专利名称：一种肿瘤疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明提供了一种肿瘤疫苗及其制备方法。
背景技术：
胃癌是全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。目前我国就诊的胃癌患者大多属中晚期，手术切除率仅为50%左右，术后5年生存率只有30% 40%。作为手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第四种方法，生物治疗在近年发展迅速。免疫治疗是生物治疗的主要组成部分。肿瘤疫苗是肿瘤特异性的主动免疫治疗,其诱导的机体特异性主动免疫应答,增强机体抗肿瘤能力的作用在动物试验中取得了肯定，许多肿瘤疫苗已进入临床实验研究，显示出良好的前景。胃癌细胞瘤苗是把胃癌细胞用放射线灭活后利用其抗原性诱导机体产生抗癌效 应。存在免疫原性弱、有致瘤性等缺点。降低、消除肿瘤细胞致瘤性，尽量保存其抗原性是研究的重点。自体胃癌细胞瘤苗拥有自体特异的肿瘤抗原和MKN-45分子，比异体肿瘤细胞瘤苗安全有效，但不适合广泛临床应用。异体肿瘤细胞瘤苗适合广泛临床应用，但免疫原性较弱，一般在制备时添加免疫佐剂，如福氏佐剂，病毒，细菌，细胞因子及寡聚脱氧核苷酸等。有些肿瘤疫苗的已进入临床III期研究。希望在不久的将来，能看到某些肿瘤疫苗的标准治疗方案问世。目前所开展的肿瘤基因治疗中，以肿瘤免疫基因治疗的研究为最多。肿瘤细胞靶向的细胞因子基因治疗是以主动免疫治疗为基础，即将细胞因子的持续分泌，从而激发机体产生抗肿瘤免疫反应,达到治疗肿瘤的目的。GM-CSF (粒巨细胞集落刺激因子，granulocyte macrophage colony-stimulatingfactor)是一种主要由巨噬细胞和活化细胞产生的细胞因子，其可通过促进分化成熟树突状细胞(dendritic cell，DC)、巨噬细胞等抗原呈递细胞分化、成熟和活化进而促进Th、Tc、NK识别肿瘤相关抗原，在肿瘤部位浸润，引起系统性抗肿瘤反应，杀伤肿瘤的同时还可促进细胞CD45T细胞分化成熟及黏附分子B7/BB1的表达，提高其抗原呈递能力。另外还可增加巨噬细胞主要组织相容性复合物II (MHC II)的表达，提高其抗原呈递能力。这些功能均提示GM-CSF是一个极具潜力的免疫佐剂。GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞被放射线灭活后往体内注射，可增加局部炎性反应，大量多核细胞、巨噬细胞和DC浸润，促进肿瘤抗原呈递，能够诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。
发明内容
本发明提供了一种GM-CSF基因修饰的肿瘤疫苗及其制备方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是一种肿瘤疫苗及其制备方法，包括mRNA的抽提及cDNA的合成、PCR扩增GM-CSF基因、GM-CSF cDNA的克隆、含GM-CSF重组仙台病毒载体的组建、粒巨细胞集落刺激因子重组仙台病毒包装细胞制备、人胃癌细胞株MKN-45的感染，粒巨细胞集落刺激因子表达活性的基因工程人胃癌细胞的建立及瘤苗的灭活。具体步骤为用含粒巨细胞集落刺激因子的重组仙台病毒上清感染MKN-45，得到粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞，应用6tlCo照射使其灭活。该粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞瘤苗可以用于治疗胃癌。本发明的有益效果是本项目使用的仙台病毒载体表达蛋白质效率极高，大大超过了现有的各种载体。作为新一代病毒载体，仙台病毒载体开发了治疗重症肢体缺血、冠心病、癌症等疾病的治疗制剂以及艾滋病疫苗。本发明使用仙台病毒制备一种肿瘤疫苗及其制备方法，为癌症的治疗提供了一种新的治疗途径。研究表明，粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞瘤苗治疗肿瘤不仅在一定程度上克服了以往临床直接应用细胞因子需反复多次且副作用明显的缺点，而且也取得了较好的疗效。
