝化的反义、三链螺旋、核糖体等的基因；对于家族性高胆固醇血症，有编码LDL受体的基因等。
更进一步，治疗基因中所用的表达盒只要是在靶细胞内能够表达的就可，没有特殊的限定。本领域技术人员很容易选择如此的表达盒。优选能在动物来源细胞内表达基因的表达盒，更优选能在哺乳动物来源细胞内表达基因的表达盒，特别优选能在人类来源细胞内表达基因的表达盒。表达盒所用的基因启动子例如有腺病毒、巨细胞病毒、人类免疫缺陷病毒、猿猴病毒40(SV40)、劳氏肉瘤病毒、单纯疱疹病毒、小鼠白血病病毒、新培斯病毒、仙台病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、乳头瘤(バピロ-マ)病毒、人T细胞白血病病毒、流感病毒、日本脑炎病毒、JC病毒、细小(バルボ)病毒B19、脊髓灰质炎病毒等病毒来源的启动子，白蛋白和热休克蛋白等哺乳类来源的启动子，CAG启动子等嵌合型启动子等。
作为使治疗基因编码的药物往细胞外分泌和/或在细胞内局部滞留的信号序列，可以使用白细胞介素2来源的信号肽(驹田富佐夫，《日本药学会第115年会讲演要旨集》4，12，1995)和促进核局部化的腺病毒E1a来源的肽、多瘤病毒巨大T抗原来源的肽、SV40巨大T抗原来源的肽、核质蛋白来源的肽、HTLV1p24转录后调节蛋白来源的肽(Kalderon，D.，etal.，Cell，39，499，1984)等。
本发明的基因治疗用药学组合物，例如可以通过将如上述所示的治疗用设计的治疗基因和核酸转运体混合进行调制。更具体地说，可以将核酸转运体和按治疗用途设计的治疗基因分别溶解于水、生理盐水、等张化缓冲液等适当溶剂后，混合，放置10分钟～30分钟，进行调制。此时，构成所用治疗基因的核酸和核酸转运体的比例没有特殊的限定，但对应1微克该核酸使用0.5～50微克，优选1～30微克的核酸转运体。(基因治疗用药学组合物的使用方法)本发明的基因治疗用药学组合物可用于首先从患者身上取出靶细胞到体外、引入目的基因后再将此细胞注回患者体内的自身移植基因治疗(ex vivo基因治疗)。此外，也可用于直接将治疗基因给予患者的基因治疗(in vivo基因治疗)。
作为基因治疗的方法，大致可分为使异常(病因)基因保持原样、添加新(正常)基因的增加基因疗法(Augmentation Gene Therapy)，和将异常基因用正常基因替换的替换基因疗法(Replacement Therapy)，但本发明的基因治疗用药学组合物可用于任一种方法。
本发明的基因治疗用药学组合物对机体的给药方法没有特殊的限定。例如可优选实施非口服给药，如注射给药。
本发明基因治疗用药学组合物的用量因其使用方法、使用目的而异，本领域技术人员能够很容易地适当选择，作最适化。例如，注射给药时，优选1天给药量为0.1微克/千克～1000毫克/千克，更优选1天给药量为1微克/千克～100毫克/千克。
本发明的核酸转运体和治疗基因形成复合物时不生成沉淀。所以，即使对血管直接给予基因治疗用药学组合物也没有引起血栓的危险，能够高效给予高精度的治疗基因。
本发明的核酸转运体和基因治疗用药学组合物将治疗基因向机体给药后不产生常见的抗原性。因此，为维持对机体的治疗效果，可在一定期间内反复给药。
本发明的基因治疗用药学组合物对于机体内的组织，例如肾脏、脾脏、肺、支气管、心脏、肝脏、脑、神经、肌肉、骨髓、小肠、结肠、大肠、皮肤、血管内皮等具有优良的效果。特别是全身给药，例如静脉给药时，能够在肝脏特异摄取。所以，特别是能够在肝脏安全、有效地表达治疗基因。
