专利名称：用于主动免疫治疗的Th1接种疫苗引发的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗领域，特别涉及治疗性疫苗方法。确切地说，本发明涉及利用含有同种异体细胞的药物组合物来引发增加的Thl记忆的方法，所述Thl记忆随后可被激活和用作癌症和传染性疾病及其它衰老性疾病的主动免疫治疗的佐剂。
背景技术：
利用免疫系统的力量来治疗慢性传染性疾病或癌症是免疫治疗的一个主要目标。 设计接种疫苗(a/k/a，主动免疫)方法是用于激活免疫系统来特异性识别和防御入侵的病原体。在过去200多年里，主动免疫方法已被用于预防很多传染性疾病，包括天花，狂犬病， 伤寒，霍乱，鼠疫，麻疹，水痘，流行性腮腺炎，脊髓灰质炎，乙型肝炎和破伤风及白喉毒素。主动免疫治疗的概念现在正被应用于开发治疗性癌症疫苗，试图治疗已存在的肿瘤或防止肿瘤复发，同时也被用于慢性病毒感染的治疗。然而现行的主动免疫治疗技术在防御很多现代疾病靶标例如HIV/AIDS，丙肝和癌症方面还未取得成功。这一部分原因是由于现有的疫苗接种技术还无能力激起适当类型的免疫反应。针对感染或其它抗原性激发产生的免疫反应类型总体上可通过参与该反应的T 辅助(Th)细胞的亚型来区分。免疫反应广义上可被分为两种类型Thl和Th2。Thl免疫激活是最优化的用于细胞内感染，例如病毒，并且涉及自然杀伤(NK)细胞和可裂解受感染细胞的溶细胞性T细胞(CTL)的激活，而Th2免疫反应是最优化的用于体液(抗体)反应。 Thl免疫激活是最为渴望得到用来癌症治疗，和Th2免疫反应是更多地针对特异性抗体的分泌并对肿瘤治疗的重要性相对较低。现有技术疫苗组合物被专门用于激发Th2或体液免疫反应，这对于抗癌症和大多数病毒性疾病是无效的。癌症的根除和缓解的维持需要Thl免疫激活。因此主动免疫治疗的目标之一是开发能够使残留的Th2反应转偏向Thl反应的方法。然而在一些产生潜在有效的抗肿瘤的Thl 免疫反应或被治疗性免疫后产生Thl免疫反应的患者中，肿瘤仍然继续不受影响地生长。在Thl免疫患者中缺乏效力和抗肿瘤无效的自然免疫反应被归结于肿瘤具有利用各种不同的策略逃脱来自免疫攻击的能力。这些被肿瘤利用的免疫逃避机制致使免疫系统耐受，并允许肿瘤即使在抗肿瘤效应子机制通过主动免疫被特异性上调后也不受免疫监视无阻碍地生长。因此除了免疫调节作用机制外，主动免疫治疗策略还需要一种克服肿瘤免疫逃避的策略。形成对肿瘤的自身耐受被认为与通常被利用来防止自身免疫疾病的现存自然免疫机制有关。这种正常情况下有益的作用可能作为肿瘤免疫逃避的原因得到以下观察支持很多防止自身免疫的耐受机制与被肿瘤利用来阻止免疫破坏相同。“危险假设”提出免疫系统并非主要辨别自我和非我，反而是在取决于抗原被呈递于免疫系统的情境下，主要去适应对抗原的识别和回应。佐剂的利用是长期以来用于影响对疫苗组合物中的抗原的免疫反应的一种策略。 铝盐和鲨烯的水包油乳剂(MF59)是在人类疫苗中被最为广泛利用的佐剂。不过这些佐剂绝大部分促进对抗原的Th2反应，尽管有效提高血清抗体滴度，但是并不激发显著的细胞免疫反应。发明概述本发明公开描述组合物和用同种异源抗原引发个体来产生高滴度的抗同种异体的Thl表型的记忆细胞的方法。被引发的存在感染性疾病或癌症的个体随后可用相同的同种异体抗原作为佐剂经历主动免疫。在一个被引发的个体内引入同种异体抗原提供强大的具有高效力佐剂效果的Thl细胞因子的爆发(burst)。引发方法特别有益于老年个体的免疫健康维持，因为Thl细胞数量随着个体年龄增加而倾向于变低。在此描述的方法提供了通过施用产生Thl细胞因子的活的同种异体细胞在患者循环中增加Thl细胞数量(Thl足迹)的手段。同种异体细胞含有被免疫细胞处理过的同种异体抗原并导致产生抗同种异体的免疫力。当同种异体细胞被用来产生Thl细胞因子时， 这些细胞因子用作佐剂，导致针对同种异体抗原的免疫反应被导向于Thi，从而增加患者的 Thl足迹。多次注射产生Thl细胞因子的同种异体细胞用于增加这种Thl足迹。引发性接种疫苗一般施用于对疾病具高易感性的患者，例如老年患者。引发性接种疫苗也可以施用于患有癌症但处于缓解期和可能隐匿最小的残留疾病但非完整肿瘤激发的患者。由引发产生的Thl足迹能在将来任何时候通过注射额外的抗原性激发使患者的免疫系统被激活而产生Thl导向性的细胞因子。换言之，患者的免疫系统被引发并处于待命模式。因此当一个被引发过的患者产生疾病时，含有同种异体细胞的疫苗组合物可单独施用于患者或和疾病抗原联合施用。这种通过主动免疫治疗引发患者产生出Thl足迹使得免疫系统更有效地激发治疗性反应。已有疾病的患者也可以在主动免疫治疗前先被引发。一方面，本发明的公开内容包括一种接种疫苗于患者来抵抗疾病的方法。这种方法包括施用一种同种异体性被激活的Thl记忆细胞的引发组合物以在患者内提供一种Thl 足迹，其中当患者没有显现出疾病症状时施用引发组合物。另一方面，本发明公开内容包含一种在患者中减少疾病复发的方法。这种方法包括将一种同种异体性被激活的Thl记忆细胞和疾病相关抗原的引发组合物施用于患者。又一方面，本发明公开内容包括一种在患者内产生一种Thl足迹作为佐剂用以激活免疫治疗的方法。这种方法包括施用含有同种异体性被激活的Thl记忆细胞的引发组合物，其中当在患者没有显现出疾病症状时施用引发组合物。又另一方面，本发明公开内容包括一种在患者中用于治疗疾病的治疗性组合物。 这种组合物包含同种异体性被激活的Thl记忆细胞，其中治疗性组合物在施用后增加患者循环中的Thl细胞数量。又另一方面，本发明公开内容包括一种含有同种异体性Thl记忆细胞组合物在制备用于通过增加治疗后循环中Thl细胞数量来治疗疾病的药物中的应用。又另一方面，本发明公开内容包括一种用于患者抵抗肿瘤或病原体的疫苗组合物试剂盒。该试剂盒包括一种引发组合物和一种激活组合物，其中引发和激活组合物二者都包含同样来源的同种异体性被激活的Thi记忆细胞，其中引发组合物施用后增加患者循环内Thl细胞数量。
