用于wt1特异性免疫治疗的组合物和方法

专利名称：用于wt1特异性免疫治疗的组合物和方法
技术领域：
本发明一般涉及诸如白血病和癌症等恶性疾病的免疫治疗。本发明更具体的涉及用于产生或增强针对WT1的免疫应答的组合物，和这种组合物在预防和/或治疗恶性疾病中的使用。
背景技术：
癌症和白血病是美国乃至全世界的重要健康问题。尽管在这些疾病的检测和治疗中取得了一些进展，但是目前仍然没有获得用于预防或治疗癌症和白血病的疫苗或其它普遍有效的方法。这些疾病的治疗目前仍依赖早期诊断和攻击性治疗(包括诸如外科手术、放疗、化疗和激素治疗等多种疗法中的一种或多种)的组合。特定癌症的疗程通常根据多种预后参数(包括特异肿瘤标记的分析)进行选择。然而，使用已建立的标记通常产生难以解释的结果，而且在许多癌症患者中持续观察到高死亡率。
免疫疗法具有在本质上改进癌症和白血病治疗和存活的潜力。最近的资料表明，白血病可以通过免疫疗法中的骨髓移植(如输注捐献者的淋巴细胞)治愈。这种疗法可能涉及产生或增强针对肿瘤相关抗原(TAA)的免疫应答。然而，迄今，已知的TAA相对较少，而且针对这种抗原产生的免疫应答并未显示对治疗有益(除了个别例外)。
相应的，本领域中需要用于预防和治疗白血病和癌症的改进方法。本发明满足了这些要求，并进一步提供其它相关优势。
发明概述简而言之，本发明提供了用于诊断和治疗诸如白血病和癌症等疾病的组合物和方法。一方面，本发明提供了包含天然WT1的免疫原性部分的多肽，或其因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体。在某些实施方案中，多肽所含的天然WT1多肽的连续氨基酸残基不超过16个。在其它实施方案中，多肽包含天然WT1多肽的第1-174位氨基酸残基的免疫原性部分或其变体，其中多肽包含天然WT1多肽中第175-449位氨基酸中存在的不超过16个连续氨基酸残基。免疫原性部分优选可与MHC I类和/或II类分子结合。在某些实施方案中，多肽包含选自下组的序列(a)表2-46中一项或多项记录的序列；(b)上述序列因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体；和(c)上述多肽的模拟物，该模拟物与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小。
在其它实施方案中，多肽包含选自下组的序列(a)ALLPAVPSL(SEQ ID NO34)、GATLKGVAA(SEQ ID NO88)、CMTWNQMNL(SEQ IDNO49和258)、SCLESQPTI(SEQ ID NO199和296)、SCLESQPAI(SEQID NO198)、NLYQMTSQL(SEQ ID NO147和284)、ALLPAVSSL(SEQID NO35和255)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO185和293)；(b)上述序列因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体；和(c)上述多肽的模拟物，该模拟物与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小。模拟物可以包含与一种或多种氨基酸模拟物相组合的氨基酸，或者可以是完全非肽的模拟物。
在其它方面，本发明提供了包含WT1蛋白免疫原性部分的变体的多肽，其中变体因免疫原性部分中1-3个氨基酸位置的取代而与免疫原性部分不同、以至于变体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力相对于天然WT1蛋白增强了。
本发明还提供了编码上述WT1多肽的WT1多核苷酸。
在其它方面，本发明提供了药物组合物和疫苗。药物组合物可以包含上述多肽或模拟物，和/或与制药学可接受的载体或赋形剂相结合的下列一项或多项(a)WT1多核苷酸；(b)可特异结合WT1多肽的抗体或其抗原结合片段；(c)可与WT1多肽特异反应的T细胞；或(d)表达WT1多肽的抗原呈递细胞。疫苗包含上述多肽和/或下列一项或多项(a)WT1多核苷酸；(b)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；或(c)抗独特型抗体，和非特异免疫应答增强剂。在某些实施方案中，这种药物组合物和疫苗中采用的WT1多肽包含天然WT1多肽中少于23个，优选少于17个连续氨基。免疫应答增强剂可以是佐剂。优选的，免疫应答增强剂可增强T细胞应答。
本发明还提供了用于增强或诱导患者体内免疫应答的方法，包括对患者施用上述药物组合物或疫苗。在某些实施方案中，患者是人。
本发明还提供了抑制患者体内恶性疾病发展的方法，包括对患者施用上述药物组合物或疫苗。恶性疾病包括(但不限于)白血病(如急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病或慢性髓性白血病)和癌症(如乳腺、肺、甲状腺、或胃肠癌或者黑色素瘤)。患者可能(但不一定)患有恶性疾病，而且施用所述药物组合物或疫苗可以抑制这种疾病的发作，或者可以抑制现有疾病的发展和/或转移。
在其它方面，本发明还提供了用于由骨髓和/或外周血或其部分除去表达WT1的细胞的方法，包括将骨髓、外周血、或者骨髓或外周血级分与能和WT1多肽发生特异反应的T细胞进行接触，其中接触进行的条件和时间足以将骨髓、外周血、或其级分的髓样或淋巴细胞中的WT1阳性细胞降至10％以下，优选5％以下，更优选1％以下。骨髓、外周血、和其级分可以由患有与WT1表达有关的疾病的患者获得，或者可以由未患有这种疾病的人或非人哺乳动物获得。
在相关方面，本发明提供了用于抑制患者体内恶性疾病发展的方法，包括对患者施用如上制备的骨髓、外周血、或者骨髓或外周血级分。这种骨髓、外周血、或级分可以是自体的，或者可以由相关或无关的人或非人动物(如同源的或异源的)获得。
在其它方面，本发明提供了用于刺激(或引发)和/或扩增T细胞的方法，包括将T细胞与WT1多肽进行接触，接触进行的条件和时间足以刺激和/或扩增T细胞。这种T细胞可以是自体的、异源的、同源的或无关的WT1特异性T细胞，而且可以在体外或体内进行刺激。在某些实施方案中，经扩增的T细胞可以存在于骨髓、外周血、或者骨髓或外周血级分中，而且可以(但不必)是无性系的。在某些实施方案中，在刺激和/或扩增过程中T细胞可以存在于哺乳动物中。WT1特异性T细胞可以用于例如捐献者淋巴细胞输注。
在相关方面，提供了用于抑制患者体内恶性疾病发展的方法，包括对患者施用如上制备的T细胞。在某些实施方案中，这种T细胞可以是自体的、同源的、或异源的。
在其它方面，本发明还提供了用于监控患者体内用于WT1表达相关恶性疾病的免疫或治疗的功效的方法。这种方法基于监控患者体内的抗体、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞应答。在某些方面，这种方法可以包括下列步骤(a)将第一份生物学样品与下列一项或多项一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，其中第一份生物学样品由治疗或免疫前的患者获得，且温育进行的条件和时间足以形成免疫复合物；(b)检测WT1多肽和生物学样品中可特异结合WT1多肽的抗体之间形成的免疫复合物；(c)使用由治疗或免疫后的同一患者获得的第二份生物学样品，重复步骤(a)和(b)；并(d)比较在第一份和第二份生物学样品中检测到的免疫复合物的量，并由此监控患者体内这种治疗或免疫的功效。
在上述方法的某些实施方案中，检测步骤包括(a)将免疫复合物与能够结合该免疫复合物的检测试剂一起进行温育，其中检测试剂包含报道基团；(b)除去未结合的检测试剂；并(c)检测报道基团的存在与否。检测试剂可以包括例如能够与可特异结合WT1多肽的抗体结合的二抗或其抗原结合片段，或者诸如蛋白A之类分子。在某些实施方案中，报道基团结合在WT1多肽上，且检测步骤包括除去未结合的WT1多肽并随后检测报道基团的存在与否。
在其它方面，用于监控患者体内用于与WT1表达有关的恶性疾病的免疫或治疗的功效的方法，包括下列步骤(a)将第一份生物学样品与下列一项或多项一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，其中第一份生物学样品包含CD4+和/或CD8+T细胞，且由治疗或免疫前的患者获得，而且温育进行的条件和时间足以使得T细胞特异激活、增殖和/或裂解；(b)检测激活、增殖和/或裂解的T细胞的量；(c)使用包含CD4+和/或CD8+T细胞、由治疗或免疫后的同一患者获得的第二份生物学样品，重复步骤(a)和(b)；并(d)比较第一份和第二份生物学样品中T细胞激活、增殖和/或裂解的量，并由此监控患者体内该治疗或免疫的功效。
本发明还提供了用于抑制患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法，包括下列步骤(a)将由患者分离得到的CD4+和/或CD8+T细胞与下列一项或多项一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，以使T细胞增殖；并(b)对患者施用有效量的该增殖T细胞，由此抑制患者体内恶性疾病的发展。在某些实施方案中，T细胞温育步骤可以重复一次或多次。
在其它方面，本发明提供了用于抑制患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法，包括下列步骤(a)将由患者分离得到的CD4+和/或CD8+T细胞与下列一项或多项一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，以使T细胞增殖；(b)克隆一个或多个增殖细胞；并(c)对患者施用有效量的该克隆T细胞。
在其它方面，提供了用于测定患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的存在与否的方法，包括下列步骤(a)将由患者分离得到的CD4+和/或CD8+T细胞与下列一项或多项一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；并(b)检测T细胞特异激活的存在与否，由此测定与WT1表达有关的恶性疾病的存在与否。在某些实施方案中，检测步骤包括检测T细胞增殖的存在与否。
在其它方面，本发明提供了用于测定患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的存在与否的方法，包括下列步骤(a)将由患者获得的生物学样品与下列一项或多项一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞，其中温育进行的时间和条件足以形成免疫复合物；并(b)检测WT1多肽和生物学样品中可特异结合WT1多肽的抗体之间形成的免疫复合物；并由此测定与WT1表达有关的恶性疾病的存在与否。
参照下面的详述和附图，本发明的这些和其它方面是显而易见的。此处公开的所有文献是作为独立每篇全文收入作为参考文献的。
附图的简要描述

图1描述了小鼠(MO)和人(HU)WT1蛋白质序列(依次是SEQ IDNO320和319)的比较。
图2是图解血液学恶性肿瘤(AML)患者体内WT1特异抗体检测的Western印渍。1道显示分子量标记；2道显示阳性对照(与WT1特异抗体一起免疫沉淀的WT1阳性人白血病细胞系)；3道显示阴性对照(与小鼠血清一起免疫沉淀的WT1阳性细胞系)；而4道显示与AML患者血清一起免疫沉淀的WT1阳性细胞系。对于2-4道，将免疫沉淀物通过凝胶电泳进行分离，并用WT1特异抗体进行探查。
图3是图解用TRAMP-C(一种WT1阳性肿瘤细胞系)免疫的B6小鼠体内WT1特异抗体应答检测的Western印渍。1、3和5道显示分子量标记，而2、4和6道显示WT1特异阳性对照(N180，Santa CruzBiotechnology，跨越WT1蛋白质N末端区域180个氨基酸的多肽，在Western印渍上迁移到52kD)。所用一抗是2道中的WT180、4道中的未免疫B6小鼠血清、和6道中的经免疫B6小鼠血清。
图4图解用代表性WT1肽免疫的小鼠体内WT1特异抗体检测的Western印渍。1、3和5道显示分子量标记物，而2、4和6道显示WT1特异阳性对照(N180，Santa Cruz Biotechnology，跨越WT1蛋白质N末端区域180个氨基酸的多肽，在Western印渍上迁移到52kD)。所用一抗是2道中的WT180、4道中的未免疫B6小鼠血清、和6道中的经免疫B6小鼠血清。
图5A至5C是图解用代表性WT1肽免疫的小鼠体内增殖性T细胞应答的刺激的图。如所示，使用一种T细胞系和两种不同克隆进行胸苷掺入分析，结果以cpm表述。x轴指示的对照是不含抗原(无Ag)和B6/培养基；所用抗原是p6-22人(p1)、p117-139(p2)或p244-262人(p3)。
图6A和6B是图解用代表性WT1肽免疫的小鼠体内增殖性T细胞应答的刺激的柱状图。第三次免疫三周后，将用疫苗A或疫苗B接种的小鼠的脾细胞仅与培养基(培养基)、或与脾细胞和培养基(B6/无抗原)、用肽p6-22(p6)、p117-139(p117)、p244-262(p244)(疫苗A；图6A)或p287-301(p287)、p299-313(p299)、p421-435(p421)(疫苗B；图6B)脉冲的B6脾细胞、和用无关对照肽(无关肽)25μg/ml脉冲的脾细胞一起进行培养，并在96小时后通过(3H)胸苷掺入测定增殖。条柱代表刺激指数(SI)，以实验孔平均值除以对照平均值(无抗原的B6脾细胞)计算。
图7A至7D是图解p117-139和p6-22特异的增殖性T细胞系和克隆的产生的柱状图。体内免疫后，分别使用疫苗A或B的所有三种肽进行最初的三次体外刺激(IVS)。只使用两种相关肽p117-139和p6-22如单一肽刺激一样进行随后的IVS。如所示，由p6-22和p117-139特异性T细胞系得到克隆。将T细胞仅与培养基(培养基)、或与脾细胞和培养基(B6/无抗原)、用肽p6-22(p6)、p117-139(p117)、或无关对照肽(无关肽)25μg/ml脉冲的B6脾细胞一起进行培养，并在96小时后通过(3H)胸苷掺入测定增殖。条柱代表刺激指数(SI)，以实验孔平均值除以对照平均值(无抗原的B6脾细胞)计算。
图8A和8B展示了关于具有诱导Th应答潜力的肽的人WT1(SEQ IDNO319)TSITES分析的结果。“A”指示的区域是模块的AMPHI中点，“R”指示匹配Rothbard/Tay1or基元的残基，“D”指示匹配IAd基元的残基，而“d”指示匹配IEd基元的残基。
图9A和9B是图解用WT1肽免疫的小鼠体内WT1肽特异性CTL的诱导的图。图9A图解了异源细胞系对靶细胞的裂解，而图9B显示了肽包被细胞系的裂解。在每种情况中，在三个所示效应物靶比率显示裂解百分比(通过标准铬释放实验测定)。提供了淋巴瘤细胞(LSTRA和E10)以及E10＋p235－243(E10＋P235)的结果。E10细胞此处还称为EL-4细胞。
图10A至10D是图解用WT1肽P117免疫B6小鼠后，能够杀死WT1阳性肿瘤细胞系但不杀死WT1阴性细胞系的WT1特异性CTL的诱导的图。图10A图解了未免疫B6小鼠的T细胞不杀死WT1阳性肿瘤细胞系。图10B图解了异源细胞系对靶细胞的裂解。图10C和10D证明了在两个不同的实验中，与WT1阴性细胞系相比，WT1阳性肿瘤细胞系的裂解。此外，图10C和10D显示了肽包被细胞系(相关WT1肽P117包被的WT1阴性细胞系E10)的裂解。在每种情况中，在三个所示效应物靶比率显示裂解百分比(通过标准铬释放实验测定)。提供了淋巴瘤细胞(E10)、前列腺癌细胞(TRAMP-C)、转化的成纤维细胞系(BLK-SV40)、以及E10＋p117的结果。
图11A和11B是图解代表性肽P117-139特异性CTL裂解WT1阳性肿瘤细胞的能力的柱状图。第三次免疫三周后，将用肽p235-243或p117-139接种的小鼠的脾细胞在体外用相关肽进行刺激，并测试裂解与WT1肽一起温育的靶以及WT1阳性和阴性肿瘤细胞的能力。条柱代表在E∶T比率25∶1进行了三次的铬释放实验中平均特异裂解百分比。如所示，图11A显示了p235-243特异性T细胞系针对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)；用相关(用于免疫以及再刺激)肽p235-243脉冲的EL-4(EL-4＋p235)；用无关肽p117-139(EL-4＋p117)、p126-134(EL-4＋p126)或p130-138(EL-4＋p130)脉冲的EL-4；WT1阳性肿瘤细胞BLK-SV40(BLK-SV40，WT1阳性)；和TRAMP-C(TRAMP-C，WT1阳性)的细胞毒活性。如所示，图11B显示了p117-139特异性T细胞系针对EL-4；用相关肽p117-139脉冲的EL-4(EL-4＋p117)；以及用无关肽p123-131(EL-4＋p123)或p128-136(EL-4＋p128)脉冲的EL-4；BLK-SV40；和TRAMP-C的细胞毒活性。
图12A和12B是图解WT1阳性肿瘤细胞裂解特异性的柱状图(如冷靶抑制证明的)。条柱代表在E∶T比率25∶1进行了三次的铬释放实验中的平均特异裂解百分比。如所示，图12A显示了p117-139特异性T细胞系针对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)；WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C(TRAMP-C，WT1阳性)；与10倍过量(与热靶相比)的用未进行51Cr标记的相关肽p117-139(TRAMP-C＋p117冷靶)脉冲过的EL-4一起温育的TRAMP-C细胞；和与用未进行51Cr标记的无关肽脉冲过的EL-4一起温育的TRAMP-C细胞(TRAMP-C＋无关冷靶)的细胞毒活性。如所示，图12B显示了p117-139特异性T细胞系针对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)；WT1阳性肿瘤细胞系BLK-SV40(BLK-SV40，WT1阳性)；与相关冷靶一起温育的BLK-SV40细胞(BLK-SV40＋p117冷靶)；和与无关冷靶一起温育的BLK-SV40细胞(BLK-SV40＋无关冷靶)的细胞毒活性。
