植物根中基因表达所用的启动子的制作方法

专利名称：植物根中基因表达所用的启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及启动子，该启动子导致编码核苷酸序列的根-特异性表达，所述序列处于植物组织特异性基因表达所用启动子的控制之下，本发明还涉及含有该启动子的表达盒，重组载体和微生物，被它们转化的转基因植物，生产转基因植物的方法和分离根-特异性启动子的方法。
在下文中，公开内容中提及的现有技术文献都列入本文作为参考。
已证实通过基因工程方法修饰植物的基因型之后，该植物可有利地用于很多农业领域，这经常是将某些特性传递给有用植物的唯一方法。这样做的主要目的是植物保护以及增加可收获产物的量。
已知多种方法可对双子叶植物和单子叶植物进行基因修饰(参见Gasser和Fraley，科学244(1989)，1293-1299；Potrykus，植物分子生物学和植物生理学年评，42(1991)，205-225)。所有方法都基于基因构建体的传递，在大多数情况下，基因构建体是结构基因的特定编码区与其它结构基因的启动子区域以及转录终止子的新组合。
启动子的提供对转基因植物的产生作用很大，因为启动子的特异性对利用基因工程方法传递的结构基因表达的时间点，组织类型和强度至关重要。
控制植物中外源基因表达的多种启动子是已知的。最常使用的启动子是35S CaMV启动子(Franck等，细胞1(1980)，285-294)，该启动子可导致导入基因的组成型表达。然而，也经常使用诱导型启动子，例如创伤诱导(DE-A-3843628)，化学诱导(Ward等，植物分子生物学，22(1993)，361-366)或光诱导(Fluhr等，科学，232(1986)，1106-1112)。
也描述了细胞-和组织-特异性启动子的用途保卫细胞-特异性基因表达(DE-A-4207358)，种子-，块茎-和果实-特异性基因表达(概述于Edwards和Coruzzi，遗传学年评，24(1990)，275-303；DE-A-3843627)，韧皮部-特异性基因表达(Schmulling等，植物细胞，1(1989)，665-670)，根瘤-特异性基因表达(DE-A-3702497)或分生组织-特异性基因表达(Ito等，植物分子生物学，24(1994)，863-878)。
介导根中的基因表达的启动子包括例如II类patatin启动子(koster-Topfer等，Mol.Gen.Genet，219(1989)，390-396)，当它与报道基因β-葡糖醛酸酶(GUS)基因融合之后，在马铃薯块茎和根尖特定细胞层中表现出高表达。与农杆氨酸合酶启动子(ags)的GUS融合实验(Inoguchi等，植物生理学，149(1996)，73-78)显示出主要位于根中的高GUS活性。含有AKT1(＝钾通道)-GUS-构建体的转基因拟南芥植物(Lagarde等，植物杂志，9(1996)，195-203)特别地导致成熟根区段细胞外层中的表达。TobRB7(＝水通道)基因5’区域长度为636bp的部分(Yamamoto等，植物细胞3(1991)，371-382)介导转基因烟草植物中的根-特异性GUS表达。另外，还描述了与伸展蛋白基因启动子的GUS融合实验，其中可根据下胚轴，根和/或特定根区的发育阶段来测定大豆幼苗中的GUS活性(Ahn等，植物细胞8(1996)，1477-1490)。
所述启动子的应用经常会出现问题。例如，可使用导致基因组成型表达的启动子来生产植物，其中所述基因受所述启动子的控制，所述植物对除草剂具有耐受性和对病原体具有抗性。然而，这些启动子的缺点是受该启动子控制的基因的产物存在于植物的所有部分，包括植物的被收获部分，这在某些情况下是不合乎需要的。诱导型启动子也存在问题，因为一般难以控制室外农业所用的植物诱导条件。
如果想成功实施在植物中进行基因修饰的多种方法，还必须使由不同方式调节的基因处于不同启动子的控制之下。因此，必须提供具有不同特异性的不同启动子系统。迄今为止，只有少数调节根中基因表达的启动子是已知的。如果想成功实施在植物中进行基因修饰的特定方法，必须提供另一种能调节根中基因表达的启动子系统，相对于已知系统而言，该系统受调节的方式有所不同。
因此，本发明遇到的技术难题是提供在植物中进行器官-特异性，优选为根-特异性基因表达所用的工具。这些工具应该适用于例如表达影响从土壤中摄取营养物质的基因，和表达改良根的生长的基因。
通过提供权利要求中表述的实施方案，已解决了这一技术问题。
因此，本发明涉及选自下列的启动子a)启动子，其含有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的核酸序列；b)启动子，其含有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示核酸序列的功能性部分，并可导致由其控制的编码核苷酸序列在植物中的根-特异性表达；c)启动子，其具有能与SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示序列之一杂交的序列，并可导致由其控制的编码核苷酸序列在植物中的根-特异性表达；d)编码蛋白质的基因的启动子，所述蛋白质的氨基酸序列与SEQID No.8所示氨基酸序列具有至少60％同源性，其中这些启动子导致由其控制的编码核苷酸序列在植物中的根-特异性表达。
在优选实施方案中，本发明的启动子是得自或衍生自植物基因的启动子。
在本发明的上下文中，“启动子”是含有基因(优选为结构基因)调节部分的DNA序列。基因的“调节部分”可被理解为决定基因表达的部分。调节部分具有序列基元，转录因子和RNA聚合酶在此装配和诱导基因编码部分的转录。另外，调节部分可含有一个或多个正调节元件，即所谓的增强子。此外或要不然，它也可含有负调节元件，即所谓的沉默子。“结构基因”是调节和编码部分的遗传单位，所述结构基因的基因产物是蛋白质。蛋白质一级氨基酸序列的信息包含在结构基因的编码部分，而调节部分决定合成基因产物所根据的编码部分的转录物所形成的时间，在何种组织形成和形成的量。本发明的启动子可源自例如经重组DNA技术修饰的和/或合成产生的植物基因。
在本发明的意义上，术语“根-特异性的”指的是受本发明启动子控制的外源基因在根中被表达。在本发明的意义上，根特异性特指相对于成熟的叶而言，本发明的启动子更有利于外源基因在根中表达，并导致显著增加的表达，例如至少增加2至5倍，优选增加5至10倍，特别优选增加10至100倍。
在本发明的上下文中，可经由报道基因实验分析根特异性。为了检测分离的启动子序列在根中的启动子活性，例如，可在植物转化所用表达盒或载体中使启动子与报道基因，如大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶基因可操作相连。使用该构建体转化植物。随后，通过例如Martin等(GUS报道基因系统可用作研究植物基因表达的工具，GUS法使用GUS基因作为基因表达的报道基因，Academic出版社(1992)，23-43)所述，与成熟的叶相比较，测定根中β-葡糖醛酸酶的表达。
术语“根”是本领域技术人员已知的。另外，可参照Strasburger(Lehrbuch der Botanik fur HochschulenBegr，Eduard Strasburger u.a.，Peter Sitte的新版本，Hubert Ziegleru.a.，34，Aufl.，1998，Fischer(Gustav)-Verlag，Stuttgart)。
令人惊奇的是，我们发现具有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示核苷酸序列的启动子能导致受其控制的编码核苷酸序列在植物中的根-特异性表达。
这一观察结果特别令人惊奇，因为相对于SEQ ID No.1而言，具有约1000bp延伸的启动子区域基因组片断(SEQ ID No.13)(参见实施例2)不能介导根-特异性GUS表达。仅有按实施例3C所述产生的，相对于大片断(SEQ ID No.13)而言较短的启动子片断(SEQ ID No.1至6)，才能导致由该启动子控制的编码核苷酸序列的根-特异性基因表达。