更进一步，以有效组织特异摄取为目的时，可以将组织特异的配基与核酸转运体结合。例如，以肝脏为目的时，将糖类(半乳糖、乳糖、脱唾液酸糖蛋白、寡聚半乳糖、透明质酸等)和核酸转运体结合，对肝脏的亲和力上升，能够得到更好的效果。此外，以减轻细胞毒性、血中滞留、在溶剂中的溶解度增加为目的时，可以使该核酸转运体中的二氨基丁酸和聚乙二醇(PEG)形成嵌段共聚物，也可进行修饰(已在合成方法部分进行过说明)。此时，PEG的分子量可使用200以上的。更优选1000以上的。此外，PEG的分子量优选25000以下，更优选10000以下，最优选5000以下。聚乙二醇的分子量为25000以上时，和细胞表面的亲和力降低，导致核酸引入效率降低；200以下时，作为目的的聚乙二醇的作用小，均不优选。
本发明的基因治疗用药学组合物是全身给药后能够在机体的细胞内长期持续表达治疗基因的物质。具体地说，可在50天以上至约210天持续表达。此持续时间可通过适当选择本发明的核酸转运体而调节。所以，这不仅使给药容易，而且使患者给药时的负担减少，非常有好处。
下面就实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不仅限于此。
本说明书中，聚二氨基丁酸(聚(2，4-二氨基丁酸))和聚二氨基丁酸乙酸盐简称pDBA。此外，pDBA包括基于可能的全部光学异构体的物质。还有，与聚乙二醇的嵌段共聚物以同样方式简称pDBApeg(或pDBA-PEG)。实施例1核酸转运体的合成(1)作为单体的Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA(4N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸N-羧酸酸酐)(10)的合成。(I-1)Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸(4N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸)(8)的合成将15克DL-2，4-二氨基丁酸二盐酸盐(1)(Sigma公司制造)溶于75毫升水，往其中加入11.7克碱式碳酸铜(2)，放置后，煮沸回流后，过滤。往滤液中加入16.6克碳酸氢钠、17.8毫升苄氧羰基氯(4)(和光纯药公司制造)，搅拌，以沉淀得到产物。过滤所得的产物，用丙酮和乙醚洗净后，干燥，得到15克Nγ苄氧羰基-DL-二氨基丁酸铜络合物(4N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸铜络合物，以下称Dba(Z)·Cu)(5)。
将11克上述所得的络合物(5)加入9.3毫升35％HCl、22毫升水、11毫升甲醇的混合液中，在硫化氢(H2S)气体存在下搅拌。在室温下静置后，除去过剩的硫化氢，过滤除去不溶物。将滤液减压，加入水和甲醇，冷却。再加入甲醇后，加入二乙基胺(7)，调节溶液的pH至7。滤过析出的结晶，分离，用乙醚在漏斗上洗净，干燥，以白色结晶得到4克产物。然后，将上述滤液浓缩，冷却，过滤分离析出的结晶，用乙醚在漏斗上洗净并干燥，以白色结晶得到1.5克产物。将其合并，合计得到5.5克(以原料氨基酸计算收率31％)的Nγ苄氧羰基-DL-二氨基丁酸(8)。(I-2)Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA(4N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸N-羧酸酸酐)(10)的合成将5克上述所得的(8)溶于200毫升四氢呋喃(THF)，往其中加入4.5克三光气(9)(双(三氯甲基)碳酸酯Aldrich公司制造)溶于40毫升THF的溶液，再在40℃下搅拌60分钟。减压下除去溶剂后，往所得粗产物中加入己烷溶解后，冷却。进一步在减压下充分除去己烷后，往所得粗产物中加入乙酸乙酯，溶解，过滤除去不溶物。往所得滤液中加入己烷，冷却，产物以白色结晶沉淀。过滤分离析出的结晶，减压干燥。此外，将上述滤液也减压浓缩后，作同样处理，结晶得到产物。这样所得的结晶用乙醚重结晶，得到2.7克精制的产物(10)(收率50％)。(II)聚合反应各种残基数的核酸转运体通过将上述所得的Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA(10)用各种比例的引发剂进行缩聚，然后把氨基保护基脱保护而得到。