图13A至13C是描述p117-139中九聚CTL表位的评价的柱状图。针对包含或缺乏恰当H-2bI6类结合基元的aa117-139内的肽，测试了p117-139肿瘤特异性CTL系，并随后用p126-134或p130-138再刺激。条柱代表在E∶T比率25∶1进行了三次的铬释放实验中的平均特异裂解百分比。图13A显示了p117-139特异性T细胞系针对WT1阴性细胞系EL-4(EL-4，WT1阴性)；和用肽p117-139(EL-4＋p117)、p119-127(EL-4＋p119)、p120-128(EL-4＋p120)、p123-131(EL-4＋p123)、p126-134(EL-4＋p126)、p128-136(EL-4＋p128)、和p130-138(EL-4＋p130)脉冲的EL-4细胞的细胞毒活性。图13B显示了用p126-134再刺激后，CTL细胞系针对WT1阴性细胞系EL-4；用p117-139(EL-4＋p117)、p126-134(EL-4＋p126)脉冲的EL-4细胞；和WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C的细胞毒活性。图13C显示了用p130-138再刺激后，CTL系针对EL-4；用p117-139(EL-4＋p117)、p130-138(EL-4＋p130)脉冲的EL-4细胞；和WT1阳性肿瘤细胞系TRAMP-C的细胞毒活性。
发明详述如上所述，本发明一般性涉及用于恶性疾病的免疫治疗和诊断的组合物和方法。此处描述的组合物可包括WT1多肽、WT1多核苷酸、表达WT1多肽的抗原呈递细胞(APC，如树突状细胞)、诸如能够结合WT1多肽的抗体等试剂、和/或WT1特异的免疫系统细胞(如T细胞)。本发明的WT1多肽一般包含至少部分Wilms肿瘤基因产物或其变体。本发明的核酸序列一般包含编码完整或部分这种多肽的DNA或RNA序列或其互补序列。抗体一般是能够与WT1多肽部分结合的免疫系统蛋白质或其抗原结合片段。在这种组合物中可以采用的T细胞一般是WT1多肽特异的T细胞(如CD4+和/或CD8+)。此处描述的某些方法还采用了表达此处提供的WT1多肽的抗原呈递细胞。
本发明是建立在下列发现的基础之上的针对Wilms肿瘤(WT)基因产物(如WT1)引起的免疫应答可以为患有特征为WT1基因表达增加的恶性疾病患者提供预防性和/或治疗性益处。这些疾病包括(但不限于)白血病(如急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、和儿童ALL)，以及诸如肺、乳腺、甲状腺和胃肠癌和黑色素瘤等许多癌症。WT1基因最初是根据Wilms肿瘤患者染色体11p13上的细胞遗传缺失鉴定出和分离到的(见Call等人，美国专利号5,350,840)。该基因包括10个外显子，并编码锌指转录因子，图1以及SEQ ID NO319和320提供了小鼠和人WT1蛋白质的序列。WT1多肽如上所述，在本发明的内容中，WT1多肽是至少包含天然WT1(即未遗传修饰的有机体表达的WT1蛋白质)的免疫原性部分或其变体的多肽。倘若WT1多肽至少包含天然WT1蛋白的免疫原性部分或其变体，则它可以是任何长度的。换言之，WT1多肽可以是寡肽(即由相对较小数目的氨基酸残基(诸如8-10个残基)组成，由肽键连接)、全长WT1蛋白质(如存在于人或非人动物(诸如小鼠)中)、或中间大小的多肽。在某些实施方案中，优选使用包含天然WT1多肽的小数目连续氨基酸残基的WT1多肽。在需要产生T细胞应答的某些用途中优选这种多肽。例如，这种WT1多肽可以包含天然WT1多肽中少于23个，优选不超过18个，更优选不超过15个连续氨基酸残基。包含天然WT1多肽的9个连续氨基酸残基的多肽一般适合于这种目的。由天然蛋白质衍生的其它序列和/或异源序列可以存在于任何WT1多肽中，而且这种序列可以(但不必)具备其它免疫原性或抗原性。此处提供的多肽还可以与其它多肽或非多肽化合物相连(共价或非共价)。
此处使用的“免疫原性部分”是多肽中由B细胞和/或T细胞表面抗原受体识别(即特异结合)的一部分。某些优选的免疫原性部分可结合MHC I类或II类分子。如此处所用，如果这种结合是使用本领域已知任何实验可检测的，那么就说免疫原性部分可与MHC I类或II类分子“结合”。例如，多肽结合MHC I类的能力可以通过监控其促进将125I标记的β2-微球蛋白(β2m)掺入MHC I类/β2m/肽异源三聚复合物的能力间接评价(见Parker等人，免疫学杂志(J.Immunol.)152163，1994)。或者，可以采用本领域已知的功能肽竞争实验。某些免疫原性部分具有表2至14中一个或多个记录的一种或多种序列。代表性免疫原性部分包括(但不限于)RDLNALLPAVPSLGGGG(人WT1第6-22位残基；SEQ ID NO1)、PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE(人和小鼠WT1第117-139位残基；依次为SEQ ID NO2和3)、GATLKGVAAGSSSSVKWTE(人WT1第244-262位残基；SEQ ID NO4)、GATLKGVAA(人WT1第244-252位残基；SEQ ID NO88)、CMTWNQMNL(人和小鼠WT1第235-243位残基；依次为SEQ ID NO49和258)、SCLESQPTI(小鼠WT1第136-144位残基；SEQ ID NO296)、SCLESQPAI(人WT1第136-144位残基；SEQ ID NO198)、NLYQMTSQL(人和小鼠WT1第225-233位残基；依次为SEQ ID NO147和284)、ALLPAVSSL(小鼠WT1第10-18位残基；SEQ ID NO255)、或RMFPNAPYL(人和小鼠WT1第126-134位残基；依次为SEQ ID NO185和293)。此处提供了其它免疫原性部分，而且一般可以使用诸如Paul(基础免疫学(Fundamental Immunology)，第3版，第243-247页，Raven出版社，1993)和其中引用的文献中总结的那些方法等众所周知的技术鉴定其它免疫原性部分。用于鉴定免疫原性部分的代表性技术包括筛选多肽与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力。天然WT1多肽的免疫原性部分是与这种抗血清和/或T细胞的反应水平不显著低于全长WT1的反应性(如在ELISA和/或T细胞反应性实验中)的部分。换言之，免疫原性部分在这种实验中的反应水平可以与全长多肽的反应性相似或更高。这种筛选一般可以使用本领域普通技术人员众所周知的方法进行，诸如Harlow和Lane描述的那些方法(抗体实验室手册(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港实验室，1988)。
或者，可以使用诸如Tsites程序(参阅Rothbard和Taylor，欧洲分子生物学杂志(EMBO J)793-100，1988；Deavin等人，分子免疫学(Mol.Immunol.)33145-155，1996)等检索具有引发Th应答能力的肽基元的计算机分析，鉴定免疫原性部分。可以根据BIMAS(Parker等人，免疫学杂志(J.Immunol.)152163，1994)和其它HLA肽结合预测分析，鉴定包含适于结合鼠和人I型或II型MHC的基元的CTL肽。为了确认免疫原性，可以使用HLA A2转基因小鼠模型和/或使用树突状细胞、成纤维细胞、或外周血细胞的体外刺激实验，测试肽。
如上所述，组合物可以包含天然WT1蛋白的变体。如此处所用，多肽“变体”指与天然多肽因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同，但是保留了天然多肽的免疫原性的多肽(即相对于天然多肽，变体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力基本上没有降低)。换言之，相对于天然多肽，变体与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力，可能增强或不变，或者可以降低少于50％，优选少于20％。这些变体通常可以通过修饰上述多肽序列之一并评价经修饰多肽与此处所述抗血清和/或T细胞的反应性而进行鉴定。已经发现，在本发明的内容中，WT1多肽免疫原性部分内的相对小数目的取代(如1-3个)可能增强多肽引发免疫应答的能力。合适的取代通常可以使用上述计算机程序进行鉴定，而且效果通常可以根据经修饰多肽与上述抗血清和/或T细胞的反应性进行确认。相应的，在某些优选实施方案中，WT1多肽包含免疫原性部分内1-3个氨基酸残基被取代、使得与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆的反应能力在统计学上高于未修饰多肽的变体。这些取代优选位于多肽的MHC结合位点内，并可以如上所述进行鉴定。优选的取代使得与MHC I型或II型分子的结合增强。
某些变体包含保守取代。“保守取代”指一种氨基酸被另一种具有相似特性的氨基酸取代，而且肽化学领域技术人员可以预测多肽的二级结构和亲水特性基本上不变。氨基酸取代通常可以根据残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性本质的相似性进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有不带电荷的极性头基团、具有相似亲水性值的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。代表保守改变的其它组氨基酸包括(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。变体还(或者)可以含有非保守改变。变体还(或者)可以通过例如缺失或加入对多肽的免疫原性、二级结构和亲水特性影响最小的氨基酸进行修饰。
如上所述，WT1多肽可以与位于蛋白质N-末端、在翻译时或翻译后引导蛋白质转移的信号(或前导)序列缀合。多肽还(或者)可以与接头或其它序列缀合，以便于多肽的合成、纯化或鉴定(如多聚组氨酸)，或增强多肽与固体支持物的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区缀合。
WT1多肽可以使用多种众所周知的技术进行制备。由上述WT1多核苷酸可以容易的制备多核苷酸编码的重组多肽。通常，可以采用本领域普通技术人员已知的多种表达载体来表达重组WT1多肽。可以在任何适当的、用含编码重组多肽的DNA分子的表达载体转化或转染了的宿主细胞中进行表达。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母和高等真核细胞。优选采用的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系(诸如COS或CHO)。可以首先使用购买的滤器将来自合适的宿主/载体系统(将重组蛋白质或多肽分泌到培养基中)的上清液进行浓缩。然后，可以将浓缩液应用于合适的纯化基质(诸如亲和基质或离子交换树脂)。最后，可以进行一轮或多轮反相HPLC以进一步纯化重组多肽。这些技术可以用于制备天然多肽或其变体。例如，通常可以使用诸如寡核苷酸介导的定点诱变等标准诱变技术制备编码天然多肽变体的多核苷酸，并且可以除去部分DNA序列以制备截短的多肽。
还可以使用本领域普通技术人员众所周知的技术通过合成方法产生某些部分或其它变体。例如，可以合成少于大约500个氨基酸，优选少于大约100个氨基酸，更优选少于大约50个氨基酸的多肽。可以使用任何购买的固相技术合成多肽，诸如Merrifield固相合成方法，其中氨基酸被依次加到正在延伸的氨基酸链上。参阅Merrifield，美国化学学会会刊(J.Am.Chem.Soc.)852149-2146，1963。用于多肽自动合成的设备可以从供应商处购买，诸如Applied BioSystems公司(Foster City，CA)，而且可以根据制造商的说明书进行操作。
通常，此处所述的多肽和多核苷酸是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸指与其最初的环境是分开的。例如，如果将天然产生的蛋白质与在天然系统中共存的一些或所有物质分开，那么该蛋白质就是分离的。优选的，这些多肽是至少大约90％纯，更优选至少大约95％纯，最优选至少大约99％纯。例如，如果将多核苷酸克隆到并非天然环境一部分的载体中，那么可以认为该多核苷酸是分离的。
本发明在其它方面提供了WT1多肽的模拟物。这些模拟物可以包含与一种或多种氨基酸模拟物相结合的氨基酸(即WT1蛋白质中的一个或多个氨基酸可以用氨基酸模拟物取代)，或者可以是完全非肽的模拟物。氨基酸模拟物是与氨基酸构象相似的化合物，所以它可以取代WT1多肽中的氨基酸而基本上不降低与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆的反应能力。非肽模拟物是不含氨基酸、但是具有与WT1多肽相似的总体构象的化合物，从而相对于WT1多肽，模拟物与WT1特异的抗血清和/或T细胞系或克隆的反应能力基本上没有降低。这些模拟物可以根据评价肽序列三维结构的标准技术(如核磁共振和计算机技术)进行设计。在设计的模拟物中，WT1多肽的一个或多个侧链官能团被不必具有相同大小或体积的基团取代，但是取代基必须具有相似的化学和/或物理特性，以产生相似的生物学应答。应当理解，在此处所述实施方案中，模拟物可以取代WT1多肽。WT1多核苷酸编码此处所述WT1多肽的任何多核苷酸称为本发明包括的WT1多核苷酸。这些多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或双链，而且可以是(基因组的、cDNA或合成的)DNA或RNA分子。本发明的多核苷酸可以(但不必)含有其它编码或非编码序列，而且多核苷酸可以(但不必)与其它分子和/或支持物相连。
WT1多核苷酸可以编码天然WT1蛋白质，或者可以编码此处所述WT1的变体。多核苷酸变体可以含有一个或多个取代、加入、缺失和/或插入，但是相对于天然WT1蛋白质，编码的多肽的免疫原性并没有降低。对编码的多肽的免疫原性的影响通常可以如此处所述进行评价。优选变体所含的核苷酸取代、加入、缺失和/或插入，不超过编码天然WT1序列免疫原性部分的核苷酸位置的20％，优选不超过10％。某些变体基本上与天然基因或其部分同源。这些多核苷酸变体能够与天然产生的、编码WT1多肽的DNA序列(或其互补序列)在中等严谨条件下杂交。合适的中等严谨条件包括在溶液5x SSC/0.5％ SDS/1.0mMEDTA pH8.0中预清洗；于50-65℃在5x SSC中杂交过夜；随后于65℃用含0.1％ SDS的2x、0.5x、和0.2x SSC各清洗2次，每次20分钟。这种杂交DNA序列也属于本发明的范围之内。
本领域普通技术人员将会理解，由于遗传密码的简并性，有许多种核苷酸序列编码WT1多肽。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。虽然如此，本发明明确包括由于密码子使用率的差异而变化的多核苷酸。
一旦如上所述鉴定了WT1的免疫原性部分，可以使用多种技术制备WT1多核苷酸。例如，可以由从表达WT1的细胞制备的cDNA扩增得到WT1多核苷酸。这些多核苷酸可以通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。为了此研究，可以根据免疫原性部分的序列设计序列特异的引物，而且可以购买或合成。例如，用于PCR扩增人WT1基因的合适引物包括第一步-P1181434-14145’GAG AGT CAG ACT TGA AAGCAGT 3’(SEQ ID NO5)和P1355’CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC 3’(SEQ ID NO6)；第二步-P1365’GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACGTGC GGG 3’(SEQ ID NO7)和P1375’GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCCCCG A 3’(SEQ ID NO8)。用于PCR扩增小鼠WT1基因的引物包括第一步-P1385’TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3’(SEQ ID NO9)和P1395’GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3’(SEQ ID NO10)；第二步-P1405’GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3’(SEQ ID NO11)和P1415’GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3’(SEQID NO12)。
然后使用众所周知的技术，可以将扩增得到的部分用于从人基因组DNA文库或合适的cDNA文库分离全长基因。或者，可以由多种PCR片段构建全长基因。还可以通过合成寡核苷酸成分、并将各成分连接在一起产生完整多核苷酸，从而制备WT1多核苷酸。
WT1多核苷酸还可以通过本领域已知的任何方法合成，包括化学合成，例如固相亚磷酰胺化学合成法。还可以使用常规诱变技术，诸如寡核苷酸介导的位点特异的诱变(见Adelman等人，DNA 2183，1983)，在多核苷酸序列中引入修饰。或者，倘若编码WT1多肽的DNA已经掺入到含有合适的RNA聚合酶启动子(诸如T7或SP6)的载体中，则可以通过DNA序列的体外或体内转录产生RNA分子。如此处所述，某些部分可以用于制备编码的多肽。另外/或者，可以对病人施用部分多核苷酸，使得在体内产生编码的多肽(如通过用编码WT1多肽的cDNA构建物转染抗原呈递细胞(诸如树突状细胞)，并对病人施用转染细胞)。