具体实施例方式第一步含信号肽的粒巨细胞集落刺激因子cDNA的制备。I.粒巨细胞集落刺激因子mRNA的制备(I)人外周血淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，共约I X IO6细胞，经诱导刺激30小时，使细胞因子基因表达，以备抽提mRNA。(2)mRNA的抽提离心收集细胞，悬浮于I. 5mlRNA抽提缓冲液，用注射器反复抽打匀浆细胞，然后再补加3ml抽提缓冲液，充分混合，离心IOOOcpm 5分钟，收集上清。取Oligo (dT) -Cellulose Spun Column,混合内容物,350g离心两分钟,弃去柱内液体,取4ml上清上柱，混匀，弃去液体。然后用高盐缓冲液洗三遍，低盐缓冲液洗二遍，最后用经65°C预热的洗脱缓冲液洗脱三次，每次用0. 25ml，收集洗脱液，然后乙醇沉淀。2.粒巨细胞集落刺激因子cDNA的合成(I)引物的设计与合成根据GenBank中人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因序列设计一对引物，上游引物上游5' -GCTCAAGCTTCTGGAGGATGTGGCTGC-3'(内含 Hind III 位点)；下游5' -GGACGAATTCACTCCTCGAATGGCTCCC-3'。⑵cDNA的合成将mRNA溶于20 ill ddH20中，65°C 10分钟，置于冰上备用。在第一条链反应混合液内加入ImlDTT和热变性的RNA，37°C保湿I小时，最后加I U I Klenow酶，370C 30分钟，65°C 10分钟后再用粉和氯仿抽提，经S印hacryl S-300柱纯化后_20°C保存。3. PCR扩增GM-CSF基因取制备好的PBL cDNAlO yl，加入5 '和3'扩增引物Iu 1>10X反应缓冲液5111、(1见134111、加水至50u 1,94°C 5分钟变性。4. GM-CSF cDNA的克隆为了鉴定PCR产物的准确性，须先将产物克隆入PUC18或pBluescript DNA,经DNA序列测定确认为GM-CSF cDNA无误后再将这一片段回收，并与表达载体重组。故将PCR产物溶于TE，用适当的限制性内切酶水解后，与用同样酶水解过的载体DNA重组，转化TGl后涂于LB/AP平板，37°C培养过夜。5.质粒DNA小量抽提将一个单菌落介入含AP(50ii g/ml)的3ml LB中，37°C培养过夜。将菌液转移至I. 58ml离心管中，5000rpm离心2分钟，沉淀菌体。用100 溶液I悬浮菌体，再加200 ill溶液II，温和颠倒混匀，置于冰上，待溶液澄清后，加入150iU溶液III,充分混勻。15000rpm 10分钟离心,收集上清,用等体积苯酹/氯仿/异戍醇抽提一次，加2. 5倍乙醇混匀，沉淀。离心15000rpml0分钟，将沉淀用70%乙醇洗一次，水泵抽干，最后溶于20 u I TE，用200 u g/ml RNase处理I小时，-20°C存放。6.质粒DNA的大量抽提(I)接种培养将一个单菌落接种于3ml LB (含AP)中培养至对数晚期(0D600 ^ 0. 6)，取500iil接种入50ml含抗菌素的LB中，同样培养至对数晚期，再取15ml接种入含相应抗菌素的I. 5L LB中，培养过夜。(2)质粒抽提将I. 5L培养物离心5500rpm 10分钟，收集菌体。用吸水纸将离心管壁上残余液体擦干。将菌体悬浮于30ml溶液I中，置室温中10分钟。加液体II 60ml,混合均匀后置冰上10分钟。