这里，本发明中的残基数意指按下式(Arieh Yaron等，Biochim.Biophys.Acta，69，397-399，1963)算出的数目(最后为0.9的原因是在除去保护基的反应条件下约降低了10％的分子量)。更进一步，本发明中的分子量意指下式表示的。
残基数＝聚合度(n)＝〔Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA(10)的量(摩尔数)/引发剂的量(摩尔数)〕×收率(％)/100×0.9分子量＝n(聚合度)×残基量(以乙酸盐计，DBA乙酸盐的残基量＝160)下面就表1、表2的合成例3(残基数49)聚DL-二氨基丁酸及其乙酸盐的合成例进行说明，应用表1所示相同的其它条件得到合成例1(残基数12)、2(残基数26)、4(残基数62)、5(残基数170)、6(残基数278)、7(残基数348)的pDBA。此外，合成例3的聚二氨基丁酸及其乙酸盐中在末端结合聚乙二醇(14)(PEG，分子量1000)的聚二氨基丁酸-PEG(15)的合成条件也作为合成例8如表1和表2所示。(II-1)聚-Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸(11)的合成将1克(3.6mmol)Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸NCA(10)溶于19毫升乙腈。加入4.38毫克(0.06mmol)作为引发剂的丁基胺，在30℃下静置307小时。滤过所得的聚合物，用乙腈洗净。用索氏提取器以乙醚提取后，减压干燥，得到0.77克聚Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸(11)(聚合率91％)。(II-2)聚DL-二氨基丁酸乙酸盐(13)的合成将0.5克聚Nγ-苄氧羰基-DL-二氨基丁酸(11)溶于2毫升三氟乙酸，往其中加入25％溴化氢乙酸溶液(12)，振荡混合。静置后，加入乙醚，倾斜除去上清醚层，再用二异丙基醚作相同操作，倾斜除去上清醚层。所得沉淀物减压充分干燥。将所得固体中加入乙酸钠和水得到的混合液，用除去分子量1000以下的透析管进行流水透析后，20000G离心分离1小时，除去沉淀物。将所得溶液冷冻干燥，得到0.34克聚DL-二氨基丁酸乙酸盐(13)(收率91％)。表1以4-N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸NCA缩合的聚(4-N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸)的合成条件

a)BA丁基胺PEG1000聚乙二醇MW1000b)N-羧酸酸酐(NCA)/引发剂的摩尔比c)ACN乙腈表2利用聚(4-N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸)脱保护的聚(DL-2，4-二氨基丁酸)乙酸盐的合成条件