编码WT1多肽的多核苷酸通常可以用于在体外或体内产生多肽。与编码序列互补的WT1多核苷酸(即反义多核苷酸)还可以作为探针使用，或用于抑制WT1的表达。也可以将可以转录成反义RNA的cDNA构建物导入组织细胞中，以有助于产生反义RNA。
任何多核苷酸可以进行进一步的修饰以增加体内稳定性。可能的修饰包括(但不限于)在5’和/或3’末端加入侧翼序列；在主链中使用磷酸硫酯或2’氧-甲基而非磷酸二酯键；和/或包含非常见碱基，诸如次黄核苷、queosine和wybutosine，以及腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰基-、甲基-、硫代-和其它修饰形式。
此处所述核苷酸序列可以使用已建立的重组DNA技术与多种其它核苷酸序列进行连接。例如，可以将多核苷酸克隆到多种克隆载体中，包括质粒、噬菌粒、λ噬菌体衍生物和粘粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。通常，载体包含在至少一种有机体中有功能的复制起点、方便的限制性内切酶位点、和一种或多种选择标记。其它元件取决于设计用途，且对本领域普通技术人员是明显的。
在某些实施方案中，可以将多核苷酸配成制剂，使得能够进入哺乳动物细胞并在其中表达。如下文所述，这些制剂对于治疗性目的特别有用。本领域普通技术人员可以理解，有许多方法可以实现多核苷酸在靶细胞中的表达，而且可以采用任何合适的方法。例如，可以将多核苷酸掺入病毒载体，诸如(但不限于)腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、或者牛痘或其它痘病毒(如鸟类痘病毒)。用于将DNA掺入这些载体的技术对于本领域普通技术人员是众所周知的。逆转录病毒载体还可以转移或掺入一个作为选择标记的基因(以帮助鉴定或选择经转导的细胞)和/或靶向部分(诸如编码特异靶细胞上受体的配基的基因，使得载体具有目标特异性)。靶向作用还可以使用抗体通过本领域普通技术人员已知的方法来实现。这种载体中的cDNA构建物可以用于例如转染人或动物细胞系，以建立WT1阳性肿瘤模型，进行肿瘤保护和过继免疫治疗实验，从而证明肿瘤或白血病生长抑制或这些细胞的裂解。
多核苷酸的其它治疗性制剂包括胶状分散系统，诸如大分子复合物、微囊、微球体、珠、和基于脂类的系统(包括水包油乳状液、微胶粒、混和微胶粒、和脂质体)。作为体外和体内投递载体使用的优选胶状系统是脂质体(即人工膜泡)。这些系统的制备和使用在本领域中是众所周知的。抗体及其片段本发明还提供了结合剂，诸如可与WT1多肽特异结合的抗体及其抗原结合片段。如此处使用的，如果试剂以可检测的水平(在例如ELISA中)与WT1多肽发生反应，而与无关蛋白质在相似条件下不发生可检测反应，则称其与WT1多肽可“特异结合”。如此处使用的，“结合”指两个分开的分子之间的非共价联系，以至于形成“复合物”。结合能力可以通过例如测定复合物形成的结合常数进行评价。结合常数是将复合物浓度除以各成分浓度的乘积得到的数值。通常，当复合物形成的结合常数超过大约103L/mol时，称此两种成分是“结合”的。结合常数可以使用本领域众所周知的方法进行测定。
满足上述要求的任何试剂可以作为结合剂。在优选的实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段。某些抗体可以由例如Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz CA)购买得到。或者，可以本领域普通技术人员知道的多种技术制备抗体。参阅如Harlow和Lane，抗体实验室手册(AntibodiesA Laboratory Manual)，冷泉港实验室，1988。通常，可以通过细胞培养技术产生抗体，包括上述单克隆抗体的产生，或者用抗体基因转染合适的细菌或哺乳动物细胞宿主，从而产生重组抗体。在一种技术中，首先将包含多肽的免疫原注射到多种哺乳动物(如小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊)的任一种中。在此步骤，本发明的多肽可以作为不经修饰的免疫原。或者，特别是对于相对较短的多肽，如果将多肽与载体蛋白(诸如牛血清清蛋白或匙孔血蓝蛋白)进行连接，可以引起较好的免疫应答。优选根据预先排定的时间表，将免疫原注射到动物宿主中，并包括一次或多次加强免疫，并对动物定期取血。然后可以使用例如与合适固体支持物偶联的多肽的亲和层析，由该血清纯化多肽特异的多克隆抗体。
可以使用例如Kohler和Milstein，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)6511-519，1976的技术及其改进，制备感兴趣抗原多肽特异的单克隆抗体。简而言之，这些方法涉及制备能够产生具有期望特异性(即与感兴趣的多肽的反应性)的抗体的永生细胞系。这些细胞系可以由例如从上述免疫动物得到的脾细胞产生。然后通过例如与骨髓瘤细胞融合对象(优选与免疫动物同源)进行融合，对脾细胞进行永生化。可以采用多种融合技术。例如，可以将非离子去污剂与脾细胞和骨髓瘤细胞混合几分钟，然后以低密度在支持杂合细胞而非骨髓瘤细胞生长的选择性培养基上进行铺板。优选的选择技术使用HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)选择。足够时间后，通常大约1-2周，可观察到杂合体的菌落。选择单集落，并测试它们的培养物上清液对多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤细胞。
可以由生长的杂交瘤细胞集落上清液分离单克隆抗体。此外，可以采用多种技术来提高产量，诸如将杂交瘤细胞系注射到合适的脊椎动物宿主(诸如小鼠)的腹膜腔中。然后可以由腹水或血液收获单克隆抗体。可以通过传统技术，诸如层析、凝胶过滤、沉淀、和抽提，从抗体中除去污染物。本发明的多肽可以用于例如亲和层析步骤的纯化过程。
在某些实施方案中，使用抗体的抗原结合片段可能是优选的。这些片段包括可以使用常规技术制备的Fab片段。简而言之，可以通过蛋白A珠层析柱上的亲和层析，由兔血清纯化免疫球蛋白(Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988)，并用木瓜蛋白酶进行消化，从而产生Fab和Fc片段。可以通过蛋白A珠层析柱上的亲和层析，将Fab和Fc片段分开。
单克隆抗体或其片段可以与一种或多种治疗剂进行偶联。这方面的合适试剂包括可以用于例如体外清除自体骨髓的放射性示踪物和化疗试剂。代表性治疗剂包括放射性核素、分化诱导剂、药物、毒素、及其衍生物。优选的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At、和212Bi。优选的药物包括氨甲喋呤、和嘧啶及嘌呤类似物。优选的分化诱导剂包括佛波醇酯和丁酸。优选的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素、霍乱毒素、白树毒素(gelonin)、假单胞菌外毒素、志贺氏杆菌毒素、和商陆抗病毒蛋白。为了诊断性目的，放射性试剂的偶联可以有助于转移的追踪或WT1阳性肿瘤的定位。
治疗剂可以与合适的单克隆抗体直接或间接(如通过连接基团)进行偶联(如共价键合)。若试剂和抗体都含有能够相互反应的取代基，则它们之间的直接反应是可能的。例如，二者之一上的亲核基团(诸如氨基或巯基)可以与二者之另一上的含羰基的基团(诸如酐或酸卤化物)或与含易离去基团(如卤化物)的烷基发生反应。
或者，可能需要将治疗剂和抗体通过连接基团进行偶联。连接基团可以作为间隔抗体与试剂的间隔子发挥功能，以避免对结合能力的影响。连接基团还可以用来增加试剂或抗体上的取代基的化学反应性，并由此增加偶联效率。化学反应性的增加还可以有助于试剂或试剂上的功能基团的使用，否则，则不可能。
对于本领域技术人员明显的是，可以采用多种双功能或多功能试剂(相同和不同功能的，诸如Pierce Chemical Co.，Rockford，IL的产品目录中描述的)作为连接基团。偶联可以通过例如氨基、羧基、巯基或经氧化后的糖类残基实现。有大量参考文献描述这种方法，如授予Rodwell的美国专利4,67l,958。
若治疗剂不含本发明免疫缀合物的抗体部分时更有效，则可能需要使用在进入细胞过程中或其后可切割的连接基团。已经描述了大量不同的可切割的连接基团。试剂在细胞内从连接基团释放的机制， 包括通过还原二硫键(如授予Spitler的美国专利4,489,710)、通过照射光不稳定键(授予Senter等人的美国专利4,625,014)、通过衍生氨基酸侧链的水解(如授予Kohn等人的美国专利4,638,045)、通过血清补体介导的水解(如授予Rodwell等人的美国专利4,671,958)、和通过酸催化的水解(如授予Blattler等人的美国专利4,569,789)的切割。
可能需要将多于一种试剂与抗体进行偶联。在一个实施方案中，将多分子试剂与单分子抗体偶联。在另一个实施方案中，多于一种试剂可以与一种抗体偶联。不管特殊实施例如何，含有多于一种试剂的免疫缀合物可以由多种方法进行制备。例如，多于一分子试剂可以与一个抗体分子直接进行偶联，或者可以使用提供多个吸附位点的接头。或者，可以使用载体。载体可以以多种方式携带试剂，包括直接的或通过连接基团的共价键合。合适的载体包括蛋白质诸如清蛋白(如授予Kato等人的美国专利4,507,234)、肽和多糖诸如氨基葡聚糖(授予Shih等人的美国专利号4,699,784)。载体还可以通过非共价键合或通过包裹(诸如在脂质体囊泡中，如美国专利4,429,008和4,873,088)携带试剂。对放射性核素试剂特异的载体包括放射性卤化物小分子和螯合化合物。例如，美国专利4,735,792公开了代表性放射性卤化物小分子及其合成方法。放射性核素螯合物可以由螯合化合物(包括含有氮和硫原子作为结合金属或金属氧化物放射性核素的供体原子的那些螯合化合物)构成。例如，授予Dayison等人的美国专利4,673,562公开了代表性螯合化合物和它们的合成方法。
对于抗体和免疫缀合物可以使用多种施用途径。通常，施用可以是静脉内、肌肉内、皮下或切除了肿瘤的病灶。显然抗体/免疫缀合物的准确剂量将随使用的抗体、肿瘤上的抗原密度、和抗体的清除速率而变化。
此处还提供了模拟WT1免疫原性部分的抗独特型抗体。使用众所周知的技术，可以制备针对可特异结合WT1免疫原性部分的抗体或其抗原结合片段的这些抗体。模拟WT1免疫原性部分的抗独特型抗体是那些与可特异结合上述WT1免疫原性部分的抗体或其抗原结合片段可结合的抗体。T细胞免疫治疗组合物可以还/或包含对WT1特异的T细胞。这些细胞通常可以使用常规步骤在体外或离体进行制备。例如，使用购自CellProInc.，Bothell WA的细胞分离系统诸如CEPRATETM(还可参阅美国专利5,240,856；美国专利5,215,926；WO 89/06280；WO 91/16116和WO 92/07243)，可以由哺乳动物(诸如患者)的骨髓、外周血、或者一骨髓或外周血级分分离T细胞。或者，T细胞可以由相关或无关人、非人哺乳动物、细胞系或培养物衍生得到。
T细胞可以用WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的抗原呈递细胞(APC)进行刺激。这种刺激进行的条件和时间足够产生WT1多肽特异的T细胞。优选的，WT1多肽或多核苷酸存在于投递载体(诸如微球体)中，以促进产生抗原特异的T细胞。简而言之，将由患者或相关或无关供体通过常规技术(诸如外周血淋巴细胞的菲科尔(Ficol)/泛影葡胺(Hypaque)密度梯度离心)分离得到的T细胞与WT1多肽一起温育。例如，可以将T细胞在体外与WT1多肽(如5-25μg/ml)或合成相当量WT1多肽的细胞一起于37℃温育2-9天(通常4天)。可能需要将一部分不含WT1多肽的T细胞单独温育，作为对照。
如果T细胞杀死WT1多肽包被的或表达这种多肽的编码基因的靶细胞，那么认为T细胞对WT1多肽是特异的。T细胞特异性可以使用多种常规技术进行评价。例如，在铬释放实验或增殖实验中，与阴性对照相比，裂解和/或增殖增长超过2倍的刺激指数指示T细胞特异性。这些实验可以如Chen等人，癌症研究(Cancer Res.)541065-1070，1994中描述进行。或者，T细胞增殖的检测可以通过多种已知技术实现。例如，T细胞增殖可以通过测量DNA合成的增加速率(如通过用氚胸苷脉冲标记T细胞的培养物，并测量掺入DNA的氚胸苷的量)进行检测。检测T细胞增殖的其它方法包括，测量白介素-2(IL-2)产生、Ca2+流、或染料(诸如3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-四唑鎓)摄取的增加。或者，可以测量淋巴因子(诸如干扰素-γ)的合成，或者对能够应答WT1多肽的T细胞相对数目进行定量。与WT1多肽(200ng/ml-100μg/ml，优选100ng/ml-25μg/ml)接触3-7天，应当导致T细胞增殖增长至少2倍；并且/或者如上所述接触2-3小时，应当导致T细胞的激活，这是使用常规细胞因子实验进行测量的，其中细胞因子(如TNF或TNF-γ)释放水平增加2倍是T细胞活化的指标(参阅Coligan等人，免疫学现行方案(Current Protocols inImmunology)，第1卷，Wiley Interscience(Greene 1998))。可以使用常规技术扩增WT1特异的T细胞。在优选的实施方案中，T细胞衍生自患者或者相关或无关供体，而且在刺激和扩增后对患者施用。
应答WT1多肽、多核苷酸或表达WT1多肽的APC而被激活的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。可以以多种方法检测CD4+或CD8+T细胞的特异活化。用于检测特异T细胞活化的方法包括检测T细胞的增殖、细胞因子的产生(如淋巴因子)、或溶细胞活性的产生(如WT1特异的细胞毒T细胞的产生)。对于CD4+T细胞，用于检测特异T细胞活化的优选方法是T细胞增殖的检测。对于CD8+T细胞，用于检测特异T细胞活化的优选方法是溶细胞活性产生的检测。
为了治疗性目的，应答WT1多肽、多核苷酸或APC而增殖的CD4+或CD8+T细胞，可以在体外或体内进行数目扩增。这些T细胞的体外增殖可以以多种方法实现。例如，可以在加有或未加T细胞生长因子(诸如干扰素-2和/或合成WT1多肽的刺激细胞)的条件下，将T细胞再一次暴露于WT1多肽。在产生CD8+T细胞应答的情况中，加入刺激细胞是优选的。T细胞可以在体外生长至较大数目，而仍保持应答WT1多肽间歇性再刺激的特异性。简而言之，对于初次体外刺激(IVS)，可以将大数目的淋巴细胞(如超过4×107个)置于装有含人血清培养基的烧瓶中。可以与破伤风类毒素(如5μg/ml)一起直接加入WT1多肽(如10μg/ml)。然后将烧瓶进行温育(如于37℃7天)。为了进行第二次IVS，收获T细胞，并置于含2－3×107个经照射的外周血单核细胞的新烧瓶中。直接加入WT1多肽(如10μg/ml)。将烧瓶于37℃温育7天。在第二次IVS后第2天和第4天，加入2-5个单位的白介素-2(IL-2)。为了进行第三次IVS，将T细胞置于孔中，并用肽包被的、用个体自身EBV转化的B细胞进行刺激。在每个循环的第2天和第4天加入IL-2。一旦细胞显示为特异细胞毒T细胞，即可以使用在第2、4、6天加入更高IL-2(20个单位)的10天刺激循环进行扩增。
或者，可以通过克隆对当存在WT1多肽时增殖的一个或多个T细胞进行数目扩增。用于克隆细胞的方法在本领域是众所周知的，并且包括有限稀释法。可以由致敏患者外周血通过密度梯度离心和绵羊红细胞花结纯化应答T细胞，并在培养物中通过标明抗原在经照射的自体填充细胞(filler cell)存在时的刺激建系。为了产生CD4+T细胞系，将WT1多肽作为抗原刺激物使用，而将通过Epstein Barr病毒感染而永生化的自体外周血淋巴细胞(PBL)或类淋巴母细胞系(LCL)作为抗原呈递细胞使用。为了产生CD8+T细胞系，可以将用产生WT1多肽的表达载体转染的自体抗原呈递细胞作为刺激细胞使用。抗原刺激后，将经刺激T细胞以0.5个细胞/孔的频率与1×106个经照射PBL或LCL细胞和50U/ml重组白介素-2(rIL-2)一起置于平底96孔板中，由此在抗原刺激2-4天可克隆建系T细胞。初次铺板大约2-3周后，鉴定建系克隆生长的孔，并用适当抗原在自体抗原呈递细胞存在时进行再刺激，然后加入低剂量的rIL-2(10U/ml)扩增2-3天。通过定期(大约每两周一次)用抗原和rIL-2再刺激，将T细胞克隆维持在24孔板中。
在某些实施方案中，可以在体内和/或体外引发(即使之对WT1致敏)异源T细胞。通过使T细胞接触WT1多肽、编码这种多肽的多核苷酸、或产生这种多肽的细胞，接触进行的条件和时间足够引发T细胞，可以实现这种引发。通常，如果通过此处所述的常规增殖、铬释放实验和/或细胞因子释放实验的测量，与WT1多肽的接触导致T细胞的增殖和/或活化，则认为T细胞被引发。与阴性对照相比，增殖或裂解增长超过2倍和细胞因子水平增长超过3倍的刺激指数指示T细胞特异性。例如骨髓移植中或者作为淋巴细胞融合供体，可以采用体外引发的细胞。药物组合物和疫苗在某些方面，可以将多肽、多核苷酸、抗体和/或T细胞掺入药物组合物或疫苗。或者，药物组合物可以包含经WTl多核苷酸转染、从而表达WT1多肽的抗原呈递细胞(如树突状细胞)。药物组合物包含一种或多种这种化合物或细胞和生理学可接受的载体或赋形剂。某些疫苗可以包含一种或多种这种化合物或细胞和非特异免疫应答增强剂(诸如掺入化合物的佐剂或脂质体)。药物组合物和疫苗还可以含有投递系统，诸如美国专利4,897,268和5,075,109中公开的生物可降解的微球体。本发明范围内的药物组合物和疫苗还可以含有生物学有活性或无活性的其它化合物。