加溶液11145ml，置冰浴10分钟后，15000rpm离心10分钟。纱布过滤后取上清，加等体积异丙醇沉淀，15000rpm离心10分钟，用70%乙醇洗一次，真空 干燥。将沉淀溶于20mlTE，加入等体积5M LiCl沉淀大分子RNA，在水浴中放置10分钟，40C 15000rpm离心10分钟，取上清，用等体积异丙醇沉淀。离心，干燥，溶于5mlTE，加入RNase 至 200 ii g/ml，37°C 30 分钟。加等体积 13% PEG (8000)/I. 5M NaCl 沉淀 DNA，冰浴放30分钟。离心沉淀，干燥后用TE5ml溶解,用苯酹、苯酹/氯仿/异戍醇、氯仿/异戍醇各抽提-次。最后加1/10体积3M NaAc及2倍乙醇沉淀。-20°C保存。用时再离心沉淀，溶于TE。(3) CsCl超离心纯化DNA :如上述碱法抽提的DNA，经LiCl纯化后，用CsCl超速离心，按lg/ml的用量，加入固体CsCl，30°C溶解。每IOmlDNA加入0. 8ml溴乙锭溶液(IOmg/ml)，CsC溶液的最终密度是I. 55g/ml，折射率I. 3860，溴化乙锭浓度约为704 y g/ml。室温8000rpm5分钟，浮在溶液上的是溴化乙锭和蛋白质形成的复合物。将浮渣下的清亮溶液用注射器吸入用于超滤芯的离心管中，用轻石蜡油补满其余部分，并封口。45000转/分离心24-48小时(20°C)。离心完毕，在普通光照下可见两条DNA区带，下部区带由闭环质粒DNA组成，用针头插入此带，吸出至I. 5ml管中，用等体积的经水饱和的正丁醇反复抽提，直至粉红色从水相和有机相中小时。将水相加3倍TE稀释，加2. 5倍无水乙醇沉淀。离心后用70%乙醇洗一次，抽干后溶于TE，-20°C保存。7.限制性内切酶反应根据不同的限制性内切酶选择相匹配的缓冲液。一般取0. 5-1 u g DNA,限制性内切酶5U，反应体积20iU，37°C保湿1-2小时，用I. 2%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙锭0. 5-1 u g/ml)鉴定酶切结果。8.冻融法回收酶切片段在紫外灯下将DNA片段从琼脂糖凝胶中切下来，加入IOOu I TE，在干冰乙醇内冻结后置37°C 15分钟，反复三次，15000rpm离心10分钟后吸出上清,加入1/10体积NaAc和2倍体积乙醇沉淀，离心收集，沉淀经水泵抽干后,溶于TE，即可进行连接反应。9. DNA连接将等克分子数的待连接DNA混合，加入5 X T4连接酶缓冲液4 yl，加水至20iU，加入T4DNA连接酶2U，12°C连接过夜，即可用于转化。10.重组DNA的转化(I)感受态细胞制备将培养过夜的受体菌250iU接种于50iULB中，37°C 1.5-3小时至对数中期，菌液至冰浴10分钟，5000rpm离心5分钟，沉淀菌体用1/2体积经预冷的IOOmM MgCl2悬浮，冰浴20分钟，4°C 5000rpm离心5分钟，将菌体悬浮于1/15-1/10体积的IOOmM CaCl2中，冰浴中放60分钟，即可用于转化。(2)重组DNA的转化将连接过夜的DNA加入IOOul感受态细胞，混匀，冰浴中放置40分钟，间或轻轻混匀，42 °C 2分钟，涂布于含抗菌素的LB平板上，37 °C培养过夜。10.双链 DNA 测序(I)双链变性样品DNA约I. 5_2ug，溶于8ulddH20后，加2MNa0H2ul，至室温10分钟,加3ul 3MNaAc中和，再加7ulddH20后，加60ul乙醇沉淀,离心1500rpml0分钟,抽干后溶于 10ulddH20。(2)退火反应10ul变性模板，加2ul引物，2ul退火缓冲液，65°C 5分钟，缓慢冷