在分析cDNA序列(SEQ ID No.7)时，在实际存在的ATG(SEQ IDNo.7的第256-258位)的5’区域上游又发现3个另外的ATG翻译起始密码子(SEQ ID No.7的第42-44，65-67和142-144位)，它们导致出现几个上游开放阅读框(uORF)。这种uORF的存在对特定mRNA的翻译率具有负面影响。构建多种启动子片断时，优选使它们不含这一5’上游区域(SEQ ID No.7的第1-255位)。
本发明的启动子可以使由该启动子控制的编码核苷酸序列进行根-特异性基因表达。它是其它根-特异性启动子的很有意思的替代品，因为它也能介导根毛中的基因表达。由于根毛的表面积比根大，因此，利用本发明的启动子能更有效地操纵这种基因的表达，其基因产物可介导经由根毛细胞运输营养物质和代谢产物。
本发明启动子有多种可能的用途供人支配。例如，一种可能性是产生转基因植物，所述植物因根毛代谢被修饰，对根周边的环境(根际)产生积极影响而显示出增加的产量。另外，本发明的启动子可用于基因的根-特异性表达，所述基因能介导例如从被污染的土壤中吸收重金属离子。因此，利用本发明的启动子可以产生能用于植物除污的植物。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的启动子能导致受所述启动子控制的编码核苷酸序列在特定的根细胞中表达，所述根细胞如初生根的根细胞，初生根的根毛，根尖的根细胞或下胚轴下方的初生根的根毛。
除了表现出SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ IDNo.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示完整序列的启动子外，本发明还涉及表现出所述序列的功能性部分，并导致受这些启动子控制的编码核苷酸序列在植物中的根-特异性表达的启动子。
在本发明的上下文中，“功能性片断”被理解为尽管核苷酸序列有所不同，但仍具有所需功能，例如启动子活性和组织或器官特异性的序列。测定启动子活性的方法包括例如，测定特定标记基因的表达率，所述标记基因处于本发明启动子的调节控制之下。适当标记基因是例如大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因或绿色荧光蛋白(GFP)基因(Baulcombe等，植物杂志，7(16)(1993)，1045-1053)。通过比较上述标记基因在植物各个组织或器官中的表达率，易于确定器官和组织特异性。在本发明的意义上，启动子序列的功能性片断含有本文所述序列的天然变体，以及通过例如化学合成得到的人工核苷酸序列。
特别是，功能性片断也可以是原始分离的启动子序列的天然或人工突变体，该突变体也表现出所需的功能。突变包括取代，添加，缺失，交换和/或插入一个或多个核苷酸残基。因此，本发明也包括通过修饰SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQID No.5或SEQ ID No.6所示的核苷酸序列而得到的核苷酸序列。所述修饰的目的可以是例如进一步界定其中所含的启动子序列，或者导入其它限制性位点。
启动子序列的功能性部分也包括启动子变体，其启动子活性相对于野生型而言有所降低或增加。
理论上，真核RNA聚合酶II启动子的活性是由多种反式作用因子(DNA结合蛋白)的协同相互作用导致的，所述因子与启动子上存在的多种顺式调节的DNA元件结合。这些因子直接或间接地与基本转录机上的单个或几个因子相互作用，最终导致转录起始位点附近形成前起始复合物(Drapkin等，最新细胞生物学观点5(1993)，469-476)。可将其称为真核RNA聚合酶II启动子的组件建立(modular set-up)，其中多种顺式-元件(组件)作为部分组分各自决定着启动子的总活性(Tjian和Maniatis，细胞77(1994)，5-8)。通过例如用花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子进行启动子研究，阐明了组件建立(Benfey和Chua，科学250(1990)，959-966；Benfey等，EMBO J.9(1990)，1677-1684；Benfey等，EMBO J.9(1990)，1685-1696)。由于-343至+8(相对于转录起始位点而言)启动子的不同限制性亚片断在转基因烟草植物中介导不同的组织特异性，可将启动子分为6个亚-结构域。因此，完整启动子介导的强组成型表达可被分为组织-特异性的部分活性。
通过例如与基本启动子报道基因盒融合，可鉴定本发明启动子的单个亚-结构域，该结构域能介导潜在的组织特异性。基本启动子是含有TATA盒或起始子序列(Smale和Baltimore，细胞57(1989)，103-113；Zawel和Reinberg，Proc.Natl.Acad.Sci.44(1993)。67-108；Conaway和Conaway，生物化学年评，62(1993)，161-190)的DNA序列，所述TATA盒位于转录起始位点上游约20至30个碱基对。基本启动子是例如-63至+8Δ35S启动子(Frohberg，FU BerlinFB Biologie的论文(1994))，-332至+14基本patatin I类启动子以及-176至+4基本PetE启动子(Pwee等，植物杂志，3(1993)，437-449)。
另外，也可以通过缺失分析和/或诱变(Kawagoe等，植物杂志，5(6)(1994)，885-890)来鉴定本发明启动子的亚-结构域或顺式-元件。通过检测转化细胞中的报道基因活性，可在植物中进行亚-结构域或顺式-元件的功能性试验。在本发明的上下文中，启动子序列的功能性部分也包括SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示核苷酸序列的亚-结构域和/或顺式-元件，它们能介导根特异性。
另外，利用多聚化可以显著增加亚-区域或顺式-元件的效力。对CaMV 35S启动子而言，长度为250bp的片断串联二聚化可导致启动子活性增加10倍(Kay等，科学230(1987)，1299-1302)。对CaMV 35S启动子的亚-结构域B5而言，当该结构域以四聚体而不是单聚体的形式存在时，启动子构建体的活性显著增加(Benfey等，EMBO J.9(1990)，1685-1696)。在另一个实施方案中，本发明特别地涉及SEQID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示核苷酸序列的亚-结构域和/或顺式-元件的二-和多聚体。
在本发明的另一个实施方案中，启动子活性相对于野生型而言的增加可通过联合使用本发明的启动子和所谓的增强子而获得。
在文献中，已描述了多种增强子，它们通常导致组织-特异性的表达增加，其中组织特异性通常由所用的相关增强子来决定(Benfey等，科学250(1990)，959-966；Benfey等，EMBO J.8(1989)，2195-2202；Chen等，EMBO J.7，(1988)，297-302；Simpson等，自然323(1986)，551-554)。
另外，有一些增强子，例如PetE增强子(Sandhu等，植物分子生物学37(1998)，885-896)不具有组织-特异性效果，因此将其置于本发明启动子之前，作为纯粹的定量增强子元件，以增加根中的表达而不改变本发明启动子的组织特异性。
基于特定盒(BoxII)多聚化的根-特异性增强子描述于例如“T-DNA基因5生长素调节启动子的DNA-蛋白质相互作用”(作者SirpaNuotio，Acta Univeritatis Ouluensis，A Scientiae RerumNaturalium 299(1997)，Oulu大学出版社，pp.38)。另外，也可使用合成的增强子，它可衍生自例如天然增强子和/或可通过多种增强子的组合来获得。
本发明还涉及启动子，其具有能与SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列，并可导致由所述启动子控制的编码核苷酸序列在植物中的根-特异性表达。优选所述序列在严紧条件下与SEQID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示序列杂交。