在某些实施方案中，药物组合物和疫苗被设计用于在患者(诸如人)体内引发WT1多肽特异的T细胞应答。通常，T细胞应答可能偏爱使用相对短的多肽(如含有天然WT1多肽中少于23个连续氨基酸残基，优选4-16个连续残基，更优选8-16个连续残基，仍更优选8-10个连续残基)。或者/另外，疫苗可以包含优先增强T细胞应答的非特异免疫应答增强剂。换言之，免疫应答增强剂可以以高于抗体应答被增强的量而增强针对WT1多肽的T细胞应答水平。例如，与基于油的标准佐剂(诸如CFA)相比，优先增强T细胞应答的免疫应答增强剂可以，与WT1阴性对照细胞系相比，使增殖性T细胞应答至少增强2倍，裂解应答至少增强10％，且/或T细胞活化至少增强2倍，而没有检测到抗体应答的增强。针对WT1多肽的T细胞或抗体应答的增强量通常可以使用本领域已知的任何代表性技术(诸如此处提供的技术)进行测定。
药物组合物或疫苗可以含有编码上述一种或多种多肽的DNA，使得可以原位合成多肽。如上所述，该DNA可以存在于本领域普通技术人员知道的多种投递系统中，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统、和哺乳动物表达系统。适当的核酸表达系统含有在患者体内表达所必需的DNA、cDNA或RNA序列(诸如合适的启动子和终止信号)。细菌投递系统涉及施用在其细胞表面表达多肽免疫原性部分的细菌(诸如卡介苗Bacillus-Calmette-Guerrin)。在优选的实施方案中，可以使用可能涉及使用非致病的(有缺陷的)、能复制的病毒的病毒表达系统(如牛痘或其它痘病毒、逆转录病毒、或腺病毒)导入DNA。用于将DNA掺入这些表达系统的技术对于本领域普通技术人员是众所周知的。DNA还可以是“裸露的”，如Ulmer等人，科学(Science)2591745-1749，1993中描述的，并由Cohen，科学(Science)2591691-1692，1993回顾的。可以通过用DNA包被能够有效转运到细胞中的、生物可降解的小珠，从而增加裸露DNA的摄取。
如上所述，药物组合物或疫苗可以包含表达WT1多肽的抗原呈递细胞。为了治疗性目的，如上所述，抗原呈递细胞优选是自体树突状细胞。这些细胞可以使用常规技术进行制备和转染，诸如Reeves等人，癌症研究(Cancer Res.)565672-5677，1996；Tuting等人，免疫学杂志(J.Immunol.)1601139-1147，1998；和Nair等人，自然生物技术(Nature Biotechnol.)16364-369，1998中描述的那些技术。抗原呈递细胞表面上WT1多肽的表达可以通过如上所述体外刺激和常规增殖以及铬释放实验进行确认。
虽然可以在本发明的药物组合物中采用本领域普通技术人员知道的任何合适的载体，但是载体的类型随施用方式而变化。本发明的组合物可以配制成任何适当的施用方式，包括例如局部、口、鼻、静脉内、颅腔内、腹腔内、皮下、或肌肉内施用。对于非肠道施用，诸如皮下注射，载体优选包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口施用，可以采用任何上述载体或固体载体，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、和碳酸镁。还可以采用生物可降解的微球体(如聚乳酯聚甘醇酸酯)作为用于本发明药物组合物的载体。对于某些局部施用，优选使用众所周知的成分配制成乳膏或洗液。
这些组合物还可以包含缓冲液(如中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐水)、糖类(如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸(诸如甘氨酸)、抗氧化剂、螯合剂(诸如EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(如氢氧化铝)和/或防腐剂。或者，本发明的组合物可以配制成冻干剂。化合物还可以使用众所周知的技术包裹入脂质体。
在本发明的疫苗中可以采用多种非特异免疫应答增强剂(诸如佐剂)。大多数佐剂含有保护抗原免于快速代谢的物质(诸如氢氧化铝或矿物油)，和免疫应答刺激物(诸如脂质A、百日咳杆菌(Bortadellapertussis)或结核分技杆菌(Mycobacterium tuberculosis)衍生的蛋白质)。合适的非特异免疫应答增强剂包括基于铝的佐剂(如Alhydrogel、Rehydragel、磷酸铝、Algammulin、氢氧化铝)；基于油的佐剂(弗氏佐剂(FA)、Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50或Speppic MONTANIDE ISA720)；细胞因子(如GM-CSF或Flat3配基)；微球体；基于非离子型嵌段共聚物的佐剂；基于二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)的佐剂AS-1、AS-2(Smith Kline Beecham)；基于Ribi佐剂系统的佐剂；QS21(Aquila)；基于皂甙的佐剂(粗制皂甙、皂甙Quil A)；基于胞壁酰二肽(MDP)的佐剂，诸如SAF(微流化形式的Syntex佐剂(SAF-m))；二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)；基于人补体的佐剂m.vaccae和衍生物；基于免疫刺激复合物(iscom)的佐剂；灭活的毒素；和减毒的传染因子(诸如结核杆菌)。
如上所述，在某些实施方案中，免疫应答增强剂根据优先引发或增强针对WT1多肽的T细胞应答(如CD4+和/或CD8+)的能力进行选择。这些免疫应答增强剂在本领域是众所周知的，而且包括(但不限于)Montanide ISA50、Speppic MONTANIDE ISA720、细胞因子(如GM-CSF或Flat3配基)、微球体、基于二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)的佐剂AS-1(Smith Kline Beecham)、AS-2(Smith Kline Beecham)、基于Ribi佐剂系统的佐剂、QS21(Aquila)、基于皂甙的佐剂(粗制皂甙、皂甙Quil A)、微流化形式的Syntex佐剂(SAF-m)、MV、ddMV(Genesis)、基于免疫刺激复合物(iscom)的佐剂和灭活的毒素。
此处所述的组合物和疫苗可以作为缓释制剂(即诸如施用后缓慢释放化合物的胶囊或海绵体等制剂)的一部分施用。这些制剂通常可以使用众所周知的技术进行制备，并通过例如口、直肠或皮下植入，或者通过期望靶位点的植入进行施用。在缓释制剂中，多肽、多核苷酸、抗体、或细胞可以散布于载体基质中，和/或包含于由速率控制膜包围的空间内。用于这些制剂的载体是生物相容性的，而且还可以是生物可降解的；优选制剂提供的活性成分的释放水平相对稳定。缓释制剂内含有的活性成分的量取决于植入位点、释放速率和预期的释放持续时间、以及治疗或预防的状况的本质。恶性疾病的治疗在本发明的其它方面中，此处所述组合物和疫苗可以用于抑制恶性疾病(诸如进行性或转移性疾病或者特征为小肿瘤的疾病诸如微小残余疾病(minimal residual disease)的发展。通常，这些方法可以用于预防、迟滞、或治疗与WT1表达有关的疾病。换言之，此处提供的治疗性方法可以用于治疗已有的WT1相关疾病，或者可以用于预防或迟滞这种疾病在未患病或患有与WT1表达无关的疾病的患者体内的发作。
如此处所用，如果患病细胞(如肿瘤细胞)在疾病过程的某些时候产生的WT1多肽水平比相同组织的正常细胞可检测的更高，则该疾病“与WT1表达有关”。WT1表达与恶性疾病的相关性不要求WT1存在于肿瘤上。例如，肿瘤的起始可能涉及WT1的过度表达，但是蛋白质表达随后可能消失。或者，特征并不在于WT1表达增加的恶性疾病可能在较晚的时候发展成特征为WT1表达增加的疾病。相应的，患病细胞的WT1表达水平曾经、目前、或预计随后增加的任何恶性疾病被认为“与WT1表达有关”。
可以使用多种技术进行免疫治疗，其中此处提供的化合物或细胞发挥由患者体内清除表达WT1的细胞的功能。发生的这种清除可能是增强或诱导患者体内WT1或表达WT1的细胞特异的免疫应答的结采。或者，可以离体清除表达WT1的细胞(如通过处理自体骨髓、外周血、或者骨髓或外周血级分)。骨髓或外周血级分可以使用本领域任何常规技术获得。
在这些方法中，可以对患者施用药物组合物和疫苗。如此处所用，“患者”指任何温血动物，优选人。患者可能患有或未患有恶性疾病。相应的，上述药物组合物和疫苗可以用于预防疾病的发作(即预防性的)，或者用于治疗患有疾病的患者(如用于预防或迟滞已有疾病的发展和/或转移)。患有疾病的患者可能有微小残余疾病(如完全或部分缓解的白血病患者或者外科放疗和/或化疗后肿瘤减小的癌症患者中的低肿瘤负担)。可以对这种患者进行免疫，以抑制复发(即预防或迟滞复发，或降低复发的严重性)。在某些优选的实施方案中，患者患有白血病(如AML、CML、ALL或儿童ALL)、骨髓增生异常综合症(MDS)或癌症(如胃肠、肺、甲状腺或乳腺癌或者黑色素瘤)，其中癌症或白血病是WT1阳性的(即与此处提供的抗WT1抗体发生可检测的反应，或者表达的WT1mRNA水平通过此处所述RT-PCR可检测到)，或者遭受直接针对表达WT1的细胞的自身免疫疾病的痛苦。
此处提供的组合物可以单独使用，或与诸如外科手术、照射、化疗和/或骨髓移植(自体的、同源的、异源的或无关的)等传统化疗方案进行组合。如下文更详细讨论的，此处提供的结合剂和T细胞可以用于清除自体干细胞。在例如骨髓移植或者输入血或其成分之前，这种清除可能是有益的。此处提供的结合剂、T细胞、抗原呈递细胞(APC)和组合物还可以用于在体外和/或体内扩增并刺激(或引发)自体的、异源的、同源的或无关的WT1特异性T细胞。这些WT1特异性T细胞可以用于例如供体淋巴细胞灌输中。
施用途径、频率、以及剂量，随个体变化，而且可以使用常规技术容易的确定。通常，药物组合物和疫苗可以通过注射(如皮内、肌肉内、静脉内或皮下)、鼻内(如通过吸入)或口服施用。在一些肿瘤中，药物组合物或疫苗可以局部施用(通过例如直肠镜检查术、胃镜检查术、电视、内窥镜检查术、血管造影术或本领域已知的其它方法)。优选的，可以在52周时间内施用1到10个剂量。优选的，间隔一个月施用6个剂量，而且此后可以定期加强接种。替代方案可能适合于个别患者。合适的剂量是，当如上所述施用后，能够促进抗肿瘤免疫应答，而且比基本(即未处理)水平高至少10-50％。这些应答可以通过测量患者体内的抗肿瘤抗体或通过能够在体外杀死患者肿瘤细胞的疫苗依赖性细胞裂解效应细胞的产生进行监控。这些疫苗还应当能够在接种疫苗的患者体内引起免疫应答，与未接种疫苗的患者相比，将导致改进的临床效果(如更频繁的完全或部分缓解，或者更长的无病和/或全面存活)。通常，对于包含一种或多种多肽的药物组合物和疫苗，一剂中每种多肽的量的范围为大约100μg-5mg。合适的剂量大小将随患者的体型而变化，但是通常范围为大约0.1-大约5mL。
通常，适当的剂量和治疗方案提供了足够量的活性成分，足以提供治疗性和/或预防性作用。这种应答可以通过测定治疗患者体内与未治疗患者相比有所改进的临床效果(如更频繁的完全或部分缓解，或者更长的无病和/或全面存活)进行监控。先前存在的针对WT1的免疫应答的增加通常与改进的临床效果有关。这些免疫应答通常可以使用常规增殖、细胞毒性或细胞因子实验，利用在治疗之前和之后由患者得到的样品进行评价。
在其它方面，用于抑制与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法涉及应答上述WT1多肽或表达WT1的APC而被激活的自体T细胞的施用。这些T细胞可以是CD4+和/或CD8+，而且可以如上所述进行增殖。可以以有效抑制恶性疾病发展的量施用T细胞。通常，静脉内、腔内或已切除肿瘤病灶处施用大约1×109－1×1011个T细胞/M2。对本领域技术人员明显的是，细胞数目和施用频率取决于患者的应答。
在某些实施方案中，可以在自体骨髓移植前刺激T细胞。这种刺激可以发生于体内或体外。对于体外刺激，可以使由患者得到的骨髓和/或外周血(或者骨髓或外周血级分)接触WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸、和/或表达WT1多肽的APC，接触进行的条件和时间足以刺激上述T细胞。然后可以使用常规技术对患者施用骨髓、外周血干细胞、和/或WT1特异的T细胞。
在相关实施方案中，可以在同源或异源(相关或无关)骨髓移植前刺激相关或无关供体的T细胞。这种刺激可以发生于体内或体外。对于体外刺激，可以使由相关或无关供体得到的骨髓和/或外周血(或者骨髓或外周血级分)接触WT1多肽、WT1多核苷酸、和/或表达WT1多肽的APC，接触进行的条件和时间足以刺激上述T细胞。然后可以使用常规技术对患者施用骨髓、外周血干细胞、和/或WT1特异的T细胞。
在其它实施方案中，在对患者施用前，自体骨髓、外周血、或者骨髓或外周血级分(如富集CD34+的外周血(PB))可以用此处所述WT1特异的T细胞清除表达WT1的细胞。这些方法可以通过使骨髓或PB接触这种T细胞而进行，接触的条件和时间足以将表达WT1的细胞降至骨髓或外周血中髓样或淋巴细胞总数目的10％以下，优选5％以下，更优选1％以下。这些细胞的清除程度可以通过诸如定性和定量PCR分析、形态、免疫组织化学和FACS分析等常规技术容易的测定。然后可以使用常规技术对患者施用骨髓或PB(或其级分)。诊断方法本发明还提供了用于检测与WT1表达有关的恶性疾病，和监控用于这些疾病的免疫接种或治疗的效力的方法。这些方法是根据本发明的下列发现可以在患有这些疾病的患者体内检测到WT1蛋白质特异的免疫应答，而且增强这些免疫应答的方法可以提供预防性或治疗性益处。
为了检测与WT1表达有关的恶性疾病的存在与否，可以检测患者的WT1特异的T细胞水平。在某些方法中，将由患者分离得到的、包含CD4+和/或CD8+T细胞的生物学样品如此处所述，与WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的APC一起温育，然后检测T细胞特异活化的情况。合适的生物学样品包括(但不限于)分离T细胞。例如，T细胞可以由患者通过常规技术(诸如通过外周血淋巴细胞的Ficoll/Hypaque密度梯度离心)进行分离。可以将T细胞与WT1多肽(如5-25μg/ml)一起在体外于37℃温育2-9天(通常4天)。可能需要将另一部分T细胞在不存在WT1多肽的情况下单独温育，作为对照。对于CD4+T细胞，活化优选通过评价T细胞的增殖进行检测。对于CD8+T细胞，活化优选通过评价细胞裂解活性进行检测。比未患病患者至少高2倍的增殖水平和/或至少高20％的细胞裂解活性水平，指示与WT1表达有关的疾病的存在。使用本领域众所周知的方法，可以在增殖水平和/或细胞裂解活性水平与预测的治疗应答之间产生其它相关性。特别是展示较高抗体、增殖和/或裂解应答的患者预计可能显示较高的治疗应答。
在其它方法中，测试由患者获得的生物学样品的WT1特异的抗体水平。将生物学样品与WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的APC一起，在足够形成免疫复合物的条件和时间下进行温育。然后检测WT1多肽与生物学样品中可特异结合WT1多肽的抗体之间形成的免疫复合物。用于这些方法的生物学样品可以是由预计含有抗体的患者获得的任何样品。合适的生物学样品包括血液、血清、腹水、骨髓、胸腔积液、和脑脊液。
将生物学样品与WT1多肽在反应混和物中在足够在多肽和WT1特异性抗体之间形成免疫复合物的条件和时间下进行温育。例如，可以将生物学样品与WT1多肽于4℃温育24-48小时。
温育后，测试反应混和物中免疫复合物的存在。可以通过多种已知技术，诸如放射免疫实验(RIA)和酶联免疫吸收实验(ELISA)，实现WT1多肽与生物学样品中存在的抗体之间形成的免疫复合物的检测。合适的实验在本领域是众所周知的，并详细描述于科学和专利文献中(如Harlow和Lane，抗体实验室手册(AntibodiesA LaboratoryManual)冷泉港实验室，1988)。可以使用的实验包括(但不限于)David等人(美国专利4,376,110)的双重单克隆抗体三明治免疫实验技术；Wide等人的单克隆-多克隆抗体三明治实验(Kirkham和Hunter编，放射免疫实验方法(Radioimmunoassay Methods)，E.and S.Livingstone，Edinburgh，1970)；Gordon等人(美国专利4,452,901)的“Western印渍”方法；Brown等人(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2554980-4983，1980)的标记配基免疫沉淀；例如Raines和Ross(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2575154-5160，1982)描述的酶联免疫吸附实验；Brooks等人(临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)39477，1980)的包括荧光色素使用的免疫细胞化学技术；和Bowen-Pope等人(美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)812396-2400，1984)的活性中和实验。其它免疫实验包括(但不限于)美国专利3,817,827、3,850,752、3,901,654、3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、和4,098,876中描述的那些方法。