图IA是显示无佐剂时针对BCLl免疫反应的条形图。
图IB是显示有佐剂时针对BCLl免疫反应的条形图。图2A显示从第0天到第6天在⑶45RB，⑶62L和⑶44中表型转变的图表。图2B显示第0天、第6天和激活后在置放于培养物中的⑶4+细胞中⑶40L效应分子表达的表型转变的图表。图2C显示第0天、第6天和激活后在置放于培养物中的⑶4+细胞中⑶25表达的表型转变图表。图3A是⑶3/^拟8交联的Thl记忆细胞的细胞因子产量的条形图。图;3Β是⑶3/^拟8交联的Thl记忆细胞的免疫原性的条形图。图4是显示同种异体性被激活的Thl记忆细胞的防护性接种疫苗能力和对肿瘤激发的反应的图表。图5是显示同种异体性被激活的Thl记忆细胞的治疗性接种能力的图表。图6是显示来自引发和治疗性加强剂的结果的图表。图7Α是显示在一冷冻消融全身性肿瘤模型中反应的图表。图7Β是显示在一冷冻消融实体性肿瘤模型中反应的图表。图7C是显示在一实体性肿瘤中针对对侧(右侧)肿瘤生长反应的图表。图7D是显示全身性肿瘤模型存活的图表。
具体实施方案本发明包括引发疫苗组合物和在主动免疫治疗中使用这些引发疫苗组合物的方法。优选地，引发疫苗组合物包括在注射时被激活的同种异体性Thl记忆细胞。所述方法包括在正常个体或对疾病易感或有最小残留疾病的患者中施用引发疫苗组合物来提供一种Thl足迹。在这些个体中的Thl足迹随后可在疾病发作或复发时通过主动免疫治疗，即施用一种包括同种异体性Thl记忆细胞的活化疫苗组合物可被动员。活化的疫苗组合物也可包括疾病相关抗原。活化的疫苗组合物可被用来在患者中引发治疗性的Thl免疫力同时还提供了克服疾病病原体和肿瘤免疫逃避机制的手段。对患者的引发有利地建立了一种效力大的原位佐剂来导向Thl免疫力。因此当患者暴露于病原体或癌症攻击时，免疫系统能引发起更及时和有效的反应。本发明包括一种包含活的免疫细胞(其中至少一部分是T细胞)的引发疫苗组合物。τ细胞优选地是Thl表型(产生IFN- γ而不是IL-4的⑶4+Τ细胞)的记忆T细胞 (⑶45R0+，^621^°)并且在本文中被指为“记忆细胞”或“记忆Thl细胞”。Thl记忆细胞在配制和引入患者时被激活。优选的激活方法是通过在T细胞上交联⑶3和⑶观表面分子。 在被激活时，被激活的记忆T细胞优选地表达⑶40L和产生大量的炎性细胞因子(例如， IFN- γ，GM-CSF和TNF- α )。这些被激活的Thl记忆细胞针对患者优选地是同种异体性的。 在某些实施例中，引发组合物也可包括疾病相关抗原性物质。含有被激活的Thl记忆细胞的组合物可被用于预防目的或治疗目的，或两者兼之。当施用于还没有显现任何疾病症状的个体时，在此描述的引发组合物是特别优选的。 更优选的是对还没有显现任何症状但对疾病易感的患者施用引发组合物。引发组合物也可被施用于处在疾病早期的患者或在针对癌症患者情况下，患者处于缓解期或有最小残留疾病。组合物对显示症状的患者的应用也涵盖于本发明的范围内。组合物可通过所有关于疫苗常规使用或推荐的途径而施用，包括非肠道的，皮内，肌内，皮下或粘膜途径。此外，组合物可被骨内(intraosseally)，鞘内，腹膜内或腔内(intralaminally)施用。在某些实施方案中，组合物也可结节内(intranodalIy)或肿瘤内施用。本发明的药用引发接种疫苗组合物包括活的、被激活的免疫细胞，其中至少一部分是T细胞。组合物也可包括疾病相关抗原。在此提到的疾病相关抗原包括导致疾病的病原体的相关抗原，来自肿瘤的细胞或裂解物或其它疾病相关抗原。在本发明引发性疫苗药物组合物中使用的被激活的Thl记忆细胞优选地是来源于正常供体的血液。用于加工和制备适合用于本发明中的细胞的优选的方法被Har-Noy在美国专利号7，435，592和 7，402，431及待审的美国公开专利申请2005/0191291中描述，这些专利文献通过引用完整地结合于此。用于疫苗组合物中的Thl记忆细胞数量可以变化，且可能还取决于施用途径。引发性和活化性的组合物通常具有大约IxlO6细胞至大约IxIOki细胞的数量。优选地，当组合物通过皮内或肿瘤内施用时，细胞数量大约在IxlO6细胞至大约IxlO8细胞之间，当组合物通过腹膜内，骨内或鞘内施用时，细胞数量大约在IxlO7细胞至大约IxlO9细胞之间，当组合物通过静脉内施用时，细胞数量大约在IxlO8细胞至大约IxIOici细胞之间。Thl记忆细胞的数量在这些范围以外的组合物也包含在本发明范围内。被含有同种异体性Thl记忆细胞的组合物引发后的患者通常将会产生抗同种异体抗原的免疫力。随后注射的同种异体性细胞可以激活抗同种异型抗原细胞库，其能释放使免疫逃避机制失效所必需的炎性细胞因子。在某些实施例中，引发性疫苗组合物可以施用于疾病易感患者。这些疾病可能是常常发生在老年人中的疾病。引发性疫苗组合物对癌症或传染性疾病例如HIV/AIDS，乙型肝炎，丙型肝炎，疱疹，结核病和疟疾易感的患者可能有效。当引发性疫苗组合物施用于这些患者时，他们会产生一种抗同种异体抗原的免疫力。患者的免疫系统可能具有一种当需要时能被激活的Thl足迹。换言之，患者的免疫系统是处于待命模式和针对抗原刺激被引发产生更有效的Thl反应。当患者显现出一种特定疾病的症状时，可以施用以下所描述的活化的疫苗组合物。在某些实施例中，引发性接种疫苗可以施用于已经患有疾病例如癌症但处于缓解期中的患者。缓解期中的患者有时可能有最小的残留疾病(minimal residual disease, MRD)。在MRD中，患者仍然可能携带癌细胞但其数量在临床上不显示症状。随着时间增长， 癌细胞可能生长并导致疾病的复发。含有被激活的Thl记忆细胞和一种或多种来源于原始癌细胞的抗原的引发性接种疫苗可施用于缓解期患者以产生一种Thl足迹。当患者显示出复发迹象时，可施用含有被激活的Thl记忆细胞和一种或多种疾病相关抗原的活化性疫苗组合物。由于患者先前已被免疫引发，残留的抗同种异体性抗原记忆可以很快激发起反应来更有效地对抗完全爆发的抗原刺激。