术语“严紧条件”优选指如Sambrook等(分子克隆，实验室手册，第2版(1989)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)所述的杂交条件。尤其指在下列条件下发生杂交杂交缓冲液2xSSC；10xDenhardt’s溶液(Fikoll 400＋PEG＋BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鲱精DNA；50μg/ml tRNA；或0.25M磷酸钠缓冲液，pH7.2，1mMEDTA，7％SDS杂交温度T＝65至68℃；洗涤缓冲液0.2xSSC；0.1％SDS；洗涤温度T＝65至68℃。
优选启动子与SEQ ID No.1所示启动子序列或其部分的序列同一性至少为30％，优选至少为40％，优选至少为50％，特别优选至少为60％，更特别优选至少为70％，甚至更优选至少为80％，优选至少为90％，最优选至少为95％。优选通过与SEQ ID No.1所示核苷酸序列进行比较来测定该启动子序列的序列同一性。如果比较的两个序列具有不同的长度，优选序列同一性指的是较短序列中与较长序列的核苷酸残基相同的核苷酸残基所占的百分比。通过使用计算机程序，例如Bestfit程序(威斯康星序列分析包，版本8 for Unix，Genetics ComputerGroup，University Research Park，575 Science Drive Madison，WI 53711)可以方便地测定序列同一性。Bestfit使用Smith和Waterman，应用数学进展2(1981)，482-489的局部同源性算法寻找两个序列之间序列同一性最高的区段。当使用Bestfit或另一个序列算法程序来测定例如特定序列是否与本发明的参照序列95％相同时，优选将参数调节为在全长参照序列的基础上计算同一性的百分比，同源性缺口可以占参照序列核苷酸总数的5％。当使用Bestfit时，优选使所谓的任选参数保持为其缺省值。比较给定序列与本发明的上述序列时出现的偏差可能是例如由添加，缺失，取代，插入或重组引起的。按上述与SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ IDNo.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示序列杂交，或表现出与SEQID No.1的序列同一性的启动子序列优选源自植物，优选源自高等植物，特别优选源自双子叶植物，最优选源自番茄属植物。
在本发明优选的实施方案中，本发明的启动子具有SEQ IDNo.3(约1.4kb片断)，SEQ ID No.4(约1.1kb片断)，SEQ IDNo.5(0.9kb片断)或SEQ ID No.6(0.55kb片断)所示的完整序列。
另外，本发明还涉及启动子，其表现出所述序列的功能性部分，并导致由所述启动子控制的编码核苷酸序列在植物中的根-特异性表达。
在本发明优选的实施方案中，本发明的启动子具有SEQ IDNo.4(1.1kb片断)所示的完整序列或其功能性部分。
不必受某些理论的束缚，可假定SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示启动子源自属于一组伸展蛋白-样蛋白质的植物基因。
因此，本发明还涉及编码蛋白质，优选为一组伸展蛋白-样蛋白质的基因的启动子，所述蛋白质表现出的与SEQ ID No.8所示完整氨基酸序列的同源性，即同一性至少为60％，优选至少为70％，更优选至少为80％，特别优选至少为90％，最优选至少为95％，其中这些启动子导致由所述启动子控制的编码核苷酸序列在植物中的根-特异性表达。
在特别优选的实施方案中，本发明涉及编码蛋白质的基因的启动子，所述蛋白质具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列，其中所述启动子导致由所述启动子控制的编码核苷酸序列在植物中的根-特异性表达。
SEQ ID No.7所示的氨基酸序列编码番茄的多肽(SEQ ID No.8)，假定该多肽属于一组伸展蛋白-样蛋白质。
在本发明的上下文中，伸展蛋白-样蛋白质是植物蛋白质，其氨基酸序列表现出至少一个下列序列基元SPPPPP，SPPPPYY，SPPPPY，SPPPPVY，PPPPPYY，PPPPPSY，PPPPPTY，PPPPPAY，PPPPPEY，PPPPPXY，SOOOO，SPPPPKH，SPPPPKK，SPPPPKKPYYPP，SPPPPSP，SPPPPSPKYVYK，SPPPPSPSPPPP，SPPPPYYYH，SPPPPYYYK，SOOOOTOVYK，SPPPPTPVYK，SOOOOVYK，SPPPPVYK，SPPPPVYSPPPP，SPPPPVHSPPPPVA，SPPPPVK，SPPPPVKSPPPP，SOOOOVKP。
在本发明意义上，包含在SEQ ID No.8中的，表现出至少一个SPPPP-和/或(P)PPPPYY-基元的植物蛋白质被称为伸展蛋白-样蛋白质。
例如，利用基于-计算机的与已知序列的序列比较，或者也通过用SEQ ID No.7所示序列或其部分筛选例如cDNA或基因组文库，即可鉴定与SEQ ID No.7所示序列具有同源性的DNA序列。所述技术是本领域技术人员已知的(见Sambrook等，文献同上)。基于计算机的序列比较也可在氨基酸水平上，用SEQ ID No.8所示氨基酸序列或其部分进行。
细胞壁影响细胞的形态和功能。细胞壁的蛋白质组分含有酶和结构蛋白。已被详尽阐明的细胞壁结构蛋白包括所谓的伸展蛋白(Cassab和Varner，植物生理学和植物分子生物学年评，39(1988)，321-353；Showalter，植物细胞5(1993)，9-23)。伸展蛋白属于富含羟脯氨酸的糖蛋白(HRGP)家族。迄今为止，已从胡萝卜(Chen和Varner，EMBOJ.4(1985)，2145-2151)，蚕豆(Corbin等，分子细胞生物学7(1987)，4337-4344)，油菜子(Evans等，Mol.Gen.Genet.223(1990)，273-287)，番茄(Showalter等，植物分子生物学，16(1991)，547-565)和烟草(Memelink等，EMBO J.6(1987)，3579-3583)中鉴定出编码伸展蛋白的基因和cDNA。伸展蛋白的基因表达为发育-依赖型，相对于组成型调节而言，它更可能受组织-特异性调节(Sommer-Knudsen等，植物化学47(1998)，483-497；Ye等，植物细胞3(1991)，23-37)。在比较不同植物的不同伸展蛋白基因的组织特异性时，发现伸展蛋白基因的表达模式根据所分析的植物的种，细胞类型和组织类型的不同而明显不同(Showalter等，植物分子生物学19(1992)，205-215)。
在大豆中，HRGP在分生细胞中表达得最集中。烟草的HRGPnt3-基因在中柱鞘和内皮层中表达，尤其是可在参与形成侧根的特定细胞中表达(Keller等，Proc.Nat.Acad.Sci.86(1989)，1529)。
已描述伸展蛋白的基因表达可受环境因子的调节，如光，病原体侵扰，创伤，热应力(参见例如Cassab和Varner，植物生理学和植物分子生物学年评39(1988)，321-353；Cortin等，分子细胞生物学7(1987)，4337-4344；Niebel等，植物细胞5(1993)，1697-1710)。然而，并不是所有伸展蛋白都适用这一原则(Sommer-Knudsen等，植物化学47(1998)，483-497)。
成熟的伸展蛋白通常富含羟脯氨酸(Hyp)，丝氨酸和氨基酸缬氨酸，酪氨酸，赖氨酸和组氨酸的特定组合。通常，伸展蛋白一级结构(有关综述可参见例如Sommer-Knudsen等，植物化学47(1998)，483-497)的特征在于至少一个Ser-Pro3-6-肽单位，该单位也可重复出现或与类似序列，如下列序列基元相连SOOOO，SPPPPKH，SPPPPKK，SPPPPKKPYYPP，SPPPPSP，SPPPPSPKYVYK，SPPPPSPSPPPP，SPPPPYYYH，SPPPPYYYK，SOOOOTOVYK，SPPPPTPVYK，SOOOOVYK，SPPPPVYK，SPPPPVYSPPPP，SPPPPVHSPPPPVA，SPPPPVK，SPPPPVKSPPPP，SOOOOVKP(也参见Sommer-Knudsen等，文献同上)。