为了检测目的，WT1多肽可以是经标记的或未标记的。未标记WT1多肽可以用于凝集实验，或者与经标记的可结合免疫复合物的检测试剂(如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A、或植物凝血素，和能够与可特异结合WT1多肽的抗体结合的二抗或其抗原结合片段)组合使用。如果WT1多肽是经标记的，则报道基团可以是本领域已知的任何合适的报道基团，包括放射性同位素、荧光基团、发光基团、酶、生物素、和染料颗粒。
在某些实验中，未标记WT1多肽是固定在固体支持物上的。固体支持物可以是本领域技术人员知道的任何吸附多肽的物质。例如，固体支持物可以是微量滴定板中的测试孔，或者是硝酸纤维素或其它合适的膜。或者，支持物可以是珠或盘，诸如玻璃、纤维玻璃、乳胶、或塑料(诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯)。支持物还可以是磁性颗粒或纤维光导传感器，诸如美国专利5,359,681中公开的那些。可以使用本领域技术人员知道的多种技术将多肽固定在固体支持物上，所述技术详细描述于专利和科学文献中。在本发明的内容中，术语“固定化” 指非共价结合(诸如吸附)和共价结合(可以是抗原和和支持物上的功能基团之间的直接连接，或者可以是通过交联剂的连接)。优选通过吸附在微量滴定板的孔或膜上的固定化。在这些情况中，可以通过将合适缓冲液中的WT1多肽与固体支持物接触适当时间而完成吸附。接触时间随温度而变化，但是通常是大约1小时-大约1天。通常，将塑料微量滴定板(诸如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔与大约10ng-大约10μg，优选大约100ng-大约1μg多肽接触，足够固定足够量的多肽。
通常在固定化后封闭支持物上剩余的蛋白质结合位点。本领域技术人员知道的任何合适的封闭剂，诸如牛血清清蛋白、吐温20TM(SigmaChemical公司，St.Louis，MO)、热灭活的正常山羊血清(NGS)、或BLOTTO(脱脂奶粉缓冲液，还含有防腐剂、盐、和除泡剂)。然后将支持物与怀疑含有特异抗体的生物学样品一起温育。样品可以直接应用，或者更常见的，通常将其在含少量(0.1-5.0％，以重量计)蛋白质(诸如BSA、NGS、或BL0TTO)的缓冲液中进行稀释。通常，适当的接触时间(即温育时间)是足以在含有可特异结合WT1的抗体的样品中检测到这种抗体的存在的一段时间。优选的接触时间足以达到在已结合和未结合抗体达到平衡时结合水平的至少大约95％的结合水平。本领域普通技术人员可以领会，达到平衡需要的时间可以通过检测一段时间后发生的结合水平容易的测定。室温下大约30分钟的温育时间通常是足够的。
然后可以通过用适当缓冲液(诸如含0.1％吐温20TM的PBS)清洗固体支持物，除去未结合的样品。然后可以加入含有报道基团的可结合免疫复合物的检测试剂。将检测试剂与免疫复合物一起温育，温育时间足以检测结合的抗体。适当量的时间通常可以通过检测一段时间后发生的结合水平进行测定。然后除去未结合的检测试剂，并使用报道基团检测结合的检测试剂。检测报道基团采用的方法取决于报道基团的本质。对于放射性基团，闪烁计数或放射自显影方法通常是适当的。分光光度法可以用于检测染料、发光基团和荧光基团。生物素可以使用与不同报道基团(通常是放射性或荧光基团或酶)偶联的抗生物素蛋白进行检测。酶报道基团(如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶)通常可以通过加入底物(通常是特殊长度的时间)，随后通过分光光度法或反应产物的其它分析进行检测。无论采用哪种特殊方法，比背景(即由无病个体获得的生物学样品观察到的水平)高至少2倍的检测试剂结合水平指示与WT1表达有关的恶性疾病的存在。
通常，用于监控免疫接种或治疗的效力的方法涉及监控患者体内WT1特异的抗体或T细胞水平的变化。监控抗体水平的方法可以包括下列步骤(a)将由治疗或免疫接种前的患者得到的第一份生物学样品与WT1多肽一起温育，其中温育进行的条件和时间足以形成免疫复合物；(b)检测WT1多肽与生物学样品中可特异结合WT1多肽的抗体之间形成的免疫复合物；(c)使用由治疗或免疫接种后的患者得到的第二份生物学样品，重复步骤(a)和(b)；并(d)比较第一份和第二份生物学样品中检测到的免疫复合物的量。或者，可以采用编码WT1多肽的多核苷酸或表达WT1多肽的APC取代WT1多肽。在这些方法中，检测由多核苷酸编码的或由APC表达的WT1多肽与生物学样品中的抗体之间形成的免疫复合物。
监控T细胞活化和/或WT1特异性前体的数目的方法可以包括下列步骤(a)将由治疗或免疫接种前的患者得到的、包含CD4+和/或CD8+T细胞的第一份生物学样品(如骨髓、外周血或其级分)与WT1多肽一起温育，其中温育进行的条件和时间足以使得T细胞特异激活、增殖和/或裂解；(b)检测T细胞特异激活、增殖和/或裂解的量；(c)使用由治疗或免疫接种后的相同患者得到的、包含CD4+和/或CD8+T细胞的第二份生物学样品，重复步骤(a)和(b)；并(d)比较第一份和第二份生物学样品中T细胞特异激活、增殖和/或裂解的量。或者，可以采用编码WT1多肽的多核苷酸或表达WT1多肽的APC取代WT1多肽。
用于这些方法的生物学样品可以是由预计含有抗体、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的患者获得的任何样品。合适的生物学样品包括血液、血清、腹水、骨髓、胸腔积液和脑脊液。第一份生物学样品可以在治疗或免疫接种起始前、或者治疗或免疫接种方案中途采集。第二份生物学样品应当以相似方式、但在治疗或免疫接种后采集。倘若在采集第一份和第二份生物学样品之间进行了至少部分治疗或免疫接种，则第二份生物学样品可以在治疗或免疫接种完全或部分完成时采集。
两份样品的温育和检测步骤通常可以如上所述进行。第二份样品中的免疫复合物的量相对于第一份样品在统计学上显著增加，反映治疗或免疫接种的成功。
提供下列实施例作为例示而非限制。
实施例实施例1血液学恶性瘤患者体内针对WT1的免疫应答的鉴定此实施例例示了血液学恶性肿瘤患者体内已有免疫应答的鉴定。
为了评价患者体内已有WT1特异性抗体应答的存在，使用Western印渍分析法，分析了AML、ALL、CML和严重的再生障碍性贫血症患者的血清。对血清测试了从人白血病细胞系K562(美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，VA)免疫沉淀WT1的能力。在各种情况中，将免疫沉淀物通过凝胶电泳进行分离，转移到膜上，并用抗WT1的抗体WT180(Santa Cruz生物技术公司，Santa Cruz，CA)进行探查。此Western印渍分析鉴定了血液学恶性肿瘤患者体内潜在的WT1特异抗体。图2显示了显示AML患者的结果的代表性Western印渍。使用患者血清产生的免疫沉淀物中的52kD蛋白质被WT1特异抗体识别。该52kD蛋白质与阳性对照按相同大小迁移。实施例2用表达WT1的细胞系免疫的小鼠体内针对WT1的抗体的诱导此实施例例示了在体内使用表达WT1的细胞来诱导WT1特异性抗体应答。
白血病患者体内已有WT1抗体的检测强烈暗示，通过免疫WT1蛋白质来诱导针对WT1的免疫力是可能的。为了测试通过接种疫苗能否产生针对WT1的免疫力，给小鼠注射TRAMP-C，一种B6起源的WT1阳性肿瘤细胞系。简而言之，给雄性B6小鼠皮下注射5×106个TRAMP-C细胞，并间隔3周用5×106个细胞进行两次加强。最后一次免疫3周后，采集血清，并在含25μM β-2-巯基乙醇、200U/ml青霉素、10mM L-谷氨酰胺、和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO)中制备脾单细胞悬浮液。
TRAMP-C免疫后，在经免疫动物体内检测到WT1特异性抗体应答。图3显示了代表性Western印渍。这些结果显示，通过免疫WT1蛋白质可以诱发针对WT1蛋白质的免疫应答。实施例3用WT1肽免疫的小鼠体内Th的诱导和抗体应答此实施例例示了通过免疫WT1肽诱发WT1特异性免疫应答的能力。
根据搜索具有诱发Th应答潜力的肽基元的Tsites程序(Rothbard和Taylor，欧洲分子生物学杂志(EMB0 J.)793-100，1988；Deavin等人，分子免疫学(Mol.Immunol.)33145-155，1996)，鉴定了适合于诱发Ab和增殖T细胞应答的肽。合成表1所示肽，并测序。
表1WT1肽

将用于免疫的肽分组如下A组 p6-22人 10.9mg溶于1ml(10μl＝100μg)p117-139人/小鼠 7.6mg溶于1ml(14μl＝100μg)p244-262人4.6mg溶于1ml(22μl＝l00μg)B组 p287-301人/小鼠 7.2mg溶于1ml(14μl＝100μg)p299-313小鼠 6.6mg溶于1ml(15μl＝100μg)p421-435人/小鼠 3.3mg溶于1ml(30μl＝100μg)对照(FBL肽100μg)＋CFA/IFA对照(CD45肽100μg)＋CFA/IFAA组所含的肽位于WT1的氨基末端部分(外显子1)，而B组所含的肽位于羧基末端。羧基末端包含与其它DNA结合蛋白具有序列同源性的一个四锌指区。在B组中，p287-301和p299-313由外显子7(锌指1)衍生得到，而p421-435由外显子10(锌指IV)衍生得到。
将B6小鼠用一组WT1肽或一种对照肽进行免疫。将肽溶于1ml注射用无菌水，并对B6小鼠进行3次免疫，间隔3周。所用佐剂是CFA/IFA、GM-CSF、和Montinide。然后如实施例1和2所述，测定WT1特异性抗体的存在，并使用标准胸苷掺入实验评价增殖性T细胞应答，其中将细胞与抗原一起进行培养，并通过测量掺入的放射性评价增殖(Chen等人，癌症研究(Cancer Res.)541065-1070，1994)。具体而言，将淋巴细胞在96孔板中以每孔2×105个细胞与4×105个经照射(3000rad)同源脾细胞和指定肽一起进行培养。
用A组肽免疫的小鼠诱发了针对WT1的抗体应答(图4)。疫苗B免疫后没有检测到抗体，这与疫苗B的免疫缺乏辅助T细胞应答是一致的。P117-139诱发了增殖性T细胞应答(图5A至5C)。刺激指数(SI)在8和72之间变化。其它肽(P6-22和P299-313)也显示诱发了增殖性T细胞应答。P6-22的免疫产生的SI是2.3，P299-313的免疫产生的SI是3.3。阳性对照包括ConA刺激的T细胞，以及用诸如CD45和FBL等已知抗原刺激的T细胞，和异源T细胞系(DeBruijn等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)212963-2970，1991)。
图6A和6B显示了，关于疫苗A(图6A)和疫苗B(图6B)的三种肽，观察到的增殖应答。疫苗A诱发了针对免疫肽p6-22和p117-139的增殖性T细胞应答，刺激指数(SI)在3和8之间变化(粗线)。没有检测到针对p244-262的增殖应答(图6A)。
只使用p6-22和p117-139作为单一肽刺激进行随后的体外刺激。用p117-139刺激疫苗A特异T细胞系，导致针对p117-139的增殖，而没有针对p6-22的应答(图7A)。由该系衍生得到的克隆是对p117-139特异的(图7B)。作为对比，用p6-22刺激疫苗A特异T细胞系，导致针对p6-22的增殖，而没有针对p117-139的应答(图7C)。由该系衍生得到的克隆是对p6-22特异的(图7D)。
这些结果显示，接种WT1肽可以诱发针对WT1蛋白质的抗体应答和针对免疫肽的增殖性T细胞应答。实施例4用WT1肽免疫的小鼠体内CTL应答的诱导此实施例例示了WT1肽诱发CTL免疫力的能力。
使用BIMAS HLA肽结合预测分析(Parker等人，免疫学杂志(J.Immunol.)152163，1994)鉴定了具有适合结合I类MHC的基元的肽(9聚体)。表2至44显示了在这种分析中鉴定的肽。在这些表中，得分反映了肽与MHC分子理论上的结合亲和力(解离半衰期)。
使用搜索具有诱发Th应答潜力的肽基元的Tsites程序(Rothbard和Taylor，欧洲分子生物学杂志(EMBOJ.)793-100，1998；Deavin等人，分子免疫学(Mol.Immunol.)33145-155，1996)鉴定了这些肽，并显示于图8A和8B以及表45。
表2人WT1肽和人HLA A1结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表3人WT1肽和人HLA A0201结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表4人WT1肽和人HLA A0205结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表5人WT1肽和人HLA A24结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表6人WT1肽和人HLA A3结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表7人WT1肽和人HLA A68.1结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表8人WT1肽和人HLA A1101结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表9人WT1肽和人HLA A3101结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表10人WT1肽和人HLA A3302结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表11人WT1肽和人HLA B14结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表12人WT1肽和人HLA B40结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表13人WT1肽和人HLA B60结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表14人WT1肽和人HLA B61结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表15人WT1肽和人HLA B62结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表16人WT1肽和人HLA B7结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表17人WT1肽和人HLA B8结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表18人WT1肽和人HLA B2702结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表19人WT1肽和人HLA B2705结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表20人WT1肽和人HLA B3501结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表21人WT1肽和人HLA B3701结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表22人WT1肽和人HLA B3801结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表23人WT1肽和人HLAB 3901结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表24人WT1肽和人HLA B3902结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表25人WT1肽和人HLA B4403结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表26人WT1肽和人HLA B5101结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表27人WT1肽和人HLA B5102结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表28人WT1肽和人HLA B5201结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表29人WT1肽和人HLA B5801结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表30人WT1肽和人HLA CW0301结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表31人WT1肽和人HLA CW0401结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表32人WT1肽和人HLA CW0602结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表33人WT1肽和人HLA CW0702结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表34人WT1肽和小鼠MHC I型Db结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表35人WT1肽和小鼠MHC I型Dd结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表36人WT1肽和小鼠MHC I型Kb结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表37人WT1肽和小鼠MHC I型Kd结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表38人WT1肽和小鼠MHC I型Kk结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表39人WT1肽和小鼠MMC I型Ld结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表40人WT1肽和牛HLA A20结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表41小鼠WT1肽和小鼠MHC I型A0201结合的BIMASHLA肽结合预测分析结果