a)Poly(Dba(Z))；聚(4-N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸)Poly(Dba(Z))-PEG；聚(4-N-苄氧羰基-DL-2，4-二氨基丁酸)-PEG1000实施例2以各种分子量的pDBA往HepG2细胞中的基因引入质粒/pDBA复合物的调制将编码虫荧光素酶基因的质粒(约5.25Kb。预先插入虫荧光素酶基因的ピッカ基因控制载体(东洋インキ公司制造)，下面简称质粒A)的溶液和核酸转运体溶液分别按所定浓度的2倍调制。给药约30分钟前一边搅拌质粒溶液一边缓慢滴加核酸转运体溶液，调制质粒/核酸转运体复合物溶液。溶剂使用DMEM培养基(Sigma公司制造)。具体地说，调制25微克/毫升的质粒溶液，以质粒浓度为12.5微克/毫升的质粒/核酸转运体复合物溶液作为给药用检品。
质粒/pDBA复合物溶液对HepG2细胞的给药及测定方法对于实验前一天12孔多孔板(コ-スタ-公司制造)按每孔1×105个播种的HepG2细胞，在10％胎牛血清(三光纯药制造)存在下给予质粒/pDBA复合物溶液(质粒的终浓度为2.5微克/毫升)，在37℃下孵育4小时。交换新鲜的培养液，再孵育48小时。用PBS清洗2次后，加入细胞溶解剂(东洋インキ制造)，进行一次冷冻溶化。回收细胞溶解液，离心分离(12000rpm×10分钟)，用虫荧光素酶测定系统(东洋インキ制造)以荧光计(Lumit LB9501；berthold公司制造)测定上清中虫荧光素酶的活性。此外，离心上清的蛋白质浓度使用蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad公司制造)以微板读数器(Rainbow Thermo；Tecan制造)测定。
PDBA使用合成例1、合成例2、合成例3、合成例4、合成例5、合成例7(均见表2)所得的物质。还有，质粒A和pDBA的重量比(质粒/pDBA)调制为1/5(w/w)的复合物溶液，用于实验。表达的虫荧光素酶的活性测定结果如图2所示。可见残基数越多、即分子量越大的pDBA基因表达越高，确认pDBA中二氨基丁酸的聚合度优选达到一定程度以上。实施例3 pDBA对质粒的重量比变化的复合物往HepG2细胞的基因引入应用实施例2相同的方法，研究对HepG2细胞的基因引入。使用合成例3所得的pDBA，合成例8所得的pDBApeg。此外，质粒和pDBA的重量比(质粒/pDBA)按1/1、1/3、1/5、1/7、1/10、1/20(w/w)调制复合物溶液，用于实验。PDBApeg时，该比按1/1、1/5、1/10(w/w)调制复合物溶液，用于实验。
表达的虫荧光素酶的活性测定结果如图3所示，pDBA对应质粒的量如果增加则基因的表达也增加。实施例4使用尺寸大的质粒以pDBA向HepG2细胞的基因引入和实施例1、实施例2所用的质粒A一样，编码虫荧光素酶基因，为确认引入了比质粒A尺寸更大质粒(约11.1kb；EBV载体(pREP7；フナコシ公司制造)的多克隆细胞中用一般基因重组方法(Sambrook等，分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社，1989)插入虫荧光素酶基因所得的，以下简称质粒B)的基因，应用实施例1相同的方法，研究对HepG2细胞的基因引入。
所用的5种pDBA使用合成例1、合成例2、合成例3、合成例4、合成例5(都在表2)所得的。质粒B和pDBA的重量比(质粒/pDBA)按1/5和1/10(w/w)调制复合物溶液，用于实验。
表达的虫荧光素酶的活性测定结果如图4所示。对于pDBA，和实施例2所用的质粒(5.25kb)一样，即使使用更大尺寸的质粒(11.1kb)也显示出基因的表达。