伸展蛋白经受强烈的翻译后修饰。例如，对胡萝卜的伸展蛋白而言，大多数脯氨酸残基被脯氨酰-羟化酶羟化。羟脯氨酸残基可用作糖基化的靶(Lamport等，生物化学杂志133(1972)，125-132；vanHoist，植物生理学，74(1984)，247-251)。糖类，尤其是半乳糖和阿拉伯糖(Smith等，植物化学25(1986)，pp.1021；Holst等，植物生理学，74(1984)，247；Smith等，植物化学23(1984)，1233)可用于稳定蛋白质(showalter，植物细胞5(1993)，9-23)。阿拉伯糖主要以Hyp-Ara1-4的形式出现，半乳糖以Ser-Gal的形式出现。
另外，已讨论了多种伸展蛋白经由异二酪氨酸键的连接，这种连接可导致例如细胞壁的进一步强化以作为抵抗病原体进攻的反应(Brisson，植物细胞6(1994)，1703-1712；Epstein，植物化学23(1984)，1241-1246)。可在伸展蛋白中检测到分子内的异二酪氨酸键(Epstein等，植物化学，23(1984)，pp.1241)。然而，仅能在体外检测到分子间的异二酪氨酸键(Everdeen等，植物生理学，87(1988)，pp.616；Huystee等，植物生理学和生物化学，33(1995)，pp.55)。
利用脯氨酸类似物3，4-脱氢-L-脯氨酸(Dhp)，可以选择性抑制脯氨酰-羟化酶，以利用Dhp降低羟脯氨酸的生物合成。用Dhp处理胡萝卜(Daucus carota)的根切片之后，可证实它们合成了结构被修饰的HRGP。用Dhp处理烟草原生质体也导致具有经修饰结构的细胞壁的再生(Cooper，植物生理学，104(1994)，747-752)。
本发明还涉及含有本发明启动子的表达盒。术语“表达盒”涉及本发明启动子与需表达的核酸序列的组合。该核酸序列可以是例如编码多肽，即结构基因的序列。它可以在有义或反义方向上与启动子相连。核酸序列也可编码不可翻译的RNA，例如反义-RNA或核酶。这些核酸序列可与本发明的启动子联合使用，以产生具有经修饰(优选为经改良)表型的植物。另外，利用本发明的启动子可影响根中的植物代谢。目的在于操纵转基因植物代谢流程的异源(过量)表达和反义-抑制的一些例子概述于Herbers和Sonnewald(TIBTECH 14(1996)，198-205)。核酶的例子公开于Feyter(Mol.Gen.Genet.250(1996)，329-228)。可利用本发明启动子和载体产生的转基因植物的多种可能的应用也描述于TIPTEC植物产物&作物生物技术13(1995)，312-397。
本发明的表达盒可进一步含有转录终止序列，其位于与启动子连接的核酸序列的3’末端下游。在本发明的上下文中，“转录终止序列”是位于编码基因区域的3’末端，并能导致转录终止，任选导致polyA-尾合成的DNA序列。这种终止序列的例子是章鱼氨酸合酶基因的终止序列。
根据本发明，在启动子和核酸序列和/或核酸序列和终止子之间有一个或多个限制性位点。
另外，本发明涉及含有至少一个本发明启动子的载体。
在优选的实施方案中，该载体中的本发明启动子与多接头相连，所述多接头允许将任何序列整合至启动子的下游。在本发明的上下文中，“多接头”是含有至少一个限制性酶(优选为两个或多个限制性酶)识别序列的DNA序列。
在特别优选的实施方案中，本发明的载体在启动子和/或多接头的下游还含有终止转录的序列，例如章鱼氨酸合酶基因的终止序列。
本发明还涉及含有本发明表达盒的载体。本发明的载体含有选择标记较为有利，该选择标记适于鉴定和选择含有本发明载体的细胞。
在优选的实施方案中，本发明的载体适于转化植物细胞，特别优选其适于将外源DNA整合至植物基因组。所述载体包括例如部分可商购的二元载体。
本发明还涉及用本发明的启动子，或本发明的表达盒或载体进行基因工程改造所得的宿主细胞。
在本发明的上下文中，“经基因工程改造”指的是宿主细胞含有优选稳定整合至基因组的本发明启动子，或本发明的表达盒或载体，启动子或表达盒作为外源DNA被导入宿主细胞或该细胞的祖代细胞。这意味着本发明的细胞自身可以是转化事件的直接产物，或是由含有本发明启动子或本发明表达盒的细胞繁殖得到的细胞。原核(特别是细菌)以及真核细胞都可以用作宿主细胞。真核细胞可以是例如真菌细胞，尤其是糖酵母属的细胞，优选为酿酒酵母细胞。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的载体，本发明的表达盒或本发明的宿主细胞用于转化植物，植物细胞，植物组织或部分的用途。
在特别优选的实施方案中，本发明的宿主细胞是植物细胞，下文将称之为转基因植物细胞。
另外，本发明还涉及含有本发明植物细胞的植物。它们可属于任何植物的种，属，科，目或纲。它们可以是单子叶植物和双子叶植物。优选本发明的植物是有用的植物，即在农业，林业和/或园艺方面对人有价值的植物。在本发明的上下文中，在农业上有用的植物如谷类植物(如小麦，燕麦，大麦，黑麦)，玉米，水稻，马铃薯，萝卜，烟草，甘蔗，甜菜，向日葵，香蕉，油菜或草料或牧草(如苜蓿，白苜蓿，红苜蓿)，亚麻，棉花，小米，蚕豆，豌豆等，蔬菜植物(如番茄，黄瓜，courgette，茄子，甘蓝类，洋蓟，菊苣等)，果树，蛇麻草，wine等。草本植物和药用植物也是有价值的，例如长春花，曼陀罗，红豆杉，三角叶薯蓣，罂粟，颠茄，蛇根木，天仙子；狭叶毛地黄，洋金花，毛地黄，Pilocarpus jaborandi，金鸡纳树，乌头。
在另一个实施方案中，本发明还涉及生产转基因植物的方法，其特征在于用本发明的载体，或本发明的表达盒，或本发明的微生物转化植物细胞，组织或部分或原生质体，在生长培养基中培养经转化的植物细胞，组织或部分或原生质体，并任选由培养物再生植物。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的载体，本发明的表达盒或本发明的宿主细胞利用毛根农杆菌生产转基因毛根的用途。
可根据本领域技术人员已知的方法生产本发明的植物，例如通过转化植物细胞或组织，并由经转化的细胞和/或组织再生整个植物。可以使用多种技术将DNA导入植物宿主细胞。这些技术包括使用根瘤农杆菌或毛根农杆菌作为转化剂，用T-DNA转化植物细胞，原生质体融合，DNA注射，DNA电穿孔，利用biolistic法导入DNA以及其它方法。优选使用农杆菌-介导的转化来转化植物细胞和植物，优选为双子叶植物的方法已深入分析并详细描述于EP0120516；Hoekema(二元植物载体系统，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第V章)；Fraley等(Crit.Rev.Plant Sci.4(1993)，1-46)和An等(EMBO J.4(1985)，277-287)。有关马铃薯的转化，可参见例如Rocha-Sosa等(EMBO J.8(1989)，29-33)。
利用基于-农杆菌的载体转化单子叶植物也已被描述(Chan等，植物分子生物学，22(1993)，491-506；Hiei等，植物杂志，6(1994)，271-282；Deng等，中国科学33(1990)，28-34；Wilmink等，植物细胞报道11(1992)，76-80；May等，Bio/Technology 13(1995)，486-492；Conner和Domisse，国际植物科学杂志，153(1992)，550-555；Ritchie等，转基因研究，2(1993)，252-265)。另一种单子叶植物转化系统是利用biolistic法进行转化(Wan和Lemaux，植物生理学，104(1994)，37-48；Vasil等，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等，植物分子生物学，24(1994)，317-325；Spencer等，应用遗传学理论，79(1990)，625-631)，原生质体转化，电穿孔部分透化的细胞或利用玻璃纤维导入DNA。对玉米的转化描述于不同时间的文献中(如WO95/06128，EP0513849，EP0465875，EP0292435；Fromm等，生物技术8(1990)，833-844；Gordon-Kamm等，植物细胞2(1990)，603-618；Koziel等，生物技术11(1993)，194-200；Moroc等，应用遗传学理论，80(1990)，721-726)。
