专利名称：具有抗肿瘤和免疫活性的海胆内容物多糖及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种海胆提取物及提取方法，尤其是一种操作简单、成本低，从海胆内
容物中提取具有抗肿瘤和免疫活性的海胆内容物多糖及方法。
背景技术：
海胆是一种棘皮动物，主要有紫海胆、虾胰马粪海胆及棘冠海胆等品种。海胆的营 养及药用价值很高，其可食部分是它体腔内的生殖腺(卵巢、精巢)，统称海胆卵，又称海胆 黄或海胆膏。目前，从海胆中提取抗癌物质的技术有以下两种一种是从海胆黄中提取多糖 SEP的记载，但由于提取物为非硫酸多糖，在提取过程中要进行多次层析柱提纯，工艺复杂， 以及海胆黄原料稀缺、成本高，导致海胆黄多糖SEP造价高，以至于不能实现一次性大规模 生产；另一种则是从海胆壳中提取海胆壳糖，虽然原料来源广泛、成本低且制备工艺简单， 可实现大规模生产，但是所提取的组分是硫酸岩藻糖，只具有抗乳腺癌、宫颈癌及喉癌的作 用。迄今为止，还没有关于以海胆内容物(去除海胆壳)为原料，分离提取既具有抗肿瘤功 效又具有免疫活性的单一硫酸多糖化合物的相关记载。
发明内容
本发明是针对现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、成本低，从海 胆内容物中提取具有抗肿瘤和免疫活性的海胆内容物多糖及方法。
本发明的技术解决方案是一种具有抗肿瘤和免疫活性的海胆内容物多糖，是硫 酸半乳葡聚糖，分子结构特征是1 — 6键合半乳糖为主链，1 — 4键合葡萄糖为支链，半乳糖 的0-2、 0-4位置上连有硫酸基，是溶于水的乳白色粉末，分子结构式如下
<formula>formula see original document page 3</formula> —种上述具有抗肿瘤和免疫活性的海胆内容物多糖的制备方法，其特征在于依次 按如下步骤进行 a.将海胆内容物加无水丙酮常温浸泡两次，每次两小时，然后将丙酮蒸干，得到干 燥的海胆内容物； b.用9(TC热水浸提丙酮处理过且干燥的海胆内容物三次，每次3小时，合并浸提 液，将浸提液浓縮，加浓縮液体积3倍的工业乙醇，离心、取沉淀，干燥沉淀得海胆内容物粗 多糖； c.将海胆内容物粗多糖热水溶解，按酶与海胆内容物粗多糖质量比为1 : 200加
入酶活力单位65 温10分钟；
300万单位/克的木瓜蛋白酶于溶液中，6(TC保温24小时，升至9(TC保
d.加入海胆内容物粗多糖液总体积1/4的Sevage试剂，振荡1 2小时，静止、离 心，取上清；重复操作至无游离蛋白，向合并的上清液中加入1倍体积的工业乙醇醇析，取 沉淀； e.将沉淀干燥后，配成20mg/mL的水溶液，上DE52纤维素离子交换柱，用0 1. 0mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，流速1. 0mL/min，每管5mL分部收集，苯酚_硫酸法逐管测 定糖含量，合并相同组分； f.将200mg所得组分上S印harose 4B制备柱，以0. 9 % NaCl溶液洗脱，流速 10ml/20min，自动部分收集器收集，酚_硫酸法测糖分布，截取分子量为200万Da的组分， 透析浓縮、干燥，得海胆内容物多糖。 本发明是以海胆壳内的所有内容物为原料，经过热水浸提、酶解、过滤、化学提纯、 沉淀、离子交换层析等工艺制备而成，操作简单、成本低廉，所提取的单一多糖组分既具有 抑制乳腺癌及宫颈癌细胞的作用，同时还具有免疫活性。
图1是本发明实施例所提取的海胆内容物多糖对ConA、LPS诱导下T、B淋巴细胞 增殖反应的影响曲线图。
具体实施例方式