根据本发明所述的引发性疫苗组合物，当施用于处于缓解期的患者时，可以是一种意在针对一种单一的病原体或癌症免疫的组合物，也就是说，它包含一种或多种来自于一种单一的病原体或癌症的抗原，或者它也可以是一种意在针对几种不同病原体或癌症免疫的组合物(这于是称为一种疫苗组合)。在施用前，当被激活的Thl细胞和疾病相关抗原组合时可获得被激活的Thl记忆细胞的佐剂功能。备选地，被激活的Thl记忆细胞和疾病相关抗原分开施用。优选地，在施用于患者前，被激活的Thl记忆细胞和疾病相关抗原组合。为了维持一种能使肿瘤和疾病生物体逃避免疫破坏的能力丧失的炎症环境，可以施用附加的单独的被激活的Thl记忆细胞或与抗原配制的增强组合物。优选地，增强组合物可以至少在相隔3-7天制备，更优选地，相隔7-14天制备。对患者施用附加的增强组合物可根据需要以一月或一年作为基础。药物组合物的抗原组分包括一种或多种疾病相关抗原。任何抗原来源可以在制剂中被使用，例如这些抗原可以是来源于活细胞或生物体，来源物质可以是经辐照被灭活的 (或另外灭活的方法)，作为完整细胞或生物体或来自于其的裂解物使用。特别是，肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物可用作抗原的细胞来源物质。细胞来源物质可以从自体的或异体的细胞或从细胞系而得来。抗原来源在于2009年5月1日提交的美国专利申请12/434，168中描述，该美国专利申请通过引用结合于此。当患者显示出一种特有疾病的迹象时，可对患者施用含有被激活的Thl记忆细胞和一种或多种来源的疾病相关抗原的活化疫苗组合物。患者的免疫系统可被激活而很快产生大规模的Thl反应，由此一种更有效地反应被激发起来对抗抗原，这是因为在患者中已存在抗同种异体抗原的免疫力。活化疫苗组合物一般包括本文中描述的用于引发性疫苗组合物的同种异体性被激活的Thl记忆细胞。优选地，在活化组合物中施用于患者的同种异体性Thl记忆细胞和用于引发组合物中的同种异体性Thl记忆细胞来源相同。施用于患者的同种异体性被激活的Thl记忆细胞数量和在引发组合物中被施用的同种异体细胞数量大致可相同。虽然在活化性组合物中使用或多或少数量的细胞落入在本发明的范围内，活化性疫苗组合物可以包括在此描述的疾病相关抗原。同种异体性Thl细胞和疾病相关抗原可以一起作为一种活化性疫苗组合物施用。备选地，同种异体性Thl细胞和疾病相关抗原可以作为单独的组合物被施用。实施例小鼠一一5至6周龄雌性Balb/c (H-2d/d)和雄性C57BL/6 (H-2b/b)小鼠从以色列耶路撒冷的希伯来大学-Hadassah医学院买来。所有小鼠被搁置在特定的无病原体(SPF)环境下并被随意给予酸化的水和食物。此研究被希伯来大学医学院动物伦理委员会批准。所有小鼠当用于实验时都是6至8周龄。BCLl肿瘤模型-BCLl是一种Balb/c来源的自发性B细胞白血病/淋巴瘤。BCLl 肿瘤系通过在Balbl/c受体中通过系列传代在体内维持。在这些实验中，动物通过尾部静脉经静脉在实验第0天被注入2000BCL1细胞，其在100 %小鼠内为致命的。在某些实验中， IxIO4BCLI细胞被皮下植入Balb/c小鼠的胁腹。在此情形下BCLl形成一个成长迅速的与淋巴瘤/浆细胞瘤相似的实体肿瘤。同种异体性Thl记忆细胞的制备制备同种异体性Thl记忆细胞。简要地说， CD4+细胞从雄性C57BL/6脾脏中被分离出并与被包被有抗CD3和抗CD^的顺磁性珠(CD3/ CD28T-cell Expander 珠，Dynal/Invitrogen)以 3 1 的初始珠CD4 细胞比例和 20IU/ mL 重组小鼠(rm)IL-2，20ng/mL rmIL-7,10ng/mL rmIL-12 (P印rotech，新泽西)及 10 μ g/ mL抗鼠IL-4单抗(Becton Dickenson)在含有10%胎牛血清、青霉素-链霉素谷氨酰胺、非必需氨基酸(NEAA) (Biological Industries,以色列)和3. 3mM N-乙酰半胱氨酸(NAC ； Sigma)(完全培养基)的RPMI1640培养基中培养6天。置放培养物中6天后，收获⑶4细胞和通过物理性分裂和通过磁体去除珠子。这些细胞或新鲜使用或被存放于液氮中以备将来使用。使用之前，细胞通过与包被有抗CD3/抗CM8的纳米珠在完全培养基中孵化4小时被活化。接种疫苗一用悬浮在0. Iml的HBSS或完全培养基中的疫苗组合物给小鼠接种疫苗。接种是在交替足垫或在剃过的肋腹的皮肤层进行。BCLl肿瘤抗原制备一BCLl裂解物和经辐照的BCLl细胞作为肿瘤抗原来源使用。 成批的BCLl裂解物由悬浮于2mL HBSS中的IxIO7BCLI细胞和经3次冷冻(在_80°C冷冻机中)_融化(37°C水浴)循环而裂解得到。全部的细胞破裂用台盼蓝染色后经显微镜证实。裂解物充分混合以确保获得一种均一溶液并等分为分开的0.2ml的剂量。这些剂量在使用前被储存在_80°C。新鲜的BCLl细胞经20Gy辐照并在经处理后1小时内使用。单克隆抗体——以下的单克隆抗体(mAb)被用来表面表型分型抗-mCD4-PerCP-Cy5(IgG^i)；同种型对照大鼠 IgG^i-PerCP-Cy5· 5 ；抗 mCD62L-APC(IgG2a)；同种型对照大鼠IgGh-APC ；抗mCD45RB_PE (IgG2a)；同种型对照大鼠 IgG^i-PE ；抗 mCD8a-FITC(IgG2a)；同种型对照大鼠 IgG^i-FITC ；抗 mCD44_FITC(IgG2b)； 同种型对照大鼠IgG2b-FITC ；抗mCD154 (CD40L) -PE (IgG)；同种型对照大鼠IgG-PE ；抗 mCD25-APC (IgGl)；同种型对照大鼠 IgGl-APC ；抗 mCD;3e-PerCP-Cy5. 5 (IgG)；同种型对照 Armeniam 仓鼠 IgG-PERCP_Cy5. 