此结果表明，使用本发明的核酸转运体引入治疗用基因时，不受该基因的尺寸限制。实施例5使用pDBA复合物对小鼠的基因引入质粒/pDBA复合物的调制质粒A溶液和pDBA溶液分别按所期望浓度的2倍调制。给药约30分钟前一边搅拌质粒溶液一边缓慢滴加pDBA溶液，调制质粒/pDBA复合物溶液。溶剂使用DMEM培养基。具体地说，调制50微克/毫升的质粒溶液，以质粒浓度为25微克/毫升的质粒/核酸转运体复合物溶液作为给药用检品。
合成例3所得的pDBA和质粒A按质粒/pDBA的重量比为1/7(w/w)调制复合物溶液，对Balb/C小鼠尾静脉给药。每只小鼠的质粒A给药量为12.5微克/0.5毫升。给药2天后和21天后测定肺、肝脏、脾脏表达的虫荧光素酶活性，以测定各组织的基因引入情况。
所得结果如图5所示。如图5A所示，给药2天后对于肝脏，pDBA作为核酸转运体使用的组和只给予质粒的组相比测定出显著高的虫荧光素酶活性。此结果说明使用本发明的基因转运体全身给药时，可以特别是向肝脏引入基因。更进一步，此结果说明，通过最适化本发明的基因转运体，全身给药能够对特定组织集中地引入基因。此外，如图5B所示，即使到给药后第21天肝脏也维持虫荧光素酶活性。此结果说明使用本发明的核酸转运体全身给药时，能够在特定组织长时间维持该基因的表达。更进一步，此结果说明，通过最适化本发明的核酸转运体，全身给药能够在特定组织最适化特定基因表达的持续时间。实施例6使用pDBA对质粒的重量比变化的复合物对小鼠的基因引入按照实施例4相同的方法，以虫荧光素酶活性的表达评价应用各种重量比调制的质粒A和pDBA的复合物进行的基因引入。
调制合成例3所得的pDBA和质粒A以各种重量比(质粒/pDBA＝1/0、1/1、1/5、1/10、1/20)的复合物溶液，对Balb/C小鼠尾静脉给药。
给药2天后测定肝脏表达的虫荧光素酶活性，以评价对各组织的基因引入情况。
所得结果如图6所示。可见pDBA对质粒的量增加有使基因表达水平增高的倾向。实施例7各种分子量的pDBA对小鼠的基因引入以虫荧光素酶活性的表达评价应用按实施例4相同方法调制的质粒A和pDBA的复合物进行的基因引入。
合成例1、合成例2、合成例3、合成例4、合成例5(都在表2)所得的5种pDBA和质粒A按质粒/pDBA重量比为1/5(w/w)调制复合物，对Balb/C小鼠尾静脉给药。测定给药2天后肝脏的虫荧光素酶活性。
所得结果如图7所示。当pDBA的残基数增加时，肝脏的基因表达有升高的倾向，和实施例5的结果一样，优选二氨基丁酸的聚合度在一定水平以上。实施例8小鼠尾静脉给药的基因的表达时间用按实施例4相同方法调制的质粒/pDBA复合物溶液对Balb/C小鼠(雄性，出生后8周)尾静脉给药(0.5毫升)，测定虫荧光素酶活性以评价给药后肝脏的基因表达。使用表2的合成例3所得的pDBA，按质粒/pDBA＝1/5(w/w)调制复合物溶液，将其用于上述给药。
所得结果如图8所示。对于质粒/pDBA复合物给药组，从给药后第2天至7个月可确认基因表达。即，单次给药后经过7个月以上在肝脏可确认基因表达。此外，为进行比较，实施了只给予质粒的给药、市售基因引入试剂ExGen500(Euromedex制造)和质粒复合物的给药。所得结果如图8所示。此二者和质粒/pDBA复合物给药组相比，其基因的表达水平均较低，只给予质粒在1个月以内、ExGen500和质粒的复合物给药组在3个月以内都不能检出基因的表达。
此结果表明，通过最适化本发明的核酸转运体能够最适化特定组织、特定基因表达的持续时间。实施例9单次给予大剂量pDBA时小鼠的生存率如下所述研究对小鼠直接给予大剂量pDBA溶液时小鼠的生存率。