表42小鼠WT1肽和小鼠MHC I型Db结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表43小鼠WT1肽和小鼠MHC I型Kb结合的_BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表44小鼠WT1肽和小鼠MHC I型Kd结合的BIMAS HLA肽结合预测分析结果


表45能够引发辅助T细胞应答的人WT1肽的TSites肽结合预测分析结果


选择了某些CTL肽(表46所示)进行进一步的研究。对于表46中的每种肽，提供了使用BIMAS HLA肽结合预测分析得到的得分。
表46WT1肽序列和HLA肽结合预测

如Ljunggren等人，自然(Nature)346476-480，1990所述，使用白血病细胞系RMA-S，确认了结合C57B1/6鼠MHC的肽。简而言之，将RMA-S细胞在添加了1％FCS的完全培养基中于26℃培养7小时。向24孔板的每个孔中加入106个RMA-S细胞，单独或与指定肽(25μg/ml)一起在完全培养基中于26℃培养16小时，再于37℃培养3小时。然后将细胞清洗3次，并用异硫氰酸荧光素缀合的抗Db或抗Kb抗体(PharMingen，San Siego，CA)染色。将经标记细胞清洗2次，在含1％ 聚甲醛的500μl PBS中重悬并固定，在流式细胞仪(Becton-Dickinson FACSCalibur)中分析荧光强度。通过将与肽一起温育的细胞与在培养基中单独温育的细胞相比较其平均荧光强度的增加，测量RMA-S细胞表面Db或Kb分子的增长百分比。
用能够结合鼠I型MHC的肽免疫小鼠。免疫后，体外刺激脾细胞，并测试裂解与WT1多肽一起温育的靶细胞的能力。使用标准铬释放实验(Chen等人，癌症研究(Cancer Res.)541065-1070，1994)评价CTL。将106个靶细胞与150μCi Na51Cr于37℃一起温育90分钟(含或不含特异肽)。将细胞清洗3次，并重悬于含5％胎牛血清的RPMI。为了检测，将104个51Cr标记的靶细胞与不同浓度的效应细胞在U形底96孔板中一起温育(终体积200μl)。37℃4-7小时后除去上清液，并通过下面的公式确定特异裂解百分比％特异裂解＝100×(实验释放值-自发释放值)/(最大释放值-自发释放值)。
列于表47的结果显示，一些WT1肽能够结合I型MHC分子，这是产生CTL所必需的。而且，如使用铬释放实验测定的，几种肽能够引发肽特异的CTL(图9A和9B)。免疫CTL肽p10-18人、p136-144人、p136-144小鼠和p235-243后，产生了肽特异的CTL系，并建立了克隆。这些结果指出肽特异性CTL能够杀死表达WT1的恶性细胞。
表47WT1 CTL肽与小鼠B6 I型抗原的结合

实施例5WT1多肽在小鼠体内引发WT1特异性CTL的使用此实施例例示了代表性WT1多肽引发能够杀死WT1阳性肿瘤细胞的CTL免疫力的能力。
如上所述使用TSITES和BIMAS HLA肽结合预测分析，鉴定了含有适于结合I型和II型MHC的基元的肽P117-139。如实施例3所述免疫小鼠。免疫后，体外刺激脾细胞，并测试裂解与WT1肽一起温育的靶细胞以及WT1阳性和阴性肿瘤细胞的能力。使用标准铬释放实验评价CTL。列于图10A-10D的结果显示，P117能够引发能够杀死WT1阳性肿瘤细胞，而不杀死WT1阴性细胞的WT1特异性CTL。这些结果证明肽特异性CTL事实上能杀死表达WT1的恶性细胞，而且疫苗和T细胞疗法对表达WT1的恶性肿瘤是有效的。
使用I型MHC结合肽9聚体p136-144、p225-233、p235-243，以及23聚体肽p117-139，进行了相似的免疫。免疫后，分别用这4种肽中的一种体外刺激脾细胞，并测试裂解与WT1肽一起温育的靶细胞的能力。产生了对p136-144、p235-243、和p117-139特异的CTL，而没有产生对p225-233特异的CTL。p235-243和p117-139的CTL数据显示于图11A和11B。没有显示肽p136-144和p225-233的数据。
CTL裂解要求靶WT1肽受到内源加工而且与肿瘤细胞I型MHC分子结合展示。测试了上述WT1肽特异性CTL裂解WT1阳性及阴性肿瘤细胞系的能力。p235-243特异的CTL可裂解与p235-243一起温育的靶细胞，但是不能裂解表达WT1蛋白质的细胞系(图11A)。显著不同的是，p117-139特异的CTL可裂解与p117-139肽一起温育的靶细胞，还裂解表达WT1的恶性细胞(图11B)。作为阴性对照，p117-139特异的CTL不裂解WT1阴性的EL-4(此处还称为E10)。
通过冷靶抑制(图12A-12B)确认了WT1特异裂解的特异性。以多种效应细胞靶细胞比率将效应细胞铺在U形底96孔板中。加入10倍过量(与热靶相比)的指定肽包被而无51Cr标记的靶细胞。最后，每个孔加入104个51Cr标记的靶细胞，并将平板于37℃温育4小时。每个孔的总体积是200μl。
p117-139特异性CTL对TRAMP-C的裂解被与有关肽p117-139一起温育的EL-4由58％阻滞在36％，而与无关肽一起温育的EL-4则不行(图12A)。相似的，BLK-SV40的裂解被与有关肽p117-139一起温育的EL-4由18％阻滞在0％(图12B)。结果确认了WT1肽特异性CTL可通过识别经加工的WT1而特异杀死恶性细胞。
p117-139内含有具有假定CTL基元的几个片段。为了测定CTL表位的精确序列，合成了p117-139内所有潜在的9聚体肽(表48)。这些肽中的两种(p126-134和p130-138)显示能够结合H-2bI型分子(表48)。p117-139免疫产生的CTL裂解与p126-134和p130-138一起温育的靶细胞，但不裂解与p117-139内的其它9聚体肽一起温育的靶细胞(图13A)。
用p126-134或p130-138对p117-139特异性CTL系进行再刺激。用p126-134或p130-138再刺激后，两种T细胞系都展示肽特异性裂解，但是只有p130-138特异性CTL显示WT1阳性肿瘤细胞系的裂解(图13B和13C)。由此，p130-138似乎为天然加工表位。
表48p117-139内WT1 CTL9聚体肽与小鼠B6I型抗原的结合

实施例6小鼠肿瘤细胞系中WT1特异的mRNA的鉴定此实施例例示了使用RT-PCR检测细胞和细胞系中的WT1特异性mRNA。
通过密度梯度离心分离单核细胞，并立即冻存于-80℃，直至通过RT-PCR分析WT1特异性mRNA的存在。RT-PCR通常如Fraizer等人，血液(Blood)864704-4706，1995所述进行。根据标准步骤由107个细胞提取总RNA。将RNA沉淀重悬于25μl经焦碳酸二乙酯处理的水中，并直接用于逆转录。通过PCR扩增锌指区(外显子7-10)得到330bp小鼠cDNA。扩增在热循环仪中进行1或2(如果需要)轮PCR。使用AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin E1mer Centus，Norwalk，CT)、2.5mM MgCl2、和20pmol每种引物，总反应体积50μl。将20μlPCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙锭染色。用Polaroid底片(Polaroid 667，Polaroid有限公司，Hertfordshire，英国)对凝胶进行拍照。遵循Kwok和Higuchi，自然(Nature)339237-238，1989的推荐，预防交叉污染。阴性对照包括cDNA-和PCR-试剂混和物，在每个实验中以水取代cDNA。为了避免假阴性，通过使用β-肌动蛋白引物的对照PCR评价每种样品中完整RNA的存在和适量cDNA的产生。将用这些引物不扩增的样品排除在分析之外。
用于扩增小鼠细胞系中WT1的引物是P1151458-14785’CCCAGG CTG CAA TAA GAG ATA 3’(正向引物；SEQ ID NO21)；和P1161767-17875’ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3’(反向引物；SEQ IDNO22)(参阅Inoue等人，血液(Blood)882267-2278，1996；Fraizer等人，血液(Blood)864704-4706，1995)。
用于对照反应的β-肌动蛋白引物是5’GTG GGG CGC CCC AGG CACCA 3’(有义引物；SEQ ID NO23)；和5’GTC CTT AAT GTC ACG CACGAT TTC 3’(反义引物；SEQ ID NO24)。
用于扩增人WT1的引物是P117954-9745’GGC ATC TGA GACCAG TGA GAA 3’(SEQID NO25)；和P1181434-14145’GAG AGTCAG ACT TGA AAG CAGT 3’(SEQ ID NO5)。用于嵌套RT-PCR的引物可以是P1191023-10435’GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3’(SEQID NO26)；和P1201345-13655’TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT3’(SEQ ID NO27)。
表48显示了小鼠肿瘤细胞系的WT1 PCR分析结果。在表4中，(+++)表示第一步RT-PCR中的强WT1 PCR扩增产物，(++)表示通过第一步WT1 RT-PCR可检测到的WT1扩增产物，(+)表示只在第二步WT1RT-PCR中可检测到的产物，而(-)表示WT1 PCR阴性。
表49小鼠肿瘤细胞系中WT1 mRNA的检测

由上所述，应当这样理解，虽然此处为例示目的描述了本发明的特殊实施方案，但仍可以进行多种修饰而不偏离本发明的精神和范围。相应的，本发明保护范围仅由所附权利要求限制。
序列表<110> Gaiger， AlexanderCheever，Martin A.
<120> 用于WT1特异性免疫治疗的组合物和方法<130> 210121.465C1<140> US<141> 1999-03-25<160> 326<170> FastSEQ for Windows Version 3.0<210> 1<211> 17<212> PRT<213> Homo sapien<400> 1Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly1 5 10 15Gly<210> 2<211> 23<212> PRT<213> Homo sapien<400> 2Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro1 5 10 15Tyr Leu Pro Set Cys Leu Glu20<210> 3<211> 23<212> PRT<213> Mus musculus<400> 3Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro1 5 10 15Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu20<210> 4<211> 19<212> PRT<213> Homo sapien<400> 4Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys1 5 10 15Trp Thr Glu<210>
<211> 22<212> DNA<213> Homo sapien<400> 5gagagtcaga cttgaaagca gt 22<210> 6<211> 20<212> DNA<213> Homo sapien<400> 6ctgagcctca gcaaatgggc 20<210> 7<211> 27<212> DNA<213> Homo sapien<400> 7gagcatgcat gggctccgac gtgcggg 27<210> 8<211> 25<212> DNA<213> Homo sapien<400> 8ggggtaccca ctgaacggtc cccga25<210> 9<211> 18<212> DNA<213> Mus musculus<400> 9tccgagccgc acctcatg18<210> 10<211> 18<212> DNA<213> Mus musculus<400> 10gcctgggatg ctggactg18<210> 11<211> 27<212> DNA<213> Mus musculus<400> 11gagcatgcga tgggttccga cgtgcgg 27<210> 12<211> 29<212> DNA<213> Mus musculus<400> 12ggggtacctc aaagcgccac gtggagttt29
<210> 13<211> 17<212> PRT<213> Mus musculus<400> 13Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu Gly Gly Gly1 5 10 15Gly<210> 14<211> 19<212> PRT<213> Mus musculus<400> 14Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys1 5 10 15Trp Thr Glu<210> 15<211> 15<212> PRT<213> Homo sapien<400> 15Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg1 5 10 15<210> 16<211> 15<212> PRT<213> Mus musculus<400> 16Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg1 5 10 15<210> 17<211> 14<212> PRT<213> Mus musculus<400> 17Val Arg Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser1 5 10<210> 18<211> 14<212> PRT<213> Homo sapien<400> 18Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser1 5 10<210> 19<211> 15<212> PRT<213> Homo sapien
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<210> 27<211> 21<212> DNA<213> Homo sapien<400> 27tcaaagcgcc agctggagtt t 21<210> 28<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 28Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys1 5<210> 29<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 29Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe1 5<210> 30<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 30Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu1 5<210> 31<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 31Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe1 5<210> 32<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 32Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp1 5<210> 33<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien<400> 33Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr1 5