5，全部来自于 eBioscience，Inc.(圣地亚哥，USA)。酶联免疫斑点试验测定(ELISPOT Assay) —制备来自于经免疫小鼠脾脏的单细胞悬浮液。细胞被等分以使^clO6活细胞置放于M孔平板的含2ml完全培养基的每个孔内。 每个孔内的脾脏细胞用测试抗原刺激(pulsed)。测试抗原作为悬浮于完全培养基中的冷冻-融化裂解物来制备。每孔用来自IxlO7细胞BCL1细胞，同种异体性Thl细胞或来自未经处理的同基因小鼠的脾脏细胞，进行刺激。经刺激过的孔在加湿的(X)2孵化器中于37°C 下培养M小时。M小时后，非贴壁细胞被收获，冲洗和计数。这些细胞然后按一式三份以 100，000活细胞/孔平板接种于预包被有抗IFN- γ和抗IL-4的平板(eBioscience，圣地亚哥，CA)并在补充有20IU/ml rmIL-2 (Peprotech)的完全培养基中再孵化20小时。被PHA 激活的来自于同基因小鼠的新鲜脾脏细胞用作每个平板的阳性对照(数据未显示)。平板按生产商的指示显色(developed)并在自动显影分析系统上读取。冷冻免疫治疗肿瘤模型一两种肿瘤模型被用于冷冻免疫治疗方案，双侧实体肿瘤模型和带有全身性疾病的实体肿瘤模型。双侧实体肿瘤模型由第0天在被剃肋腹双侧皮下注射IxIO4BCLl肿瘤细胞的小鼠构成。关于带有全身性疾病的实体肿瘤模型，在第0天用IxIO4BCLl单次皮下接种于小鼠左肋腹并经静脉注入2000BCL1细胞。冷冻消融经麻醉的小鼠(氯胺酮-HCL，100mg/kg, i. p.)被冷冻钳子(被置于液氮中)用10秒钟轻微压力对肿瘤进行冷冻消融处理。当被冷冻消融处理时，肿瘤大小为16-25mm2。用冰球覆盖整个肿瘤实体。1小时后施用肿瘤内治疗以确保被处理区域在接种前完全融化。统计数据一双向方差分析用以确定细胞因子水平的显著差别，酶联免疫斑点试验反应频率和肿瘤体积变化。小于0.05的P值被认为具有显著差异。Logrank和风险比(hazard ratio)分析用于和 Kaplan-Meier 存活曲线(Graphpad Software ；圣地亚哥，CA) 作比较。生存超过60天的动物从分析中被删除。对有或无佐剂的BCLl接种疫苗的免疫反应(图IA和图IB)。Balb/c小鼠(n = 3)每隔一星期经皮内被冷冻-融化的BCLl肿瘤裂解物(f/t BCL1)或无佐剂的经辐照过的BCLl (irrad BCL1)(图1A)或混合有lxl(fCD3/CD28交联的同种异体性Thl细胞(alio Thl)作为佐剂(图1B)接种4次。在第一次接种后的第五周，杀死动物，收获它们的脾脏， 脾脏细胞的单细胞悬浮培养物用f/t BCLl或从作为对照的未接种的Balb/c小鼠而来的f/ t脾脏细胞刺激。M小时后，非贴壁T细胞被去除并一式三份以IxlO5细胞/孔被平板接种于包被有抗IFN- γ和抗IL-4的ELISP0T平板。经20小时培养后，IFN- γ和IL-4的斑点生成并用计算机辅助的视频图像分析计数。每个条形柱代表来自IO5T细胞的一式三份的斑点数平均值+/-SE。图IA和IB中的星号(*)象征显著差异(ρ < 0. 05)和n. s.象征与对照组相比并在括弧值之间(AN0VA双向测试)无显著差异(ρ > 0. 05)。CD3/CD28交联的Thl细胞的鉴定(图2A,图2B和图2C)。第0天,把由C57BL/6而来的被阳性选择的CD4+T细胞置放于补充有rmIL-12，rmIL-7，rmIL-2和抗IL-4的中和单抗的^^]\0培养液中，并用003/^028缀合的1^^11 Expanded 珠子(Dynal/Invirogen)以 3 1珠子细胞比例激活。从第3-6天开始，每日分离细胞并补充额外的T-Cell Expanded 珠子，rmIL-7，rmIL-2和抗IL-4单抗。第6天，收获并用⑶3/^拟8缀合的纳米珠子激活细胞。图2A显示了从第0天到第6天⑶45RB，⑶62L和⑶44表型的转变。黑色填满区域代表同种型对照。黑线代表第0天CD4+细胞的表型。灰色填满区域代表在CD3/CD^纳米珠子激活前第6天的细胞表型及灰色线代表CD3/CD^纳米珠子激活后的表型。图2B显示了第0天和第6天相比，收获的细胞被CD3/CD^纳米珠子激活前后，CD40L效应分子在培养物内CD4+细胞中的分子表达表型的变化。只有被激活的细胞表达显著数量的这种效应分子。图2C代表第0天和第6天相比，被⑶纳米珠子激活前后的⑶4+细胞中⑶25 表达的表型转变。被激活的第6天细胞表型是⑶4+，⑶62Llo，⑶45RBhi，⑶44hi，⑶40L+， CD25+oCD3/CD28交联的Thl记忆细胞的细胞因子产量(图3A)和免疫原性(图3B)。用 ELISA在6小时细胞培养上清液中分析IFN- γ和IL-4细胞因子的产量。从C57BL/6阳性选择出的⑶4细胞在IL-12(只在第1-3天)、IL-7和IL-2存在的情况下培养6天，扩增到 60-100倍并分化成⑶45RBhi，⑶44hi效应分子/记忆细胞。第6天收获，洗涤和用⑶3/ ⑶观纳米珠子重新激活这些细胞，培养6小时后收获上清液以通过ELISA分析(图3A 新鲜被激活的Thl)。这些结果和同样在第6天先在液氮冰冻然后融化和用CD3/CD^纳米珠子激活而收获的细胞的6小时培养物上清液相比较(图3A:被融化激活的Thl)。为了比较，从同样阳性选择出的CD4细胞(同样在第0天被置于培养物中)样品的上清液用CD3/ ⑶观T-cell Expander珠子以3 1珠子细胞比例激活并培养6小时(图3A :CD4幼稚细胞)。第6天收获的细胞上清液同样在未被CD3/CD^激活情况下培养6小时(图3A 未激活Thl新鲜细胞)。这些细胞组合物的免疫原性用ELISP0T测定(图:3B)。IxlO4新鲜被激活Thl细胞，新鲜未被激活Thl细胞或由C57BL/6小鼠阳性选择而来的CD4细胞(对照)在同基因型Balb/c小鼠中连续4周每周一次经皮内接种。