却至室温。(3)延伸反应将退火后的反应液加入lulddH20标记物3ul、17聚合酶2ul (3U)、 和0. 5ul同位素(a -32P)标记的dATP，室温反应5分钟。(4)终止反应取上述反应液4. 5ul至预先分装好的4管分别标记有G、A、T、C的终止混合物中(各2. 5ul)，混匀，37°C 5分钟，加5ul终止液，在电泳上样前样品置75_80°C 2分钟变性。第二步含GM-CSF重组仙台病毒载体的组建。将用EcoRI和BamHI酶切，与经同样酶切的GM-CSF相连接，重组载体经酶切鉴定后有正确的插入片段，命名为GM-CSF-SV。第三步产生含粒巨细胞集落刺激因子重组仙台病毒的包装细胞的建立。仙台病毒载体是一种很有效的基因转移系统。复制仙台病毒载体经包装细胞包装，可产生出高滴度的病毒颗粒，并能高效感染靶细胞，通过整合至宿主细胞基因而获得长期稳定表达。本研究采用安全性较高的包装细胞293T对含GM-CSF基因的仙台病毒载体GM-CSF-SV进行包装，产生出具有高滴度且不具有复制能力的重组仙台病毒。I.病毒滴度测定病毒滴度测定一 NIN313/TK为指示靶细胞。I X IO5靶细胞培养I天后，加入经过稀释的含病毒上清液，并加入Polybrene (8 u g/ml)。37°C，5 % CO2培养3天后，更换培养液，并加入G418 (0. 5mg/ml)进行筛选。10-14天后可见抗G418细胞克隆形成,Giemsa染色后，计算克隆数确定病毒滴度。2.病毒上清的保存选择病毒滴度大于I X 104CFU/ml的293T克隆进行扩增培养，收集24小时新鲜上清，于-70°C冻存备用。第四步粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞种子细胞库的建立I.重组仙台病毒感染当细胞生产成80%融合时，加入GM-CSF-SV重组仙台病毒上清(滴度I X IO6CFU/ml)，并加入Polybrene至终浓度为8iig/ml，置37°C，5%C02培养24小时，按I 2或I 4传代后加入终浓度为0. 5mg/ml的G418，筛选培养约二周后，可见G418抗性细胞呈克隆化生产。挑取单个克隆至24孔板中继续扩增培养，建立克隆化细胞系。2.基因组DNA的抽提分别将IXlO6肿瘤细胞用PBS洗二次，0.25%胰酶消化，800转离心6分钟，力口0.9ml细胞裂解液(STE20iU，20% SDS 15 yl，蛋白酶K10mg/ml)，37°C保温过夜后，苯酚氯仿异戊醇(25 24 I)抽提二次，氯仿异戊醇24 I抽提一次，按1/10体积加入5M NaCl，按2倍体积加入无水乙醇混匀后得DNA沉淀，70%乙醇洗一次后TE溶解备用。3.细胞总RNA抽提按异硫氰酸胍-酚氯仿一步抽提法抽提细胞总RNA。分别取各种细胞1X107，PBS洗二次,加PBS Iml后平分移入两支I. 5ml Eppendorf■管中，1200rpm离心弃上清后，细胞加溶液D500 u I迅速吸打使细胞裂解以抑制RNA酶活性。加50 ill 2M NaAc (pH4. 0)，500 u I, DEPC H20饱和的新鲜重蒸酚，200 氯仿异戊醇(49 I)，混匀后置冰浴15分钟，12000rpm离心15分钟。吸出含RNA水相，加I倍体积异丙醇混匀，_20°C过夜。12000rpm琉璃心15分钟，沉淀家150 ill溶液D溶解后，加等体积异丙醇，-20°C放置I小时以上，12000rpm离心15分钟。沉淀用75%乙醇洗一次后用50 u I DEPC水溶解，65°C水浴10分钟，-70°C冻存备用。
4. PCR先94°C 5分钟，接60°C 5分钟，然后进行35个循环反应，最后72°C 10分钟。反应体系为30111(10父反应缓冲液3111，5’及3’引物各1111(25 11101)，1.25臟01 dNTP 2u I,样品DNAl u个，ddH20至30 ill)。反应结束后I. 5_2%凝胶水平或6% PAGE垂直凝胶电泳鉴定。5. RT-PCR逆转录反应取各细胞总RNA各5 ill (I ii g/ ill)，加入RNA酶抑制剂0. 5 U 1，随机引物2iil，65°C 5分钟后置冰浴上加入RNA酶抑制剂0. 