对其它谷类植物的成功转化也已被描述，例如大麦(Wan和Lemaux，文献同上；Ritala等，文献同上；Krens等，自然296(1982)，72-74)和小麦(Nehra等，植物杂志，5(1994)，285-297)。
已描述了多种适用于转化水稻的方法，例如农杆菌-介导的转化(Hiei等，植物杂志，6(1994)，271-282；Hiei等，植物分子生物学，35(1997)，205-218；Park等，植物生物学杂志，38(1995)，365-371)，原生质体转化(Datta，″植物基因转移″，Potrykus，Spangenberg(编)，Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg，1995，66-75；Datta等，植物分子生物学，20(1992)，619-629；Sadasivam等，植物细胞再生，13(1994)，394-396)，植物转化所用的biolistic法(Li等，植物细胞再生，12(1993)，250-255；Cao等，植物细胞再生，11(1992)，586-591；Christou，植物分子生物学，(1997)，197-203)以及电穿孔(Xu等，″植物基因转移″，Potrykus，Spangenberg(编)，Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg，1995，201-208)。
另外，本发明还涉及本发明植物的繁殖和收获材料，所述植物含有本发明的植物细胞。在本发明的上下文中，术语“繁殖材料”包括适用于通过无性或有性的方法产生后代的植物部分。适用于无性繁殖的植物部分是例如插条，愈伤组织培养物，根茎，根状茎或块茎。其它繁殖材料包括例如果实，种子，幼苗，原生质体，细胞培养物等。优选繁殖材料是块茎和种子。
本发明还涉及鉴定和分离启动子的方法，所述启动子可导致由其控制的编码核酸序列在植物中的根-特异性表达，所述方法包括下列步骤a)使植物基因组文库与编码伸展蛋白-样蛋白质的eDNA杂交；b)分离阳性克隆；c)检测分离克隆的启动子活性。
优选在严紧条件下发生步骤a)中进行的杂交。为此，使用编码伸展蛋白-样蛋白质或其部分的已知序列与相应的文库杂交，优选在严紧条件下进行杂交。优选使用SEQ ID No.7所示序列或其部分。所用方法是本领域技术人员已知的，并详细描述于Sambrook等(文献同上)。
如上所述，在本发明意义上，伸展蛋白-样蛋白质是氨基酸序列表现出至少一个下列序列基元的蛋白质SPPPPP，SPPPPYY，SPPPPY，SPPPPVY，PPPPPYY，PPPPPSY，PPPPPTY，PPPPPAY，PPPPPEY，PPPPPXY，SOOOO，SPPPPKH，SPPPPKK，SPPPPKKPYYPP，SPPPPSP，SPPPPSPKYVYK，SPPPPSPSPPPP，SPPPPYYYH，SPPPPYYYK，SOOOOTOVYK，SPPPPTPVYK，SOOOOVYK，SPPPPVYK，SPPPPVYSPPPP，SPPPPVHSPPPPVA，SPPPPVK，SPPPPVKSPPPP，SOOOOVKP，所述蛋白质表现出的与SEQ ID No.7所示编码区的同源性至少为60％，优选至少为70％，优选至少为80％，特别优选至少为90％，最优选至少为95％。可根据本领域技术人员已知的，详细描述于Sambrook等(文献同上)的方法，来进行步骤b)中所述的阳性克隆的鉴定和启动子序列的分离。
可利用报道基因实验来分析分离的启动子的表达特性。为了检测步骤c)中所述的分离的启动子序列在根细胞中的启动子活性，例如，可在植物转化所用表达盒或载体中使启动子与报道基因，如大肠杆菌的β-葡糖醛酸酶基因可操作相连。使用该构建体转化植物。随后，通过例如Martin等(GUS报道基因系统可用作研究植物基因表达的工具，GUS法使用GUS基因作为基因表达的报道基因，Academic出版社(1992)，23-43)所述，测定β-葡糖醛酸酶的器官-特异性表达。选择表现出根特异性的启动子，然后分离该启动子。
在本发明的上下文中，可操作相连是启动子，编码序列，终止子，任选包括其它调节元件的依次排列，使得所述的每个元件都能在基因表达的过程中根据需求完成其功能。
本发明还涉及本发明的启动子或利用本发明的方法鉴定的启动子在植物中根-特异性地表达转基因的用途。
在本发明的上下文中，术语“转基因”指的是人工导入植物的DNA序列。
这些和其它实施方案是公开的，对本领域技术人员而言也是显而易见的，其包含在本发明的描述和实施例中。可在本发明意义上使用的，关于上述方法，工具和用途之一的其它文献可得自现有技术，例如可借助于电子工具得自公共图书馆。为此，可使用公共数据库，如“Medline”，可经由国际互联网进入此数据库，地址为http//www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html。其它数据库和地址是本领域技术人员已知的，并可得自国际互联网，例如，地址为http//www.lycos.com。有关生物技术专利和/或专利申请的来源和信息的综述可参见Berks，TIBTECH 12(1994)，352-364。
下列实施例将阐明本发明。实施例1分离根-特异性基因植物材料和根毛的提取将生长在温室地中的番茄植物，即番茄品种Moneymaker的多个器官用作植物材料。为了提取根和根毛，在无菌条件下将8000个表面-灭菌的种子置于培养皿中，放在纸上的金属格内(No.0858，Schleicher & Schuell，德国)。在此之前，用0.5xHoagland’s溶液将纸弄湿。于22℃，以16小时/8小时的光照/黑暗周期使种子萌发。萌发后第3天，通过推动金属格和纸之间的无菌玻璃珠，将金属格往上提，使其比纸高约4mm。这样可以使幼苗的根垂直生长，并使根毛形成最优化。第5天，将幼苗与金属格一起浸入液氮中，用抹刀从金属格中剥下根。然后在液氮中从根上刷下根毛，通过250μm筛的滤器纯化根毛，按Rohm和Werner(Physiologia Plantarum 69(1987)，129-136)所述进行分析。
为了对不同龄的幼苗根进行Northern印迹分析，按上述将幼苗保温7，14和18天，相应地进行根的分离。为了分离在土壤中生长的植物根毛，从温室土壤中取出含有密集生长的幼苗的植物盆。用镊子收集在侧面土壤表面生长的根，立即置于液氮中冷冻。为了进行光照/黑暗试验，按上述将幼苗保温于16小时/8小时暴露的光照/黑暗周期。在白天周期开始后暴露4小时之后收获7-天龄的根。平行地，在总是黑暗的环境中将幼苗保温7天，收获它们的根。按Pena-Cortes等(植物186(1992)，495-502)所述使番茄叶受伤，24小时之后收获受伤的叶。将未-受伤的叶用作对照。RNA提取和cDNA文库的构建根据Verwoerd等(核酸研究17(1989)，2362)所述的方法，提取所述器官的总RNA。通过使用磁性寡dT珠(Dynabeads，Dynal，德国)，用7-60μg根毛总RNA分离poly(A)+RNA。使用700ng poly(A)+RNA生产双链cDNA(Pharmacia，德国)。结合EcoRI/NotI接头之后，将cDNA克隆至表达载体λZAPII(Stratagene，德国)。使用Stratagene(德国)的Gigapack II Gold包装提取试剂盒将其包装至λ噬菌体。示差筛选根毛-特异性cDNA文库将500,000个包装于噬菌体中的cDNA铺于琼脂平皿中的YT琼脂上，并根据标准方法(Sambrook等(1989)，分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港出版社，冷泉港，纽约)，用680ng得自根毛或刷下的根的经放射性标记的逆转录mRNA进行筛选。对100个推定的阳性噬斑进行第二次筛选以避免人为假象。最后，将76个阳性噬斑用于体内切除。于28℃，在96孔微滴板的2xYT培养基(Sambrook等，文献同上)中将所得细菌培养物振荡过夜。使用如Bucher等(植物分子生物学35(1997)，497-508)所述的一种反向Southern法，将得自上述培养物的质粒DNA用于第二次筛选。用EcoRI消化有希望的质粒之后，分离相应的插入物，将其用于Northern印迹分析。Northern印迹分析和DNA测序乙二醛化之后，将5-10μg得自所述器官的总RNA上样于1.2％琼脂糖乙二醛凝胶(Hull(1985)，关于植物病毒的病毒纯化，生物物理和生物化学特征的鉴定，Mahy编，病毒学，操作方法，IRL出版社，牛津，英国，pp.1-24)。Northern印迹分析和杂交条件取自标准方法(Sambrook等，文献同上)。于68℃杂交印迹。使用LeExtl cDNA作为放射性探针来检测LeExt1 mRNA。最后一次于68℃，用0.1xSSC洗涤印迹。洗涤之后，于-80℃将印迹暴露于X-射线胶片(Kodak，德国)。通过与乙二醛化的标记DNA(BRL，德国)进行比较，测定转录物的大小。结果示于