在第5周期间，杀死小鼠(n = 3)，去除脾脏，建立单细胞脾细胞培养物。用冷冻/融化CD57BL/6脾脏细胞裂解物刺激培养物并培养 M小时。收获，洗涤非贴壁T-细胞部分，把IxlO5细胞一式三份转放于包被有抗IFN-γ和抗IL-4的ELISP0T平板并在20IU rmIL-2存在的条件下再培养20小时。每个条形图代表一式三份的斑点数平均值+-SE。保护件接种和肿瘤刺激。被接种用以抵抗BCLl肿瘤(每组η = 8)的Balb/c小鼠的Kaplan-Meier存活曲线(图4)。所有的小鼠在第0天被静脉内输注2000 BCLl细胞。 肿瘤攻击之前，在第-22天，第-15天，第-8天和第-1天，小鼠单独被培养基(对照)，IxlO4 同种异体性的CD3/C^8交联的Thl细胞(单独Thl细胞)，混合有经辐照的BCLl的IxlO4 同种异体性的⑶交联的Thl细胞(irrad BCLl+Thl)或混合有冷冻/融化BCLl肿瘤裂解物的IxlO4同种异体性的CD3/CD28交联的Thl细胞(f/t BCLl+Thl)经皮内接种。 对照小鼠的平均生存期为21天。单独用辐照过的BCLl (平均生存期=20. 5天)或单独用 f/t BCLl(平均生存期=20.0天)接种与对照相比，不显著影响生存期。用Thl细胞单独预处理显著延长生存期至平均值为M天(风险比=3. 14)。用辐照的BCLl细胞和Thl细胞作为佐剂接种对生存期无显著影响(平均生存期=22天)。把f/t BCLl与Thl细胞混合，导致50%的小鼠幸免致死肿瘤攻击，并且导致46天的平均生存期(风险比=6.08)。治疗件接种。第0天被静脉内输注2000BCL1细胞的Balb/c小鼠(每组η = 6) 的Kaplan-Meier生存曲线(图5)。在第1，8，和15天，小鼠经皮内被注射单独的IxlO4同种异体性CD3/CD28交联的Thl记忆细胞(Thl)或与Thl混合的IxIO6BCLI的f/t裂解物 (f/t BCLl+Thl)。对照小鼠平均生存期为19. 5天。被Thl单独接种的小鼠平均生存期为 26天，显著长于对照(logrank :p = 0. 001 ；风险比3. 981)。被f/t BCLl+Thl接种的小鼠平均生存期为34天，也显著长于对照小鼠(logrank :p = 0. 001 ；风险比3. 981)，但与单独 Thl组无显著差别。用治疗性增强剂引发。被接种抵抗BCLl肿瘤的Balb/c小鼠(每组η = 8)的 Kaplan-Meier生存曲线(图6)。在第0天，所有小鼠经静脉输注2000BCL1细胞。肿瘤攻击前，在第-22天，第-15天，第-8天和第-1天，单独用培养基(对照)，IxlO4同种异体性CD3/ ⑶观交联的Thl细胞(Thl)或与冷冻/融化的BCLl肿瘤裂解物混合的IxlO4Thl (Thl+f/t BCLl引发)通过接种引发小鼠。在第7天，有些小鼠经皮内被单独施用Thl细胞或与f/t BCLl混合的Thl作为治疗性增强接种物。对照小鼠平均生存期为20天。用Thl单独接种导致平均生存期显著延长至23天(logrank :p = 0.011 ；风险比2. 478)。用Thl单独接种继以用Thl增强剂，与对照相比导致显著的生存期优势(平均生存期=25天)(logrank :p < 0. 0001 ；风险比=3. 915)和与单独Thl相比也具显著生存期优势(logrank :p = 0. 03 ； 风险比=2. 337)。以Thl作为佐剂通过用f/t BCLl (Thl+f/t BCLl引发)接种而引发的小鼠导致57. 5天的平均生存期，50%的小鼠在致死攻击中幸免。被Thl+f/t BCLl引发和施用Thl增强剂的小鼠在致死攻击下具有75%存活率。被Thl细胞单独引发和注射施用 f/t BCLl+Thl治疗性增强剂的小鼠与对照比较具有显著的存活益处，平均生存期为46天 (logrank :p < 0. 0001 ；风险比=5. 633)，37. 5%的小鼠在致死攻击中幸免。实体肿瘤和全身性肿瘤对冷冻免疫治疗的反应。在实体肿瘤模型中，第0天，用 IxIO4BCLI肿瘤细胞经皮下接种于被剃胁腹两侧的Balb/c小鼠。在全身性肿瘤模型中，第 0天，用IxIO4BCLl肿瘤细胞接种于左胁腹并用2000BCL1经尾静脉静脉内注射入Balb/c
10小鼠。全身性肿瘤模型(图7A)和实体肿瘤模型(图7B)中第14天在左侧的肿瘤实体块中所有可见的肿瘤单独经过冷冻消融处理或经肿瘤内同种异体性的CD3/CD^交联的Thl 记忆细胞(Thl)(冷冻+Thl)处理或无冷冻消融而只有经肿瘤内Thl细胞单独处理(单独 Thl)的小鼠(每组η = 8)Kaplan-Meier生存曲线。对照小鼠存活期中值在全身性肿瘤模型和实体肿瘤模型中分别为21天和28. 5天。在全身性肿瘤模型中cryo+Thl治疗导致显著生存优势(logrank :p = 0. 0059 ；风险比=3. 194)。生存优势在实体肿瘤模型中不显著 (n. s.)。所有的小鼠经重复同样的实验并在第7天额外经静脉注入lxl05Thl。图7C显示用这种方案处理的小鼠的对侧的未经治疗的肿瘤块的肿瘤生长曲线。40%经cryo+Thl治疗的小鼠疾病被治愈。在另外最终死于疾病的60%的小鼠中对侧肿瘤的生长显著受抑制 (P < 0. 01)。在全身性肿瘤模型中(图7D)，Kaplan-Meier存活曲线如图所示。经肿瘤内 Thl细胞单独处理的小鼠存活的平均值为观天，这显著长于存活的平均值为19天的对照小鼠(logrank :p < 0. 0001 ；风险比=4. 291)。· 40%经cryo+Thl治疗的小鼠存活大于90 天。结果BCLl免疫原件-----在Balb/c小鼠中针对BCLl接种的自然免疫反应被表征用