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<210> 296<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 296Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile1 5<210> 297<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 297Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser1 5<210> 298<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 298Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu1 5<210> 299<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 299Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val1 5<210> 300<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 300Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser1 5<210> 301<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 301Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile1 5<210> 302<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 302Thr Leu His Phe Ser Gly Gln Phe Thr1 5<210> 303<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 303Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr1 5<210> 304<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 304Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala1 5<210> 305<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 305Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr1 5<210> 306<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 306Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met1 5<210> 307<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 307Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys1 5<210> 308<211> 9<212> PRT<213> Mus musculus<400> 308Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met1 5<210> 309<211> 6<212> PRT<213> Homo sapien
<400> 309Gly Ala Ala Gln Trp Ala15<210> 310<211> 12<212> PRT<213> Homo sapien<400> 310Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro1 5 10<210> 311<211> 15<212> PRT<213> Homo sapien<400> 311Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly1 5 10 15<210> 312<211> 5<212> PRT<213> Homo sapien<400> 312His Ala Ala Gln Phe1 5<210> 313<211> 32<212> PRT<213> Homo sapien<400> 313Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu1 5 10 15Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu20 25 30<210> 314<211> 32<212> PRT<213> Homo sapien<400> 314Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg1 5 10 15Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser20 25 30<210> 315<211> 4<212> PRT<213> Homo sapien<400> 315Arg Tyr Phe Lys1
<210> 316<211> 14<212> PRT<213> Homo sapien<400> 316Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln1 5 10<210> 317<211> 22<212> PRT<213> Homo sapien<400> 317Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr1 5 10 15His Thr Gly Lys Thr Ser20<210> 318<211> 21<212> PRT<213> Homo sapien<400> 318Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Ash1 5 10 15Met His Gln Arg Ash20<210> 319<211> 449<212> PRT<213> Homo sapien<400> 319Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro1 5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala20 25 30Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr35 40 45Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe85 90 95Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Ash Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly G1n Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu260 265 270Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro290 295 300Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala435 440 445Leu<210> 320<211> 449<212> PRT<213> Mus musculus<400> 320Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu ASn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser1 5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala20 25 30Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr35 40 45Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe85 90 95Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Ala Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile Gly Tyr Glu260 265 270Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Ser290 295 300Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp His Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala435 440 445Leu<210> 321<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien and Mus musculus<400> 321Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala1 5<210> 322<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien and Mus musculus<400> 322Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro1 5<210> 323<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien and Mus musculus<400> 323Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro1 5<210> 324<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien and Mus musculus<400> 324Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro1 5<210> 325<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien and Mus musculus<400> 325Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys15<210> 326<211> 9<212> PRT<213> Homo sapien and Mus musculus<400> 326Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu1 权利要求
1.包含天然WT1的免疫原性部分，或其因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与WT1特异的抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体的多肽，其中所述多肽包含天然WT1多肽中存在的不超过16个连续氨基酸残基。
2.权利要求1的多肽，其中免疫原性部分可与MHCI类分子结合。
3.权利要求1的多肽，其中免疫原性部分可与MHC II类分子结合。
4.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含选自下组的序列(a)表2-46中一项或多项记录的序列；(b)上述序列因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体；和(c)上述序列的模拟物，其中模拟物与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小。
5.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含选自下组的序列；(a)ALLPAVPSL(SEQ ID NO34)，GATLKGVAA(SEQ ID NO88)，CMTWNQMNL(SEQ ID NOs49和258)，SCLESQPTI(SEQ ID NOs199和296)，SCLESQPAI(SEQ ID NO198)，NLYQMTSQL(SEQ ID NOs147和284)；ALLPAVSSL(SEQ ID NOs35和255)，RMFPNAPYL(SEQ ID NOs185和293)；(b)上述序列因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体；和(c)上述序列的模拟物，其中所述模拟物与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小。
6.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含天然WT1多肽的4-16个连续氨基酸。
7.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含天然WT1多肽的8-10个连续氨基酸。
8.包含天然WT1多肽的第1-174位氨基酸残基的免疫原性部分，或其因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与WT1特异性T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体的多肽，其中所述多肽包含天然WT1多肽的第175-449位氨基酸中存在的不超过16个连续氨基酸残基。
9.包含因WT1免疫原性部分中1-3个氨基酸位置的取代而不同、以至于与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力相对于天然WT1有所增强的WT1免疫原性部分变体的多肽。
10.WT1多肽的免疫原性部分的模拟物，其中至少一个氨基酸残基被非氨基酸化合物取代，但是与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有减小。
11.包含与制药学可接受的载体或赋形剂相组合的权利要求1的多肽的药物组合物。
12.权利要求11的药物组合物，其中所述多肽包含天然WT1多肽的4-16个连续氨基酸。
13.权利要求11的药物组合物，其中所述多肽包含天然WT1多肽的8-16个连续氨基酸。
14.包含与制药学可接受的载体或赋形剂相组合的权利要求8的多肽的药物组合物。
15.包含与非特异免疫应答增强剂相组合的权利要求1的多肽的疫苗。
16.权利要求15的疫苗，其中所述多肽包含天然WT1多肽的4-16个连续氨基酸。
17.权利要求15的疫苗，其中所述多肽包含天然WT1多肽的8-10个连续氨基酸。
18.权利要求15的疫苗，其中免疫应答增强剂是佐剂。
19.包含与非特异免疫应答增强剂相组合的权利要求8的多肽的疫苗。
20.权利要求19的疫苗，其中免疫应答增强剂是佐剂。
21.包含下列各项的疫苗(a)WT1多肽，其中所述多肽包含天然WT1的免疫原性部分，或其因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异性T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体；和(b)在患者体内优先增强T细胞应答的非特异免疫应答增强剂。
22.权利要求21的疫苗，其中免疫应答增强剂选自MontanideISA50、Seppic MONTANIDE ISA 720、细胞因子(如GM-CSF、Flat3配基)、微球体、基于二甲基双十八烷基溴化铵(DDA)的佐剂、AS-1、AS-2、基于Ribi佐剂系统的佐剂、QS21、基于皂甙的佐剂、微流化形式的Syntex佐剂、MV、ddMV、基于免疫刺激复合物(iscon)的佐剂和经灭活的毒素。
23.包含与制药学可接受的载体或赋形剂相组合的权利要求10的模拟物的药物组合物。
24.包含与非特异免疫应答增强剂相组合的权利要求10的模拟物的疫苗。
25.编码权利要求1或权利要求8的多肽的多核苷酸。
26.包含下列各项的药物组合物(a)编码WT1多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含天然WT1的免疫原性部分，或其因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异的抗体和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体；和(b)制药学可接受的载体或赋形剂。
27.包含下列各项的药物组合物(a)可特异结合WT1多肽的抗体或其抗原结合片段；和(b)制药学可接受的载体或赋形剂。
28.包含下列各项的药物组合物(a)可与WT1多肽特异反应的T细胞；和(b)制药学可接受的载体或赋形剂。
29.包含下列各项的药物组合物(a)抗原呈递细胞，其表达(i)包含天然WT1多肽的免疫原性部分，或其因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异的抗体和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体的WT1多肽；和(b)制药学可接受的载体或赋形剂。
30.包含下列各项的疫苗(a)编码WT1多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含天然WT1的免疫原性部分，或其因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异的抗体和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体；和(b)非特异免疫应答增强剂。