图1和2。
通过使用双脱氧测序法，用T7 DNA聚合酶(Amersham，德国)对LeExt1 cDNA(＝SEQ ID No.7)进行测序。利用威斯康星大学的GCG程序包进行序列分析(Devereux等，一套全面的VAX序列分析程序核酸研究12(1984)，387-395)。实施例2分离含有根-特异性基因的启动子区域的基因组片断用经放射性标记的LeExt1 cDNA筛选番茄的基因组DNA文库(Clontech Laboratories，美国)(参见实施例1)。将500,000个噬斑形成单位(PFU)的DNA文库铺于琼脂平皿中的YT琼脂上，37℃保温6至8小时，转移至尼龙膜(Hybond N，Amersham，德国)(Sambrook等，文献同上)。杂交条件取自标准方法(比活性，Sambrook等，文献同上)。从第一次筛选中选择出30个噬斑用于第二轮筛选。在第二轮筛选之后，将选定的2个噬斑的噬菌体悬浮液再次铺板，产生噬菌体裂解物。根据Lockett(分析生物化学185(1990)，230-234)所述，由这些噬菌体裂解物制备λDNA。用多种限制性酶消化600ng各种λDNA，使用溴化乙锭在琼脂糖凝胶上显现出所得片断。用经放射性标记的LeExt1 cDNA进行Southern印迹杂交(Sambrook等，文献同上)之后，分离出长度约为3.4kb，与LeExt1 cDNA杂交的基因组片断，将其克隆至也用Asp718消化的pBluescript II SK-质粒。首先，通过使用T7 DNA聚合酶(Amersham，德国)的双脱氧测序法，对片断进行部分测序。发现基因组片断与LeExt1 cDNA序列重叠204个碱基对，并进一步将5’上游延伸至LeExt1基因的非-编码区。随后，对基因组片断(约3.4kb)的两条链进行测序(SEQ ID No.13)。实施例3产生GUS表达盒以分析启动子的功能性总共产生了3个不同的GUS表达盒。
A.3.4kb的基因组片断与GUS盒的翻译融合，其中片断含有约200个碱基对长的LeExt1 cDNA编码序列。通过KpnI消化从pBluescriptII SK-质粒上切下基因组片断，通过使用T7 DNA聚合酶的补平反应使其成为平端(Ausubel等，最新分子生物学方法，John Wiley & Sons，Inc.，纽约，1998)，并克隆至经SmaI消化和去磷酸化的二元载体pBIl01.3(Clontech，美国)。pBIl01.3是含有GUS盒的质粒，其中不含二元载体pBIN19的启动子。该构建体被称为roh1。
B.经修饰的基因组片断与GUS盒的转录融合。使用含有SalI限制性位点的寡核苷酸42trx3(5’-GAGAGTCGACGATATCGGGCGAATTGGGTACC-3’，SEQ ID No.9)，和含有XbaI限制性位点的42trx4(5’-GAGATCTAGAGGTACCGGACTTTATATAACATAAC-3’，SEQ ID No.10)，使用Taq DNA聚合酶[Fermentas，Lithuania]，经PCR合成长度为3200bp的基因组片断，该片断缺乏与LeExt1 cDNA重叠的ORF(开放阅读框)，所述PCR的每轮循环的条件是94℃30秒解链DNA，60℃1分钟退火引物，72℃1分钟合成DNA，3秒延伸。用SalI和XbaI消化片断，克隆至经相应消化和去磷酸化的pBluescript II SK-质粒。从大肠杆菌DH5α培养物(Sambrook等，文献同上)中分离质粒之后，通过SalI/XbaI消化分离片断，通过使用T7 DNA聚合酶的补平反应使其成为平端。然后将末端产物克隆至经SmaI消化和去磷酸化的二元载体pBI101.3。此构建体被称为rohtrx。
C.利用下列引物产生约3270bp的PCR产物42Xba(5’-GAGATCTAGACCATGGAGAAGAATTGG-3’，SEQ ID No.11)和42Sa1(5’-GAGAGTCGACGGGCGAATTGGGTACCG-3’，SEQ ID No.12)。PCR条件是利用Pfu DNA聚合酶(Stratagene，德国)，94℃20秒解链DNA，50℃45秒退火引物，72℃2分钟合成DNA。根据厂商的说明(Stratagene，德国)将PCR产物直接克隆至质粒pCR-Script。经SalI/NotI消化之后，用Klenow酶使PCR产物的末端成为平端[Sambrook，1989#68]，并克隆至经SmaI消化和去磷酸化的pBluescript II SK-质粒。制备质粒(Sambrook，文献同上)之后，用BstXI消化质粒并线性化。根据厂商[Fermentas，Lithuania]提供的方法，用外切核酸酶III和S1核酸酶从5’末端连续截短PCR产物，产生了约具有下列长度的截短的基因组片断2.2kb，1.7kb，1.4kb，1.1kb，0.9kb和0.55kb。使用SacI分离质粒5’-AKT1-320.X(Lagarde等，植物杂志，9(1996)，195-203)中的AKT1-GUS-3’NOS盒，利用绿豆核酸酶(New Englands BioLabs Inc.，Bioconcept，瑞士)处理使末端成为平端，然后用NcoI消化。将通过此方法得到的GUS-3’NOS盒克隆至经NcoI/EcoRV消化并去磷酸化的pBluescriptII SK-质粒，所述质粒含有截短的基因组片断。通过用SacI和SalI消化从每个质粒中分离通过此方法得到的启动子-GUS-3’NOS盒，将其克隆至经SacI/SalI消化并去磷酸化的二元载体Bin19(Bevan等，核酸研究12(1984)，8711)。所得构建体被称为BIN-Δgenx-GUS，其中x表示片断的相应长度2.2kb(SEQ ID No.1)，1.7kb(SEQ IDNo.2)，1.4kb(SEQ ID No.3)，1.1kb(SEQ ID No.4)，0.9kb(SEQID No.5)或0.55kb(SEQ ID No.6)。
另外，按RochaSosa等(EMBO J.8(1989)，23-29)所述进行马铃薯的转化。
按Omirulleh等(″植物的基因转移″，Potrykus，Spangenberg(编)，Springer Verlag，Berlin，Heidelberg，1995，pp.99)所述转化玉米。
另外，通过电穿孔(Jung等，生物技术通讯，14(1992)，695-700)将上述构建体导入毛根农杆菌菌株15834，随后，根据Toivonen等(植物细胞组织器官培养18(1988)，pp.79)的说明，利用毛根农杆菌将上述构建体转化至长春花中。可在毛根中检测到GUS的强表达。按Christou(植物分子生物学，35(1997)，197-203)所述，利用颗粒轰击转化水稻。实施例5LeExt1启动子活性的组化定位用0.1％X-gluc溶液(预先将0.1g X-gluc溶解于1ml二甲基甲酰胺中，加入1ml 10％Triton和5ml 1M磷酸钠缓冲液，pH7.2，补加蒸馏水至总体积为100ml)真空-浸润植物材料，37℃保温过夜。染色之后，在乙醇∶醋酸(3∶1)中固定植物，并在100％乙醇中脱色。结果，植物的绿色部分变成无色，而蓝色部分保持稳定；参见图3。实施例6分析启动子的特异性和活性为了分析启动子的特异性，根据Jefferson等(EMBO J.6(1987)，3901-3907)所述的方法，与根中的活性相比较来测定马铃薯和番茄植物叶中的GUS活性。在番茄中，根中的GUS活性比成熟叶中的活性高20至300倍。所检查的大多数GUS-阳性马铃薯植物根中的GUS活性高，但成熟的叶中没有GUS活性。为了测定启动子的活性，将GUS活性与35S启动子的活性相比较。具有最高启动子活性的品系表现出的活性约为CaMV 35S启动子活性的一半。