来作为基线，以此分析增加一种佐剂的生物学效果。由于BCLl已在活体内被连续传代很多年，基于“免疫编辑”，当无佐剂而在同基因型的Balb/c小鼠上施用时，目前的BCLl克隆将证明为非免疫原性的。BCLl的两种疫苗制剂的免疫原性，经辐照过的整个BCLl(irrad BCL1)或是一种冷冻-融化的BCLl裂解物(f/t BCL1)在无佐剂(图1A)或在混合1x103CD3/CD^交联的同种异体性Thl细胞(alio Thl)作为佐剂的情况下被测试(图1B)。“危险假说”预示f/ t BCLl裂解物制剂将比经辐照的BCLl制剂有更大免疫原性。为了测试f/t BCLl和经辐照的BCLl制剂的免疫原性，每种制剂连续4周每周1次在0. 2ml的HBSS中经皮内(i. d.)施用于Balb/c小鼠。无佐剂接种经辐照的BCLl和f/t BCLl能引发显著的肿瘤特异性免疫反应(见图1A)。肿瘤特异性T-细胞(IL-4+IFN-Y斑点)的平均频率在经辐照的BCLl接种后为 1/64，这显著高于(3. 5-倍)f/t BCLl免疫接种后为1/227的平均频率。相比于平均频率为1/3333 (ρ < 0. 001)的对照，两种接种方案都导致显著性的较高频率的反应性T细胞。两种疫苗制剂都引起肿瘤特异性T-细胞反应偏向于Th2(IL_4)。针对经辐照的 BCLl接种的T-细胞IL-4平均频率反应为1/93，IFN-γ反应为1/208，呈现显著较低(ρ < 0. 001)。在f/t BCLl接种的小鼠中IL-4反应者平均频率为1/322，显著高于1/769的 IFN-Y平均反应频率(ρ < 0. 01)。在经辐照的BCLl接种的小鼠中的IFN-γ反应者平均频率和经f/t BCLl接种的小鼠中相比不具有显著差异。经辐照的BCLl接种的小鼠或经f/t BCLl接种的小鼠都未能在经尾静脉静脉内施用2000BCL1细胞的致死攻击下存活(见图4)，指示对于两种BCLl接种方案的显著免疫反应都不是保护性的。CD3/CD28交联的Thl记忆细胞的表征-------来源于C57BL/6的CD3/Q^8交的
Thl记忆细胞先表征如下各项表面表型(见图2A-C)，细胞因子产量情况(图3A)和在同种异体的Balb/c小鼠中经4次每周1次的皮内注射后的免疫反应(图:3B)。
用FACS在第0天分出⑶4+来源细胞并通过将染色模式和6天后被⑶3/^拟8交联激活前后培养物中收获的同样细胞作比较，分析⑶62L，⑶45RB，⑶44，⑶25和⑶40L的表面表达以表征6天培养后细胞的分化。实验结果在图2A中显示。第0天从脾脏细胞中被阳性选择出的⑶4+细胞是着色⑶62Lhi，⑶44hi但从一种⑶62Lhi表型转向一种⑶62L1。表型。因此第6天⑶3/^拟8交联的细胞表现一种⑶4+， CD62L1。，CD45RBhi，CD44hi 的表型。表型上，小鼠的记忆细胞正常情况下是⑶62L1。，⑶45RB1。，⑶44hi。由我们的培养方法产生出的细胞的⑶62L1。，⑶45RB1。，⑶44hi表型和之前与自身免疫疾病和同种异体移植排斥相关的记忆/效应细胞的表型相同。第6天用⑶3/^拟8交联激活细胞4小时引起表达⑶40L的细胞数量从9. 27%至 67. 65%的显著增加(图2Β)，这与表达⑶25的细胞数量从63. 09%至91. 52%的增加相关 (图 2C)。在被CD3/CM8交联激活第6天新鲜收获的细胞或第6天收获的先在液氮中冷藏、融化和激活的细胞中，这些被⑶3/^拟8激活的⑶4+，⑶62L1。，⑶45RBhi，⑶44hi，⑶40L+， ⑶40L+，⑶25+记忆/效应细胞(n = 6批量)被用来测定细胞因子产量。第0天被活化的 CD4+细胞和未被活化的新鲜收获的第6天细胞都包括在内用作比较(见图3)。新鲜被活化的CD4+记忆/效应细胞表达大量的IFN- γ (4210 士 169. 7pg/ml/6h) 和可以忽略的IL-4(52. 33士6. 8pg/ml/6h)，因而这些细胞被归类作为Thl记忆细胞。当这些Thl记忆细胞在活化前冷藏于液氮中，随后融化和被激活，它们保留Thl表型但表达比新鲜细胞大约少四％的 IFN-Y 和 IL-4 0985士 173. 5pg/ml/6h 的 IFN-γ 和 37. 2士6. 95pg/ ml/6h的IL-4)。未被激活的Thl记忆细胞产生可忽略量的细胞因子(13士6. 7pg/ml/6h IFN- γ ；8. 8士3. 6pg/ml/6h IL-4)。从正常的C57BL/6脾脏细胞单细胞悬浮液通过阳性选择分离出的CD4+来源细胞在用CD3/CD^缀合的微珠激活后产生细胞因子，伴随具一种Th2 偏向 054士50. 2pg/ml/6h IL-4 ;53. 5士 11. 4pg/ml/6hIFN_ γ )。这些数据表明培养条件引起⑶4+幼稚细胞具有一种Th2偏向而分化成被强极化的Thl记忆/效应细胞，其在⑶交联后表达⑶40L和表达一种不常见的⑶62L1。， CD45RBhi，CD44hi 的记忆表型。对同种异体性CD3/CD28交联的Thl记忆细胞的免疫反应-----为了表征同种异
体性CD3/CM8交联的Thl记忆细胞为提高1型免疫力提供佐剂活性的潜力，进行一项研究来确定来源于C57BL/6的Thl记忆细胞是否在同种异体性Balb/c宿主中引发针对它们自身的同种异体性抗原的1型免疫力。IxlO4⑶3/^拟8交联的Thl记忆细胞或IxlO4没有⑶3/ ⑶观交联的Thl记忆细胞在0. Iml的cRPMI中经皮内施用于小鼠，接种cRPMI用来作为对照。连续4周每周1次接种小鼠(n = 6)。在第一次接种后的第5个星期中，杀死小鼠，取出脾脏，制备单细胞悬浮液用于前面所述的ELISP0T分析。结果在图;3Β中显示。单独用同种异体性CD4细胞(第0天)接种产生一条同种异体性免疫反应平均频率(IFN- y +IL-4)为1/348的T细胞的基线。无⑶3/^拟8交联的同种异体性Thl细胞(第 6天)产生反应平均频率为1Λ68Τ细胞，这与单独用⑶4没有显著不同。