将pDBA溶于生理盐水，调制各种浓度的pDBA溶液，对Balb/C小鼠尾静脉给药，观察症状。pDBA使用合成例1～7(都在表2)所得的。结果如表3所示。表3生存率(生存数/例数)用量pDBA的氨基酸残基(mg/kg)12 26 49 62 170 278 34812.5 0/3 0/3 0/3 0/3 - - -6.3 3/3 3/3 3/3 2/3 0/30/3 0/33.1 3/3 3/3 3/3 3/3 3/33/3 1/31.6 3/3 3/3 3/3 3/3 3/33/3 3/3-没有进行<氨基酸残基数；合成例序号、分子量>
12；合成例1(MW2000)26；合成例2(MW4200)49；合成例3(MW7900)
62；合成例4(MW 9900)170；合成例5(MW27200)278；合成例6(MW44500)348；合成例7(MW55700)此外，为进行比较，按上述相同方法研究单次给予大剂量聚乙亚胺(PEI)时小鼠的生存率。此时，使用作为ExGen500的主要成分阳离子性聚合物的聚乙亚胺(PEI)(Gene Therapy，4，1100，1997)。分子量1800和10000的PEI(都为和光纯药制造)用生理盐水稀释使用。比较结果如表4所示。表4生存率(生存数/例数)用量PEI(聚乙亚胺)(mg/kg)MW1800 MW1000012.5 0/1 0/39.31/3 -6.12/3 0/33.1 - 0/31.5 - 2/3根据表3和表4，可见pDBA的安全性比PEI高。观察到给予PEI单体时，大剂量给予大分子量(MW10000)的PEI时容易引起消化系统的器官障碍，给予小分子量(MW1800)PEI时有容易引起肺出血的倾向。
pDBA的安全性认为和其它阳离子性氨基酸相似，比比较例的聚乙二胺(PEI)更高。此外，如实施例3和实施例6所示，虽然从效果方面考虑优选氨基酸聚合度高的，但聚合度升高时大剂量给药容易引起肝脏的障碍，所以从效果和安全性两方面考虑，作为核酸转运体的pDBA残基数优选范围为10～280。更优选20～280。实施例10使用豚鼠的pDBA抗原性实验动物的致敏
对Hartley系雄性豚鼠每周1次、共4周、每次皮下给予1毫克/千克pDBA(合成例3所得的)，进行致敏。最终给药5天后将动物用乙醚麻醉，从心脏采血，使用所得的血清，使用无处置的豚鼠实施4小时被动皮肤过敏反应实验。此外，致敏的豚鼠在采血3天后实施主动性全身过敏反应实验。作为阳性对照组，用牛血清白蛋白(BSA)以10毫克/千克的量同样地给药以致敏动物。应用主动全身性过敏反应对抗原性的确认最终致敏8天后，对各动物在耳廓或前肢内侧的静脉内给予被检液(pDBA、1毫克/千克)0.1毫升/100克。此外，对阳性对照的BSA组作相同处理，BSA溶液静脉内给予(10毫克/千克)。按下面所示标准，静脉内给药后1小时观察出现的症状。所得结果如图9所示。可确认pDBA的免疫原性低。主动全身性过敏反应的判定标准如下所示。症状 评分无变化0竖毛、搔鼻、不安 1除上述之外还震颤、打喷嚏、运动亢进2除上述之外还排尿、排便、呼吸困难 3除上述之外还痉挛、仆倒4死亡 5应用4小时被动皮肤过敏反应对抗原性的确认在剃毛的未致敏豚鼠背部皮肤，用从致敏动物所得的原血清及生理盐水10、100、1000、10000倍稀释的血清每只0.1毫升皮内给予。皮内给药4小时后，用含0.5％Evans blue的被检液(pDBA、1毫克/千克)0.1毫升/100克在耳廓或前肢内侧的静脉内给药。此外，阳性对照组的BSA给药组所得的血清也作同样处理，用含0.5％Evans blue的BSA溶液(1毫克/千克)静脉内给药。测定静脉内给药30分钟后测定皮肤出现的色素斑块的直径。所得结果如图10所示。与阳性对照的BSA组中血清100倍至1000倍稀释的都检出皮肤反应相对应，pDBA组中给药血清原液才引起皮肤反应、出现同样的全身性过敏反应结果。可见pDBA的免疫原性很低。实施例11使用pDBA的寡聚核苷酸向细胞内的引入使用FITC标记的寡聚核苷酸(20聚体，Pharmacia制造)，研究寡聚核苷酸和各种pDBA的复合物向细胞内的引入能力。