序列表<110> ETH ZrichRIESMEIER，JrgWILLMITZER，Lothar<120> 植物根中基因表达所用的启动子<130> C 2645 PCT<140><141><160> 13<170> PatentIn Ver.2.1<210> 1<211> 2205<212> DNA<213> 番茄<400> 1aaagttatta acacaacttc catcacatta aagacatcat ttgataacat tcatgtcagc 60atacttatac taaagttgac gggcttcaat ataaaattaa taaggataaa ttttaagaat 120cacatagttt ttaactatga aattacaatc tattcgtctt tagtttgtaa ttacattaat 180accttaaaaa gcaataaaaa tcgattatat taatatgcag cttgaataca ttaaagagta 240tctcagatac attacaatat aaatcgggta aataatatgt agctcggata cattatatta 300ataagtagct tatatacaat aaagaaataa gagattttag aggtttatag aaatagaagg 360gaatattgaa aataaggaaa agaaaggtgt gtatttaagt attttttcca attaagaata 420catttttcac gaaagaggtg ttcaagccaa atgaaagaag attgggccac ccaaaaccca 480ataaaagagt ctaaaaagct gaacgcttta agtcaagagt tcctatttta aaagtttcct 540agtttaaaaa gtttgttagt ttaaaaagtt tcctagttaa agtttttcag ctttcttagt 600ttaatgtttc ctagtttaaa agttttcata aaagtaggat ttaaatcgag gaaaggctca 660aaataatctc tcatctttag gttaagactc aaagtgatcc ttaagttttc acatggagca 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Ser Val Gln Glu Glu Asn Tyr Lys Lys Val Pro Leu Ile Ser225 230 235 240Lys Leu Pro Ser Val Pro Lys Glu Glu Tyr Lys Val Pro Ser Leu Ser245 250 255Lys Lys Asp Tyr Tyr Lys Lys Pro Leu Val Ser Glu Asp Asn Tyr Lys
260 265 270Lys Val Ser Tyr Val Pro Lys Val Pro Ser Val Pro Lys Glu Glu Tyr275 280 285Lys Ala Pro Ser Leu Ser Lys Asn Asp Tyr Tyr Lys Lys Ser Ser Pro290 295 300Ser Pro Ser Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Tyr305 310<210> 9<211> 32<212> DNA<213> 人工序列<220> 人工序列的描述人工的<400> 9gagagtcgac gatatcgggc gaattgggta cc 32<210> 10<211> 35<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工的<400> 10gagatctaga ggtaccggac tttatataac ataac 35<210> 11<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工的<400> 11gagatctaga ccatggagaa gaattgg 27<210> 12<211> 27<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 人工序列的描述人工的<400> 12gagagtcgac gggcgaattg ggtaccg27<210> 13<211> 3259<212> DNA<213> 番茄<400> 13ggtaccattg tttctccatc aggccccttt ttcataggaa tagtaggacc atctaagact 60acactcaaga gatcaggatt ttctcctatc agatgatcca tcaagcgatt cttccaccat 120ccatagtatt ttccattgaa caatgggggc cgagtttgag aagctccttc ttggggggta 180ggtggtgctg ccatttaatt ttcaagatgt taatctttta gtgaaaagat cctgctctga 240taccaattga agaaacctta cccctaaatc aagaaccagg ttcttgattg tttgcctaag 300aaaagagtta attaaaacaa tatactttaa ctcaaacctt cctatctcaa cgaaggaaaa 360actcaacttc gttttattac tttttcttac tcaataataa ttttcgatta actctaatcg 420aattctctaa atttacaaaa agccaaaccc acttcttgca aacttactca ctaatctcct 480ctctccacaa gaagccaaac ccacttcttg tttacaatca cacaagctta agatcttact 540aagaacaaag ctcacaagtt aacaaaatac acagaactta gaaaaacgct ctttgctgcc 600tctctctttg tcttacctca ccctttcttt cattgcaaag aactgctctc tttgtcttga 660aatctctgtt tatatagact tttgaacaag agttatttcc tctctttgaa gttgataata 720attagatttc tgtatccttc tttgatatga aaaagaattg ctttcttttt tctgtttata 780cgcaaccttt tttgaaaagg ttttgtcttc atataaagta gacaactttt tcagaaaaga 840ttttatctta tttatttatg gaaataatta ttatattcat ttttttcatc aatacatttg 900tgccttaata tttgtccttc gcctcttttc aattagaacg acaactgctt taataaatga 960gcctggttca taagtgagtc aacatcaaaa gtatttgtca ttatcaatga acctggttca 1020tgattgatga catcaaaagt atttgtcatt ataaaaagtt attaacacaa cttccatcac 1080attaaagaca tcatttgata acattcatgt cagcatactt atactaaagt tgacgggctt 1140caatataaaa ttaataagga taaattttaa gaatcacata gtttttaact atgaaattac 1200aatctattcg tctttagttt gtaattacat taatacctta aaaagcaata aaaatcgatt 1260atattaatat gcagcttgaa tacattaaag agtatctcag atacattaca