然而，同种异体性Thl细胞的⑶交联产生1/34同种异体性抗原特异性T细胞的平均频率，这显著高于同种异体性CD4细胞和未被激活的同种异体性Thl细胞的反应频率(ρ < 0. 0001)。针对同种异体性CD4细胞和未被激活的同种异体性Thl记忆细胞的免疫反应产生偏斜的Th2免疫力，而CD3/CM8交联的同种异体性Thl记忆细胞引发一种被强极化的Thl 反应。⑶4细胞接种导致产生IL-4的T细胞平均频率为1/181，这显著高于产生IFN-Y的 T细胞的1/4167平均频率(ρ < 0. 0001)。未被激活的同种异体性Thl记忆细胞引发平均频率为1/147的IL-4反应T细胞，这显著高于(ρ < 0. 0001)平均频率为1/1587的IFN- γ 反应T细胞。同基因型脾脏细胞对照没有引发可检测出的适应性免疫反应(结果未示)。保护件接种和攻击-—为了鉴定同种异体性Thl细胞是否可用于作为佐剂来保护小鼠免于BCLl肿瘤的致死攻击，疫苗组合物用冷冻/融化BCLl裂解物(f/t BCL1)或经辐照过的BCLl (irrad BCL1)细胞制备，其单独使用(对照)或和IxlO4同种异体性Thl细胞混合。没有肿瘤抗原来源的同种异体性Thl细胞单独用来作为对照。小鼠(每组n = 8) 每隔一星期在第-22，-15，-8和-1天4次经皮内接种疫苗制剂。培养基单独注射被用以作为对照。在第0天，所有被接种的小鼠经静脉接受2000BCL1细胞的致死攻击。跟踪小鼠的生存期(见图4)。单独培养基的对照小鼠的平均生存期为21天。单独接种经辐照的BCL1，f/t BCLl或同种异体性Thl细胞对来自肿瘤的攻击没有产生保护结果。有趣的是，单独用同种异体性Thl细胞接种，虽然没有保护性，但是能显著延长被攻击小鼠的平均生存期至M天(风险比=3. 14)。用经辐照的BCL1+TH1细胞组合物接种不影响生存期(平均生存期=22天)也不提供保护。用f/t BCLl+Thl细胞接种产生46天的平均生存期(风险比=6. 08)伴随50%的小鼠在致死肿瘤攻击中幸免。治疗性接种方案一以上数据显示用f/t BCLl和CD3/Q^8交联的同种异体性 Thl记忆细胞作为佐剂在动物中具有的保护性效果，所述动物当无肿瘤时被接种然后接受致死剂量肿瘤攻击。为了确定这种保护性效果是否可同样提供治疗性效果，在预先存在肿瘤的小鼠中进行接种方案的研究。之前保护性的接种方案包括4次每周一次( 天)的皮内接种继以在第35天用肿瘤攻击。这种接种时间表不能被转化到我们模型中的治疗性情景，因为小鼠在致死BCLl输注后19-22天死于疾病。因此，在第0天小鼠(每组n = 6)经静脉接受致死剂量的2000BCL1 细胞和在第1，8和15天治疗性单独接种IxlO4同种异体性⑶交联的Thl记忆细胞 (Thl)或皮内接受与同种异体性Thl混合的IxIO6BCLI的f/t裂解物(f/t BCLl+Thl)。按同样时间表培养基单独接种作为对照。结果显示于图5。对照小鼠平均存活期为19. 5天。有趣的是，没有任何肿瘤抗原来源而单独接种 Thl的小鼠生存显著长于对照，具有沈天的平均生存期(Iogrank=P = 0. 001 ；风险比 3.981)。接种f/t BCLl+Thl的小鼠同样生存显著长于对照小鼠，具有34天的平均生存期 (logrank :p = 0. 001 ；风险比3. 981)，但这与单独接种同种异体性Thl组无显著差别。使用这些治疗性接种方案中的任何一种，没有小鼠获得治愈。引发和治疗件接种增强剂由于没有小鼠在治疗性接种方案中获得治愈，所以输注BCLl肿瘤的小鼠的19-22天寿命期没有足够的时间来建立一种能打败迅速生长的肿瘤的过继免疫反应。因此，进行测试以确定在肿瘤攻击前被包含有同种异体性Thl的疫苗接种引发的小鼠是否对治疗性接种反应更好。在这些实验中，小鼠通过在第-22，-15，-8 和-1天用单独的培养基单独(对照)，IxlO4同种异体性的CD3/CD^交联的Thl细胞(Thl)或混合有冷冻/融化BCLl肿瘤裂解物的IxlO4Thl接种被引发(Thl+f/t BCLl引发)。所有小鼠在第0天被输注2000BCL1细胞。在第7天，有些小鼠经皮内被单独接种IxlO4Thl或与f/t BCLl混合的IxlO4Thl作为施用治疗性增强剂接种。结果显示于图6。对照小鼠的平均生存期为20天。再单独用Thl引发导致生存期显著延长至平均值为23天(logrank :p = 0. 011 ；风险比2. 478)。单独用Thl引发继而用Thl治疗性增强剂导致与对照(logrank :p < 0. 0001 ；风险比=3. 915)相比的显著生存期优势和与单独用Thl引发(logrank :p = 0. 03 ；风险比=2. 337)相比显著的生存期优势(平均生存期 =25天)。通过用f/t BCLl和作为佐剂的Thl (Thl+f/t BCLl引发)接种而引发的小鼠具有57. 5天的平均生存期，伴随50%的小鼠在致死攻击下存活，我们以前的实验中得到了同样的结果(见图4)。用Thl+f/t BCLl引发和施用Thl治疗性增强剂的小鼠在致死攻击后具有75%存活率。单独用Thl引发和施用f/t BCLl+Thl治疗性增强剂注射的小鼠和对照相比具有平均生存期为46天(logrank :p < 0. 0001 ；风险比=5. 633)的显著生存优势， 37. 5%的小鼠在致死攻击中幸免。Thl引发/Thl+f/t BCLl增强剂组的Kaplan-Meier生存曲线的形状当和在致死 BCLl注射后也导致小鼠治愈的其它组相比时是不同的。在Thl+f/t BCLl引发后没有存活的50%的小鼠和在Thl+f/t BCLl引发/Thl增强组没有在致死攻击下存活的25%的小鼠显示了白血病的直接迹象(可触知的脾肿大和显著的体重增加)并在平均期为M天的极早期死于疾病。与此相反，Thl引发+f/t BCLl治疗组包含了一个同样有明显的白血病但存活显著比对照小鼠长的小鼠小分组(62.5% )和明显被治愈且不再显示白血病迹象的另一小鼠小分组(37.5%)。