将HepG2细胞以1×105个/孔接种于12孔板，培养24小时。使用FITC标记的寡聚核苷酸，作为其核酸转运体使用合成例3、合成例5所得的pDBA。将此3种pDBA和FITC标记寡聚核苷酸按寡聚核苷酸/pDBA＝1/1、1/5、1/10(w/w)调制复合物。往HepG2细胞中添加复合物溶液，培养4小时后，用PBS(-)清洗细胞2次。除去PBS(-)后，用细胞解离液(SIGMA制造)将细胞从玻璃器皿上解离，细胞悬浊液用流式细胞计(FACSCalibur；ベクトンデイツキンソン制造)测定。结果如图11(寡聚核苷酸/pDBA＝1/5(w/w))所示(图11中M1表示对照的实验结果，M2表示使用FITC标记寡聚核苷酸的实验结果)。此外，10000个细胞中FITC标记寡聚核苷酸引入的细胞比例的评价结果如图12(寡聚核苷酸/pDBA＝1/1、1/5、1/10(w/w))所示。
根据图11，只有寡聚核苷酸时几乎完全不向细胞内引入。由图12中算出FITC标记寡聚核苷酸引入的细胞的比例，只有寡聚核苷酸时几乎完全不向细胞内引入，此外，合成例1(残基数12)所得的pDBA作为核酸转运体使用的组寡聚核苷酸的摄入很少。与此相对，合成例3(残基数49)和合成例5(残基数170)所得pDBA的复合物组中寡聚核苷酸/pDBA＝1/5以上时，测定的10000细胞中观察到约70％～90％的细胞中摄入FITC标记的寡聚核苷酸。
此结果表明，本发明的核酸转运体(pDBA)也可优选用于反义、TFO(三链寡聚核苷酸)等寡聚核苷酸。
工业实用性本发明的核酸转运体，和各种治疗基因形成安全且免疫原性极低的复合物(本发明的基因治疗用药学组合物)，应用各种方式可将上述基因高效、安全地引入细胞，在该细胞内高表达上述基因。此外，适当选择残基数，能够表达各种大小的基因、各种类别的治疗基因(包括反义、TFO(三链寡聚核苷酸)等寡聚核苷酸)。
此外，使用本发明核酸转运体的治疗基因全身给药能够特别在肝脏引入该基因。
此外，通过最适化本发明的核酸转运体，治疗基因全身给药有可能在特定组织集中地引入该基因。
更进一步，使用本发明的核酸转运体全身给药，有可能在特定组织长期持续表达该基因，最适化持续时间。
权利要求
1. 核酸转运体，含有二氨基丁酸和/或其可药用盐构成的多肽。
2. 核酸转运体，含有二氨基丁酸和/或其可药用盐构成的多肽与聚乙二醇的嵌段共聚物。
3. 根据权利要求1或2记载的核酸转运体，其特征在于上述多肽为残基数20以上、280以下的二氨基丁酸和/或其可药用盐构成。
4. 基因治疗用药学组合物，含有权利要求1或2记载的核酸转运体和治疗基因。
5. 根据权利要求4记载的基因治疗用药学组合物，其特征在于上述治疗基因为核酸和/或寡聚核苷酸衍生物。
6. 基因治疗用药学组合物，含有权利要求3记载的核酸转运体和治疗基因。
7. 根据权利要求6记载的基因治疗用药学组合物，其特征在于上述治疗基因为核酸和/或寡聚核苷酸衍生物。
全文摘要
本发明公开了新型核酸转运体和基因治疗用药学组合物。本发明的核酸转运体的特征在于含有适当残基数的二氨基丁酸和/或其可药用盐构成的多肽。本发明的核酸转运体,和各种治疗基因形成安全且免疫原性极低的复合物(本发明的基因治疗用药学组合物),应用各种方法可将上述基因高效、安全地引入细胞,在该细胞内高表达上述基因。
文档编号C12N15/87GK1326365SQ99813456
公开日2001年12月12日 申请日期1999年11月17日 优先权日1998年11月18日
发明者后藤武, 米村圭史, 桑原哲治, 大屋正尚, 秋山胜彦 申请人:久光制药株式会社