a.将海胆内容物加无水丙酮常温浸泡两小时，弃去丙酮浸泡液；再次加入无水丙 酮常温浸泡两小时，然后将丙酮蒸干，得到干燥的海胆内容物； b.用9(TC热水浸提丙酮处理过且干燥的海胆内容物三次，每次浸提3小时，合并 浸提液，将浸提液浓縮，加浓縮液体积3倍的工业乙醇，离心、取沉淀，干燥沉淀得海胆内容 物粗多糖； c.将海胆内容物粗多糖热水溶解，按酶与海胆内容物粗多糖质量比为1 : 200加 入酶活力单位65 300万单位/克的木瓜蛋白酶于溶液中，6(TC保温24小时，升至9(TC保 温10分钟，灭木瓜蛋白酶活性； d.加入海胆内容物粗多糖液总体积1/4的Sevage试剂(氯仿正丁醇=4:1)， 充分振荡1 2小时，静止、离心，取上清；从加入Sevage试剂开始，重复操作至无游离蛋白 (即无沉淀)为止，合并上清液并向上清液中加入1倍体积的工业乙醇醇析，取沉淀；
e.将沉淀干燥后，配成20mg/mL的水溶液，上DE52纤维素离子交换柱 (3. 5cmX 25cm)，用0 1. 0mol/L的NaCl溶液梯度洗脱，流速1. 0mL/min，每管5mL分部收 集，苯酚_硫酸法逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分； f.将所得组分上S印harose 4B制备柱(4. 5X80cm)，上样200mg，以0. 9% NaCl 溶液洗脱，流速10ml/20min，BS-100A自动部分收集器收集，酚-硫酸法测糖分布，截取分子 量为200万Da的组分，透析浓縮、干燥，得海胆内容物多糖。 检验方法及结果用高效液相色谱和超离心等方法鉴定所得沉淀物为单一组分， 分子量2.0Xl(f道尔顿。用甲醇解，气相色谱，甲基化，气-质联用，高碘酸盐氧化，Smith 降解，酶降解，原子力电子显微镜等方法检测，证明该多糖化合物为硫酸半乳葡聚糖，其结 构特征为，(1 — 6)半乳糖是主链，(1 — 4)葡萄糖为支链，在半乳糖的0-2、0-4位置上连
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实验方法及结果 —.用MTT法实验证明，该本发明实施例所得海胆内容物多糖(硫酸半乳葡聚糖) 对乳腺癌细胞和宫颈癌细胞具有一定程度的抑制作用，抑制率分别为15%和35%，最佳作 用量为50ug/ml ，说明该多糖具有明显的抗肿瘤活性。 二.通过体外免疫实验表明，不同浓度的本发明实施例所得海胆内容物多糖对小 鼠脾脏的T、B淋巴细胞具有显著的剌激增殖的作用且均呈现一定剂量依赖性。
1.免疫活性实验 T淋巴细胞转化实验MTT比色法检测海胆内容物多糖对ConA诱导脾T淋巴细胞 增殖反应的影响。 健康Black/6小鼠3只，脱颈处死后，无菌取出脾脏置平皿中挤压、剪碎，常规制 备小鼠脾单细胞悬液，台盼蓝染色计数(活细胞数> 95% )，完全培养液调整细胞浓度至 5X 106/ml。 96孔细胞培养板，RPMI-1640培养液100 y L/孔，100 P L海胆内容物多糖(lmg/ ml)稀释，同时每孔加入10 ii L的ConA溶液使其终浓度为5 y g/mL，并设置阴性对照和ConA 对照孔，各组均设3个复孔。然后，每孔加入脾淋巴细胞悬液100 P L (5 X 105细胞/孔)，培 养板置于37°〇，5% (A培养箱中培养。52h后取出，每孔轻轻吸上清液700ul，加入700ul 不含小牛血清的1640培养液，同时加入MTT (5mg/ml) 20 y L/孔，混匀后继续培养4h，各孔分 别加入三联液100ii L(10% SDS-5X异丙醇-0. 012mol/L盐酸，W/V/V)终止反应，37。C孵箱 过夜，摇匀后酶标仪计测波长570nm的0D值。 B淋巴细胞转化实验MTT比色法检测海胆内容物多糖对LPS诱导脾B淋巴细胞增 殖反应的影响。 