5iil，5XRuffer 4 u I, dNTP 7u I,Mo-MuLV逆转录酶I 后置37°C I. 5小时。加入终止液后备用。PCR反应各取上述逆转录反应液2iU作为模板，按上述PCR方法进行扩增，^ -actin引物作为内标准。6. Southern 印迹杂交(I)DNA酶解取各细胞基因组DNA各30 iig，溶于17 ill水中，加2 iUSac I酶切缓冲液(10倍)，混匀后加入2 ill Sac I (30U/ u I)，37°C保温过夜。(2)电泳及转移上述酶解液5°C加2°C溴酚兰上样缓冲液后，上1%琼脂糖凝胶电泳，70V、30mA电泳2_3小时。EB染色观察是否酶解完全。如果酶解不完全，则再加入I U I Sac I继续保温2-3小时使其完全溶解。然后按上述条件进行电泳，电泳结束后胶浸泡于变性液(I. 5M NaCl,0. 5M NaOH)中40分钟，然后再中和液(1M Tris. Cl, I. 5M NaCl)中浸泡30分钟。转移至尼龙膜方法按分子克隆手册进行。(3)探针制备以含细胞因子基因的逆转率病毒载体质粒为模板，按上述PCR方法制备 Neo 及 GM-CSF 的 DNA 探针，dNTP 用宝灵曼的 PCR DIG labeling mix (No. 1585550)替代。杂交及检测采用宝曼灵公司推荐方法进行。7.粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞种子细胞冻存0.25%胰酶消化粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞种子细胞后，移入5ml培养液中，以800rpm离心5分钟，将上清吸尽，按I X IO6细胞加Iml冻存液(含30%小牛血清及10% DMS0)，移入冻存管中。先放在4°C降温30分钟，然后移入气态的液氮中继续降温30分钟，最后将冻存管放入液氮生物容器内的液氮保存。第五步瘤苗的灭活
I.细胞收集及洗涤常规扩增培养的粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞，用PBS洗涤两次后，以0. 25%胰酶消化，收集I X IO8细胞至400ml离心瓶中，内含400mlpH7. 4无钙、镁磷酸缓冲液(PBS)。以IOOOrpm离心10分钟清晰，共清洗三次，最后将PBS上清吸尽，按I X IO7细胞加Iml冻存液，移入冻存管中。2. 60Co照射粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞瘤苗癌细胞在6ciCo治疗仪(THERATRON 780-C)下，按40G、60G、100G辐射强度分别进行照射，照射后的细胞命名为粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞瘤苗(HG-1/GM-CSF)。3. HG-1/GM-CSF 冻存先放在4°C降温30分钟，然后移入气态的液氮中继续降温30分钟，最后将冻存管放入液氮生物容器内的液氮里保存。 4.HG-1/GM-CSF细胞存活率测定将复苏后的HG-1/GM-CSF，用5ml完全培养液悬浮。取4滴于载玻片上，用0. 1%台酚兰(溶于0.9%生理盐水)染色2-3分钟，观察结果。细胞中有深蓝色颗粒浸润即为死亡细胞，透亮的则为活细胞。4滴样品各随机取视野计数100个细胞，细胞存活率-活细胞数/100. 4滴样品的平均值即为某一天的活细胞数，将总细胞数X存活率即得总活细胞数。本项目已将GM-CSF基因修饰过的MKN-45胃癌细胞株作为实验瘤苗，经证实其在体内能持续分泌相应的细胞GM-CSF，提高机体的免疫原性，激活机体的免疫系统进行肿瘤杀伤，预防肿瘤的复发及转移。国外有类似药物已进入I I期临床试验，但国内尚无类似药品开发。本项目目前已经将编码GM-CSF的基因克隆克隆于仙台病毒载体SV/GM-CSF，用该载体转录包装细胞PA317，获得病毒颗粒。