atataaatcg 1320ggtaaataat atgtagctcg gatacattat attaataagt agcttatata caataaagaa 1380ataagagatt ttagaggttt atagaaatag aagggaatat tgaaaataag gaaaagaaag 1440gtgtgtattt aagtattttt tccaattaag aatacatttt tcacgaaaga ggtgttcaag 1500ccaaatgaaa gaagattggg ccacccaaaa cccaataaaa gagtctaaaa agctgaacgc 1560tttaagtcaa gagttcctat tttaaaagtt tcctagttta aaaagtttgt tagtttaaaa 1620agtttcctag ttaaagtttt tcagctttct tagtttaatg tttcctagtt taaaagtttt 1680cataaaagta ggatttaaat cgaggaaagg ctcaaaataa tctctcatct ttaggttaag 1740actcaaagtg atccttaagt tttcacatgg agcactagta atctatcatg tttgcaatat 1800tggtacactt ttggtcctaa aaaaactcta acatacttca aaaataggta actaagaata 1860atactattga tatattacgc aaaataatcg atacaatttg tctaatctgt ttgaatttaa 1920aagaagaaaa ataaattgat tgttatagtt ataaacatat gattcctgag agataaaaga 1980aacaaaagga atcgtagtga atcattttaa tcaaataaaa agaaaatcga agataaatgt 2040tccacaaaga taaaatatca cgattttttt cataagccct tcaatattaa tcatttagtg 2100attgtttagg tgtatttgat ttatattgca gaagttttaa gctctaagta tgaatttttt 2160taatatcgga acttctaaaa tattttcaga aaattttcaa aataatttga tctactcaat 2220ttttttccgg tggggttcga tattcgggaa tgaagtaata tctcatacaa cacttttttc 2280tcaagactag atcatacggg acacaaattt gaattattat aattaataac caaaaatatg 2340aaaatatgac attaaaaaca atagcgtcta attattcccg ttggtatcat taactaatca 2400aacccaaaat attgtcattc ttggtgatga aaagtatgta tggtactcgc aagggtacgc 2460aaaataatcg atacaatttg tctaatctgt ttgaatttaa aagaagaaaa ataaattgat 2520tgctattgtt ataaacatat gattcctgag agataaaaga aataaagcga atcgtagtga 2580atcattttaa tcaaataaaa acaaactcgt agataaatgt tccacaaaga taaaatatta 2640cgattttttt cataagccct tcaatattca gtgaatcgat ttcttctatc aacgtttttt 2700cagttgattt gtcacaacgg agttgctcaa agcagctttt atatgatttg caagtaaatg 2760cacatgagca atttatcggc gggcacccga agaatagctt acccatttat ttttttaaaa 2820aaagattaag tacaatacca tgatgtggat tgtaagttgt gctcaacaag tacaaataat 2880taatcgacac caaataatgg acagtatttg ttaagcctac acatatctca acttttaaat 2940attaatttta tcaatttttc acaaccaaaa gaaatgaaca aacaacattc ttgcaagtca 3000acaaataatc gattcaaagt ttagaaatag gtgagtcaag caaatgtgta tgaatagttt 3060atgacttccc attatctcaa aaccaacctt agtggaacag cattaaccaa aaaacggctg 3120atatgtttgg attatttaat ttctaattta tcaaatcaca tgttagttat gttatataaa 3180gtcctaattc ctccattcta aaacacacaa gaaaaagaaa aacaaagata tatctagcct 3240tagaatccaa ttcttctca 3259
权利要求
1.选自下列的启动子a)启动子，其含有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示的核酸序列；b)启动子，其含有SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示核酸序列的功能性部分，并可导致由其控制的编码核苷酸序列在植物中的根-特异性表达；c)启动子，其具有能与SEQ ID No.1，SEQ ID No.2，SEQ ID No.3，SEQ ID No.4，SEQ ID No.5或SEQ ID No.6所示序列之一杂交的序列，并可导致由其控制的编码核苷酸序列在植物中的根-特异性表达；d)编码蛋白质的基因的启动子，所述蛋白质的氨基酸序列与SEQID No.8所示氨基酸序列具有至少60％同源性，其中这些启动子导致由其控制的编码核苷酸序列在植物中的根-特异性表达。
2.根据权利要求1的启动子，其为植物启动子。
3.表达盒，其含有根据权利要求1或2的启动子。
4.载体，其含有根据权利要求1或2的启动子或根据权利要求3的表达盒。
5.根据权利要求4的载体，其适用于转化植物细胞。
6.宿主细胞，所述细胞被根据权利要求1或2的启动子，根据权利要求3的表达盒或根据权利要求4或5的载体进行了基因工程改造。
7.根据权利要求6的宿主细胞，其为植物细胞。
8.毛根，其含有根据权利要求7的植物细胞。
9.植物，其含有根据权利要求7的植物细胞。
10.根据权利要求9的植物的繁殖或收获材料，所述植物含有根据权利要求7的植物细胞。
11.产生根据权利要求9的转基因植物的方法，其特征在于用根据权利要求4或5的载体，或根据权利要求3的表达盒，或根据权利要求6的宿主细胞转化植物细胞，组织或部分或原生质体，在生长培养基中培养经转化的细胞，组织，植物部分或原生质体，并任选由培养物再生植物。
12.鉴定和分离启动子的方法，所述启动子可导致由其控制的编码核苷酸序列的根-特异性表达，所述方法包括下列步骤a)使植物基因组文库与编码伸展蛋白-样蛋白质的cDNA杂交；b)分离阳性克隆；c)检测分离克隆的启动子活性。
13.根据权利要求12的方法，其中所用cDNA与SEQ ID No.7所示核苷酸序列的部分相同。
14.根据权利要求1或2的启动子或根据权利要求11至13中任一项的方法鉴定的启动子用于在植物中根-特异性地表达转基因的用途。
全文摘要
本发明提供了启动子,其导致由所述启动子控制的编码核苷酸序列的根－特异性表达,本发明还涉及含有该启动子的表达盒,重组载体和微生物。另外,本发明还描述了转化的转基因植物,以及生产该转基因植物的方法和分离根－特异性启动子的方法。
文档编号C12N15/09GK1326507SQ99813354
公开日2001年12月12日 申请日期1999年11月16日 优先权日1998年11月16日
发明者约尔格·里斯梅尔, 洛特尔·维尔米策, 玛塞尔·布赫 申请人:Eth苏黎世公司, 约尔格·里斯梅尔, 洛特尔·维尔米策