健康Black/6小鼠3只，脱颈处死后，无菌取出脾脏置平皿中挤压、剪碎，常规制 备小鼠脾单细胞悬液，台盼蓝染色计数(活细胞数> 95% )，完全培养液调整细胞浓度至 5X 106/mL。 96孔细胞培养板，RPMI-1640培养液100 y L/孔，100 P L海胆内容物多糖(lmg/ mL)稀释，同时每孔加入10 ii L的LPS溶液使其终浓度为10 y g/mL，并设置阴性对照和LPS 对照孔，各组均设3个复孔。然后，每孔加入脾淋巴细胞悬液100 P L (5 X 105细胞/孔)，培 养板置于37°C ， 5% C02培养箱中培养。52h后取出，每孔轻轻吸上清液700 y L，加入700 y L 不含小牛血清的1640培养液，同时加入MTT (5mg/mLl) 20 y L/孑L混匀后继续培养4h，各孔 分别加入三联液100ii L(10% SDS-5X异丙醇-0. 012mol/L盐酸，W/V/V)终止反应，37。C孵 箱过夜，摇匀后酶标仪计测波长570nm的0D值。 结果采用MTT法检测的结果是含有海胆内容物多糖各孔所测的OD值均高于阴性 对照组，图1所示在1. 9531 1000 ii g/mL浓度范围内海胆内容物多糖对ConA诱导的T淋 巴细胞具有明显的增殖作用；在1.9531 1000 iig/mL浓度范围内对LPS诱导的B淋巴细 胞增殖反应有显著的增强作用。说明海胆内容物多糖对ConA、 LPS诱导下小鼠脾脏的T、 B淋巴细胞具有显著的剌激增加作用,
权利要求
一种具有抗肿瘤和免疫活性的海胆内容物多糖，是硫酸半乳葡聚糖，分子结构特征是1→6键合半乳糖为主链，1→4键合葡萄糖为支链，半乳糖的O-2、O-4位置上连有硫酸基，是溶于水的乳白色粉末，分子结构式如下F2010100101292C00011.tif
2. —种如权利要求1所述具有抗肿瘤和免疫活性的海胆内容物多糖的制备方法，其特 征在于依次按如下步骤进行a. 将海胆内容物加无水丙酮常温浸泡两次，每次两小时，然后将丙酮蒸干，得到干燥的 海胆内容物；b. 用9(TC热水浸提丙酮处理过且干燥的海胆内容物三次，每次3小时，合并浸提液，将 浸提液浓縮，加浓縮液体积3倍的工业乙醇，离心、取沉淀，干燥沉淀得海胆内容物粗多糖；c. 将海胆内容物粗多糖热水溶解，按酶与海胆内容物粗多糖质量比为1 : 200加入酶 活力单位65 300万单位/克的木瓜蛋白酶于溶液中，6(TC保温24小时，升至9(TC保温 10分钟；d. 加入海胆内容物粗多糖液总体积1/4的Sevage试剂，振荡1 2小时，静止、离心，取 上清；重复操作至无游离蛋白，向合并的上清液中加入1倍体积的工业乙醇醇析，取沉淀；e. 将沉淀干燥后，配成20mg/mL的水溶液，上DE52纤维素离子交换柱，用0 1. 0mo1/ L的NaCl溶液梯度洗脱，流速1. 0mL/min，每管5mL分部收集，苯酚_硫酸法逐管测定糖含 量，合并相同组分；f. 将200mg所得组分上S印harose 4B制备柱，以0. 9 % NaCl溶液洗脱，流速 10ml/20min，自动部分收集器收集，酚_硫酸法测糖分布，截取分子量为200万Da的组分， 透析浓縮、干燥，得海胆内容物多糖。
全文摘要
本发明公开一种具有抗肿瘤和免疫活性的海胆内容物多糖(硫酸半乳葡聚糖)，是以海胆壳内的所有内容物为原料，经过热水浸提、酶解、过滤、化学提纯、沉淀、离子交换层析等工艺制备而成，分子结构特征是1→6键合半乳糖为主链，1→4键合葡萄糖为支链，半乳糖的O-2、O-4位置上连有硫酸基，是溶于水的乳白色粉末，分子结构式如下n(n＝1786)。
文档编号A61P37/02GK101775078SQ201010010129
公开日2010年7月14日 申请日期2010年1月18日 优先权日2010年1月18日
发明者王长海, 白日霞, 薛业, 赵培余 申请人:大连民族学院