用含GM-CSF基因的重组仙台病毒转导胃癌细胞株(MKN-45/-A2阳性)，并进行分子生物学分析，确定转导细胞能分泌GM-CSF。实验瘤苗经60Co照射后，转导细胞尚能持续分泌细胞因子长达2 3周，但致瘤性消失，且不含仙台病毒的复制能力。主要用于胃癌手术后复发、转移或不能手术且缺乏其它治疗方法的晚期胃癌患者。本生产工艺新颖、技术成熟。该工艺目前已经达到了国际先进水平、工艺简单、易于工业化、成本大大降低，适合中国的购买需求，产品上市后将填补国内市场的空白。具体实施例I选择我国人群MKN-45I类抗原频率最多的MKN-452阳性的MKN-45胃癌细胞株为对象。采用GM-CSF-mRNA的抽提及cDNA的合成、PCR扩增GM-CSF基因、GM-CSF cDNA的克隆、含GM-CSF重组仙台病毒载体的构建、GM-CSF重组仙台病毒包装细胞制备、人胃癌细胞株MKN-45的感染、6tlCo治疗仪进行照射灭活肿瘤细胞等细胞生物学、分子生物学、病毒学等技术，获得GM-CSF表达活性的基因工程人胃癌细胞瘤苗，经常规扩增培养，在6tlCo治疗仪进行照射灭活，照射后的细胞命名为GM-CSF基因工程人胃癌细胞瘤苗(HG-1/GM-CSF)。具体实施例2粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞经不同剂量的6tlCo辐射后在体外均丧失了增殖能力，且随着培养天数的增加，细胞存活率下降，活细胞数减少。如表2所示，辐射一周后细胞的存活率为50%，且不同辐射剂量间无差异。经60G和100G照射的细胞，在培养至第25天时细胞全部死亡。将上述三种剂量照射的基因工程人胃癌细胞(HG-UGM-CSF)接种于裸鼠，均未产生肿瘤，说明致瘤性消失。表I粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞6°C0照射后的存活率
权利要求
1.一种肿瘤疫苗及其制备方法，其特征在于该胃癌细胞株为MKN-45，该细胞株表达MKN-45-A2分子。该粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞有如下步骤得到用含粒巨细胞集落刺激因子的重组仙台病毒上清感染MKN-45，得到粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞，应用6°Co照射使其灭活。该粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞瘤苗可以用于治疗胃癌。
2.如权利要求I所述，其特征在干，胃癌细胞株为MKN-45。
3.如权利要求I所述，其特征在于，该细胞株表达MKN-45-A2分子。
4.如权利要求I所述，其特征在于，应用6tlCo照射使其灭活。
5.如权利要求I所述，其特征在于，该粒巨细胞集落刺激因子基因修饰人胃癌细胞瘤苗可以用于治疗胃癌。
全文摘要
本发明提供了一种肿瘤疫苗及其制备方法。从人外周血单核细胞中抽提mRNA，在体外合成cDNA，运用聚合酶链反应技术克隆了含有信号肽的粒巨细胞集落刺激因子cDNA，并与仙台病毒载体进行重组，构建了含粒巨细胞集落刺激因子cDNA的重组仙台病毒载体GM-CSF-SV。采用安全性较高的包装细胞293T对含GM-CSF基因的仙台病毒载体GM-CSF-SV进行包装，产生出具有高滴度且不具有复制能力的重组仙台病毒，感染人胃癌细胞株MKN-45，建立了具有GM-CSF表达活性的基因工程人胃癌细胞，采用60Co照射，在摸索了不同的照射剂量后，制备了GM-CSF基因修饰人胃癌细胞瘤苗。
文档编号A61P35/00GK102772791SQ201110121509
公开日2012年11月14日 申请日期2011年5月12日 优先权日2011年5月12日
发明者古长庆, 李晓眠, 沈丽丽, 王国新, 王智佳, 王鹏, 赵钢 申请人:天津泽世德生物医药有限公司