31.包含下列各项的疫苗(a)抗原呈递细胞，其表达(i)包含天然WT1多肽的免疫原性部分，或其因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异的抗体和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体的WT1多肽；和(b)非特异免疫应答增强剂。
32.包含下列各项的疫苗(a)能够与可特异结合WT1的免疫原性部分的抗体特异结合的抗独特型抗体或其抗原结合片段；和(b)非特异免疫应答增强剂。
33.权利要求30-32任一项的疫苗，其中免疫应答增强剂是佐剂。
34.权利要求30-32任一项的疫苗，其中免疫应答增强剂在患者体内优先增强T细胞应答。
35.用于增强或诱导人类患者体内免疫应答的方法，包括对患者施用包含下列各项的药物组合物(a)包含天然WT1多肽的免疫原性部分，或其因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异的抗体和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体的WT1多肽；和(b)生理学可接受的载体或赋形剂；并由此增强或诱导人类患者体内对WT1或表达WT1的细胞特异的免疫应答。
36.用于增强或诱导患者体内免疫应答的方法，包括对患者施用权利要求11、14、23或26-29任一项的药物组合物。
37.用于增强或诱导人类患者体内免疫应答的方法，包括对患者施用包含下列各项的疫苗(a)包含天然WT1多肽的免疫原性部分，或其因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异的抗体和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体的WT1多肽；和(b)非特异免疫应答增强剂；并由此增强或诱导人类患者体内对WT1或表达WT1的细胞特异的免疫应答。
38.用于增强或诱导患者体内免疫应答的方法，包括对患者施用权利要求15、19、21、24或30-32任一项的疫苗，并由此增强或诱导患者体内对WT1或表达WT1的细胞特异的免疫应答。
39.用于抑制人类患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法，包括对人类患者施用包含下列各项的药物组合物(a)包含天然WT1多肽的免疫原性部分，或其因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异的抗体和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体的WT1多肽；和(b)生理学可接受的载体或赋形剂；并由此抑制人类患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展。
40.用于抑制患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法，包括对患者施用权利要求11、14、23或26-29任一项的药物组合物，并由此抑制患者体内恶性疾病的发展。
41.用于抑制人类患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法，包括对人类患者施用包含下列各项的疫苗(a)包含天然WT1多肽的免疫原性部分，或其因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同、但是与抗原特异的抗体和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体的WT1多肽；和(b)非特异免疫应答增强剂；并由此抑制患者体内恶性疾病的发展。
42.用于抑制患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法，包括对患者施用权利要求15、19、21、24或30-32任一项的疫苗，并由此抑制患者体内恶性疾病的发展。
43.权利要求39或权利要求41的方法，其中恶性疾病是白血病。
44.权利要求43的方法，其中白血病是急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病或慢性髓性白血病。
45.权利要求39或权利要求41的方法，其中恶性疾病是癌症。
46.权利要求45的方法，其中癌症是乳腺、肺、甲状腺或胃肠癌症或黑色素瘤。
47.权利要求40的方法，其中恶性疾病是白血病。
48.权利要求47的方法，其中白血病是急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病或慢性髓性白血病。
49.权利要求40的方法，其中恶性疾病是癌症。
50.权利要求49的方法，其中癌症是乳腺、肺、甲状腺或胃肠癌症或黑色素瘤。
51.权利要求42的方法，其中恶性疾病是白血病。
52.权利要求51的方法，其中白血病是急性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病或慢性髓性白血病。
53.权利要求42的方法，其中恶性疾病是癌症。
54.权利要求53的方法，其中癌症是乳腺、肺、甲状腺或胃肠癌症或黑色素瘤。
55.权利要求39的方法，其中所述药物组合物包含具有选自下列的序列的WT1多肽表2-46中一项或多项记录的序列，和上述序列因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同，但是与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有减小的变体。
56.权利要求39的方法，其中所述药物组合物包含具有选自下列的序列的WT1多肽ALLPAVPSL(SEQ ID NO34)、GATLKGVAA(SEQ IDNO88)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO49和258)、SCLESQPTI(SEQ ID NO199和296)、SCLESQPAI(SEQ ID NO198)、NLYQMTSQL(SEQ ID NO147和284)、ALLPAVSSL(SEQ ID NO35和255)、RMFPNAPYL(SEQ IDNO185和293)，和上述序列因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同，但是与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有减小的变体。
57.权利要求41的方法，其中疫苗包含具有选自下列的序列的WT1多肽表2-46中一项或多项记录的序列，和上述序列因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同，但是与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有减小的变体。
58.权利要求41的方法，其中疫苗包含具有选自下列的序列的WT1多肽ALLPAVPSL(SEQ ID NO34)、GATLKGVAA(SEQ ID NO88)、CMTWNQMNL(SEQ ID NO49和258)、SCLESQPTI(SEQ ID NO199和296)、SCLESQPAI(SEQ ID NO198)、NLYQMTSQL(SEQ ID NO147和284)、ALLPAVSSL(SEQ ID NO35和255)、RMFPNAPYL(SEQ ID NO185和293)，和上述序列因一个或多个取代、缺失、加入和/或插入而不同，但是与抗原特异性抗血清和/或T细胞系或克隆发生反应的能力并没有显著减小的变体。
59.由骨髓、外周血、或者骨髓或外周血级分除去表达WT1的细胞的方法，包括将骨髓、外周血、或者骨髓或外周血级分与能与WT1多肽发生特异反应的T细胞进行接触，其中接触进行的条件和时间足以将骨髓、外周血、或者骨髓或外周血级分中的WT1阳性细胞数目降至髓性或淋巴细胞数目的10％以下。
60.用于抑制患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法，包括对患者施用按权利要求59的方法制备的骨髓、外周血、或者骨髓或外周血级分。
61权利要求60的方法，其中骨髓、外周血、或其级分是自体的。
62.权利要求60的方法，其中骨髓、外周血、或其级分是同源的或异源的。
63.用于刺激和/或扩增T细胞的方法，包含将T细胞与WT1多肽、编码WT1多肽的多核苷酸和/或表达WT1多肽的抗原呈递细胞进行接触，接触进行的条件和时间足以刺激和/或扩增T细胞。
64.权利要求63的方法，其中T细胞存在于骨髓、外周血、或者骨髓或外周血级分中。
65.权利要求63的方法，其中骨髓、外周血、或其级分得自患有与WT1表达有关的恶性疾病的患者。
66.权利要求63的方法，其中骨髓、外周血、或其级分得自未患有与WT1表达有关的恶性疾病的哺乳动物。
67.权利要求63的方法，其中T细胞在扩增之前进行了克隆。
68.用于刺激和/或扩增哺乳动物体内T细胞的方法，包括对哺乳动物施用包含下列各项的药物组合物(a)下列各项的一种或多种(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；和(b)生理学可接受的载体或赋形剂；并由此刺激和/或扩增哺乳动物体内T细胞。
69.用于刺激和/或扩增哺乳动物体内T细胞的方法，包括对哺乳动物施用包含下列各项的疫苗(a)下列各项的一种或多种(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；和(b)非特异免疫应答增强剂；并由此刺激和/或扩增哺乳动物体内T细胞。
70.用于抑制患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法，包括对患者施用根据权利要求63的方法制备的T细胞。
71.权利要求70的方法，其中骨髓、外周血、或其级分得自患有与WT1表达有关的恶性疾病的患者。
72.权利要求70的方法，其中骨髓、外周血、或其级分得自未患有与WT1表达有关的恶性疾病的哺乳动物。
73.用于监控患者体内用于与WT1表达有关的恶性疾病的免疫接种或治疗的功效的方法，包括下列步骤(a)将第一份生物学样品与下列一种或多种一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；其中第一份生物学样品由治疗或免疫前的患者获得，且温育进行的条件和时间足以形成免疫复合物；(b)检测WT1多肽和生物学样品中可特异结合WT1多肽的抗体之间形成的免疫复合物；(c)使用由治疗或免疫后的患者获得的第二份生物学样品，重复步骤(a)和(b)；并(d)比较在第一份和第二份生物学样品中检测到的免疫复合物的量，并由此监控患者体内治疗或免疫的功效。
74.权利要求73的方法，其中检测步骤包括(a)将免疫复合物与能够结合该免疫复合物的检测试剂一起进行温育，其中检测试剂包含报道基团，(b)除去未结合的检测试剂，并(c)检测报道基团的存在与否。
75.权利要求74的方法，其中检测试剂包括能够与可特异结合WT1多肽的抗体结合的二抗或其抗原结合片段。
76.权利要求74的方法，其中检测试剂包括蛋白A。
77.权利要求74的方法，其中报道基团选自放射性同位素、荧光基团、发光基团、酶、生物素和染料颗粒。
78.权利要求73的方法，其中报道基团结合在WT1多肽上，且检测步骤包括除去未结合的WT1多肽并随后检测报道基团的存在与否。
79.用于监控患者体内用于与WT1表达有关的恶性疾病的免疫或治疗的功效的方法，包括下列步骤(a)将第一份生物学样品与下列一种或多种一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的WT1多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；其中该生物学样品包含CD4+和/或CD8+T细胞，且由治疗或免疫前的患者获得，而且温育进行的条件和时间足以使得T细胞特异激活、增殖和/或裂解；(b)检测T细胞激活、增殖和/或裂解的量；(c)使用包含CD4+和/或CD8+T细胞、由治疗或免疫后的同一患者获得的第二份生物学样品，重复步骤(a)和(b)；并(d)比较第一份和第二份生物学样品中T细胞激活、增殖和/或裂解的量，并由此监控患者体内该治疗或免疫的功效。
80.权利要求73或权利要求79的方法，其中恶性疾病是癌症或白血病。
81.用于抑制患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法，包括下列步骤(a)将由患者分离得到的CD4+T细胞与下列一种或多种一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；使得T细胞增殖；并(b)对患者施用有效量的增殖T细胞，并由此抑制患者体内恶性疾病的发展。
82.权利要求81的方法，其中恶性疾病是癌症或白血病。
83.权利要求81的方法，其中T细胞温育步骤重复一次或多次。
84.用于抑制患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法，包括下列步骤(a)将由患者分离得到的CD4+T细胞与下列一种或多种一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；使得T细胞增殖；(b)克隆一个或多个在WT1多肽存在时增殖的细胞；并(c)对患者施用有效量的克隆T细胞。
85.权利要求84的方法，其中恶性疾病是癌症或白血病。
86.用于抑制患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法，包括下列步骤(a)将由患者分离得到的CD8+T细胞与下列一种或多种一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；使得T细胞增殖；并(b)对患者施用有效量的经增殖T细胞，并由此抑制患者体内恶性疾病的发展。
87.权利要求86的方法，其中恶性疾病是癌症或白血病。
88.权利要求86的方法，其中T细胞温育步骤重复一次或多次。
89.用于抑制患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的发展的方法，包括下列步骤(a)将由患者分离得到的CD8+T细胞与下列一种或多种一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；使得T细胞增殖；(b)克隆一个或多个在WT1多肽存在时增殖的细胞；并(c)对患者施用有效量的克隆T细胞。
90.权利要求89的方法，其中恶性疾病是癌症或白血病。
91.用于测定患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的存在与否的方法，包括下列步骤(a)将由患者分离得到的CD4+T细胞与下列一种或多种一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；并(b)检测T细胞特异激活的存在与否，由此测定与WT1表达有关的恶性疾病的存在与否。
92.权利要求91的方法，其中恶性疾病是癌症或白血病。
93.权利要求91的方法，其中检测步骤包括检测T细胞增殖的存在与否。
94.用于测定患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的存在与否的方法，包括下列步骤(a)将由患者分离得到的CD8+T细胞与下列一种或多种一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；并(b)检测T细胞特异激活的存在与否，由此测定与WT1表达有关的恶性疾病的存在与否。
95.权利要求94的方法，其中恶性疾病是癌症或白血病。
96.权利要求94的方法，其中检测步骤包括检测溶细胞活性的存在与否。
97.用于测定患者体内与WT1表达有关的恶性疾病的存在与否的方法，包括下列步骤(a)将由患者分离得到的生物学样品与下列一种或多种一起温育(i)WT1多肽；(ii)编码WT1多肽的多核苷酸；或(iii)表达WT1多肽的抗原呈递细胞；其中温育进行的条件和时间足以形成免疫复合物；并(b)检测WT1多肽和生物学样品中可特异结合WT1多肽的抗体之间形成的免疫复合物；并由此测定与WT1表达有关的恶性疾病的存在与否。
98.权利要求97的方法，其中恶性疾病是癌症或白血病。
99.权利要求97的方法，其中检测步骤包括(a)将免疫复合物与能够结合该免疫复合物的检测试剂一起进行温育，其中检测试剂包含报道基团，(b)除去未结合的检测试剂，并(c)检测报道基团的存在与否。
100.权利要求99的方法，其中检测试剂包括能够与可特异结合WT1多肽的抗体结合的二抗或其抗原结合片段。
101.权利要求99的方法，其中检测试剂包括蛋白A。
102.权利要求99的方法，其中报道基团选自放射性同位素、荧光基团、发光基团、酶、生物素和染料颗粒。
103.权利要求97的方法，其中报道基团结合在WT1多肽上，且检测步骤包括除去未结合的WT1多肽并随后检测报道基团的存在与否。
104.权利要求1-9任一项的多肽作为活性治疗物质使用的用途。
105.权利要求1-9任一项的多肽在用于增强或诱导患者体内免疫应答的药物制备中的用途。
全文摘要
此处公开了用于治疗诸如白血病和癌症等恶性疾病的组合物和方法。组合物包含下述中的一种或多种:WT1多核苷酸、WT1多肽、展示WT1多肽的抗原呈递细胞、可特异结合WT1多肽的抗体、或可与WT1多肽特异反应的T细胞。这种组合物可以用于例如预防和治疗转移性疾病。
文档编号C12N15/09GK1336935SQ99813349
公开日2002年2月20日 申请日期1999年9月30日 优先权日1998年9月30日
发明者亚历山大·盖杰, 马丁·奇弗 申请人:科里克萨有限公司, 亚历山大·盖杰 被以下专利引用 (3),