冷冻免疫治疗一为了试着讲一步提高治疗件接种的疗效，我们假设由坏死引起的原位肿瘤死亡可能提供一种比我们其它冷冻-融化裂解物制剂更有力的适应性免疫反应。已知被神经性(neurotically)杀死的细胞激活对DC募集和成熟负责的内源性呼救信号，这种刺激暗示由健康的或凋亡的垂死细胞产生并可能在我们的裂解物制剂中缺失。此外，使不成熟的DC接触于这些刺激提供成熟信号，对于区域性和系统性Thl免疫力启动至关重要。为了引起通过坏死导致原位死亡，使用了一种冷冻消融方案。冷冻消融外科术是一种可被转化到临床中的技术并且已被显示具有一种引起组织性坏死的准确和可控的步骤。冷冻消融已被公知引发一种抗原性刺激(能产生一种针对冷冻组织自体抗原的特异的免疫性反应)。建立两种肿瘤模型，其中皮下肿瘤可用于冷冻消融。在实体肿瘤模型中，在第0天 Balb/c小鼠的双边的被剃胁腹经皮下接种IxIO4BCLI肿瘤细胞。在全身性肿瘤模型中，在第0天Balb/c小鼠的左胁腹被接种IxIO4BCLI肿瘤细胞和经尾静脉注射2000个的BCLl肿瘤细胞。这些动物(每组η = 8)的左侧肿瘤然后在实体肿瘤面积已经生长到大于16mm2的第14天接受单独冷冻消融，冷冻消融和肿瘤内IxlO3同种异体性CD3/CM8交联的Thl记忆细胞(Thl)的治疗，单独的Thl细胞或单独的肿瘤内完全培养基治疗作为对照。图7A和 7B显示了这些结果。在全身性肿瘤模型中(图7A)，对照小鼠的平均生存期为21天。单独经冷冻消融治疗和单独经Thl细胞治疗的小鼠的生存期与对照组没有不同。然而，冷冻消融和肿瘤内Thl治疗的组合导致显著地平均的生存期延长至28. 5天(logrank :p = 0. 0057 ；风险比 3. 194)。在实体肿瘤模型中(图7B)，对照小鼠的平均生存期为观天。在这一模型中，没有一种被测试过的治疗提供显著的生存优势。因为作为治疗结果，冷冻消融方案没有治愈任何小鼠，所以我们把治疗修改为包括在第7天对所有小鼠静脉内输注IxlO5同种异体性Thl细胞。先前显示在第7天静脉内输注IxlO5同种异体性Thl细胞在第0天被注射致死剂量BCLl的小鼠中产生显著的生存优势。这被假设为这种治疗将提供更多时间建立具潜在性治愈性的适应性免疫反应，因而影响经历冷冻免疫治疗的小鼠的生存期。另外，这种治疗将引发对同种异体性抗原的免疫力， 早先在(图6)中显示提供生存优势。图7C(实体性肿瘤模型)和图7D(全身性肿瘤模型)显示了这些研究的结果。在实体性肿瘤模型中，肿瘤面积通过用游标卡尺测量最长长度度和宽度来确定。通过冷冻消融完全切除左侧肿瘤后，只有对侧未被治疗的肿瘤团块被测量。对侧的单独肿瘤生长曲线和用冷冻消融和肿瘤内同种异体性Thl的组合(cryo+Thl)治疗的小鼠的肿瘤生长曲线。 40%的用组合疗法治疗的小鼠没有肿瘤迹象而存活。对侧肿瘤面积被展示以分别显示存活的40%小鼠和最终死于疾病的60%的小鼠的反应。对侧肿瘤的生长在最终死于疾病的 60%的小鼠中显著受抑制(ρ <0.01)。在全身性肿瘤模型中(图7D)，单独接受肿瘤内同种异体性Thl细胞治疗的小鼠平均生存期为观天，这显著长于平均生存期为19天的对照小鼠(logrank :p < 010001 ；风险比=4. 291)。40%的接受cryo+Thl治疗的小鼠存活期大于90天。虽然参考优选实施方案描述了本发明，但是本领域的技术人员将意识到形式和细节在不偏离本发明的精髓和范围时可能有改变。
权利要求
1.含有同种异体性Thl记忆细胞的组合物在制备用于通过增加治疗后循环中Thl细胞数量来治疗疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述组合物包括一种或多种疾病相关抗原。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述抗原是活着的完整细胞或生物体。
4.根据权利要求2所述的应用，其中所述抗原是灭活的完整细胞、生物体或从其而来的裂解物。
5.根据权利要求2所述的应用，其中所述抗原是肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物。
6.根据权利要求1所述的应用，其中所述疾病是癌症。
7.根据权利要求1所述的应用，其中所述疾病是由传染性病原体导致。
8.根据权利要求2所述的应用，其中所述疾病相关抗原是与所述同种异体性被激活的 Thl记忆细胞治疗同时地，分开地或者在其之后施用。
9.根据权利要求1所述的应用，其中所述疾病相关抗原是与同种异体性被激活的Thl 记忆细胞联合的。
10.一种用于在患者中治疗疾病的治疗性组合物，所述组合物包含同种异体性被激活的Thl记忆细胞，其中所述治疗性组合物在施用后在患者循环中增加Thl细胞的数量。
11.根据权利要求10所述的组合物，所述组合物还包含一种或多种疾病相关抗原。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述抗原是活着的完整细胞或生物体。
13.根据权利要求10所述的组合物，其中所述抗原是被灭活的完整细胞、生物体或从其而来的裂解物。
14.根据权利要求10所述的组合物，其中所述抗原是肿瘤细胞或肿瘤细胞裂解物。
15.根据权利要求10所述的组合物，其中所述疾病是癌症。
16.根据权利要求10所述的组合物，其中所述疾病是由传染性病原体导致。
全文摘要
本发明包括疫苗组合物和在主动免疫治疗中使用这些疫苗组合物的方法。疫苗组合物包括同种异体性被激活的Th1记忆细胞。组合物还可包括一种或多种疾病相关抗原。这些方法包括施用疫苗组合物以在正常个体或对疾病易感或有最小残留疾病的患者中提供一种Th1足迹。
文档编号A61P37/00GK102227224SQ200980147749
公开日2011年10月26日 申请日期2009年10月1日 优先权日2008年10月1日
发明者迈克尔·哈-诺伊 申请人:免疫创新治疗有限公司