专利名称：抗ctla－4的人单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明背景1.相关申请的交叉参考本发明要求1998年12月23日申请的美国临时专利申请系列号60/113，647的优先权，其说明书作为整体在本文中引用。
2.本发明小结根据本发明，提供了抗人细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4)的全人单克隆抗体。且提供了编码含有重链和轻链免疫球蛋白分子之氨基酸序列的核苷酸序列，特别是跨越互补性决定区(CDR)的连续重链和轻链序列，且特别是从FR1内和/或CDR1到CDR3和/或FR4内。还提供了与本文揭示的抗体具有相似结合特性的抗体及具有相似功能性的抗体(或其它拮抗物)。
3.技术背景对病人免疫反应的调节可对许多人类疾病提供所需的治疗，该治疗可能导致通过使用常规药物很少发现的作用特异性。上调和下调免疫系统的反应都是可能的。T细胞和B细胞的的作用已被广泛研究且其特征在于与免疫反应的调节相联系。根据这些研究，在许多情况下，T细胞的作用在疾病的预防和治疗中似乎是特别重要的。
T细胞具有非常复杂的系统以控制其相互作用。T细胞间的相互作用过程中利用了许多受体和可溶性因子。因此在该免疫反应中任何具体信号可能具有的效应一般是变化的且依赖于在该途径中涉及的具体因子，受体和反受体。下调反应的途径与激活所需的途径同样重要。导致T-细胞耐受性的胸腺驯育是防止对特定抗原发生免疫反应的一种机制。其它机制，如抑制性细胞因子的分泌也是已知的。
T细胞的激活不仅需要通过抗原受体(T细胞受体(TCR))的刺激，而且还需要通过诸如CD28的共同刺激表面分子的信号。CD28的配体是B7-1(CD80)和B7-2(CD86)蛋白质，它们在诸如树突细胞，激活的B-细胞或单核细胞的抗原呈递细胞上表达且与T细胞CD28或CTLA-4相互作用以传递共同刺激信号。Perrin等在免疫学研究14189-99(1995)中用实验性变应反应性脑脊髓炎(EAE)研究了共同刺激信号的作用。EAE是由Th1细胞针对髓鞘抗原诱导的自身免疫疾病，它在病理学免疫反应诱导中提供了研究B7-介导的共同刺激作用的体内模型。使用B7受体的可溶性融合蛋白配体，以及CD80或CD86特异性的单克隆抗体，Perrin等证实了在EAE中B7共同刺激在决定临床结果中起显著的作用。
B7和CD28之间的相互作用是几个共同刺激性信号途径之一，这些途径似乎足以触发抗原特异性T-细胞的成熟和增生。缺乏共同刺激及伴随的IL-2生产不足阻止了T细胞随后的增生并诱导一种称为“无变应性”的无反应性状态。各种病毒和肿瘤可能阻断T细胞激活和增生，导致宿主免疫系统对感染的或转化的细胞活性不足或无反应性。在许多可能的T细胞障碍中，无反应性可能至少部分地对宿主不能清除病原性或肿瘤原性细胞负责。
Chen等，细胞，711093—1102(1992)和Townsend及Allison，科学259368(1993)已描述了B7蛋白质介导抗肿瘤免疫性的用途。Schwarts，细胞711065(1992)对CD28，CTLA-4和B7在IL-2生产和免疫治疗中的作用进行了综述。Harding等，自然，356607—609(1994)证实了CD28介导的信号共同刺激鼠T细胞并防止在T细胞克隆中诱导无反应性。也参见美国专利号5,434,131,5,770,197和5,773,253及国际专利申请号WO93/00431,WO95/01994,WO95/03408,WO95/24217和WO95/33770。
从上述情况，很清楚T-细胞需要2类来自抗原呈递细胞(APC)的信号以激活并随后分化效应器功能。首先，要有由T-细胞上的TCR与APC上的MHC分子呈递肽之间的相互作用产生的抗原特异性信号。其次，要有由CD28与B7家族的成员(B7-1(CD80)或B7-2(CD86))相互作用介导的抗原非依赖性信号。确切地说，CTLA-4所适合的免疫反应环境起始是含糊的。Brunet等，自然328267—270(1987)首先鉴定并克隆了鼠CTLA-4，作为寻找在细胞毒性T淋巴细胞上优选表达的分子的部分内容。随后很快由Dariavach等，欧洲免疫学杂志，181901—1905(1988)鉴定并克隆了人CTLA-4。鼠和人CTLA-4分子具有大约76％的总体序列同源性且在其胞质区内具有接近完全的序列相同性(Dariavach等，欧洲免疫学杂志，181901—1905(1988))。CTLA-4是免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白质中的一员。Ig超家族是均具有Ig分子可变区(V)或恒定区(C)的关键结构特征的一组蛋白质。Ig超家族的成员包括但不限于免疫球蛋白本身，主要组织相容性复合物(MHC)类分子(即，MHC I和II型)，和TCR分子。
1991年，Linsley等，实验医学杂志，174561—569(1991)认为CTLA-4是B7的第二种受体。类似地，Harper等，免疫学杂志，1471037—44(1991)证实在小鼠和人类中，CTLA-4和CD28分子在序列，信息表达，基因结构和染色体定位方面密切相关。也参见Balzano等，国际癌症杂志增刊，728—32(1992)。这一作用的进一步证据通过功能研究获得。例如，Lenschow等，科学257789—792(1992)证实CTLA-4-Ig诱导胰岛移植物的长期存活。Freeman等，科学，262907—909(1993)检查了CTLA-4在B7缺陷型小鼠中的作用。在Lenschow等，美国国家科学院院报，9011054—11058(1993)中描述了对CTLA-4配体的检查。Linsley等，科学，257792—795(1992)描述了用可溶形式的CTLA-4进行的体内免疫抑制。Linsley等，实验医学杂志，1761595—604(1992)制备了结合CTLA-4的抗体且它不与CD28交叉反应，推论出CTLA-4与CD28在激活的T淋巴细胞上共同表达且共同协作调节T细胞粘附和由B7引起的激活。Kuchroo等，细胞80707—18(1995)证实B7-1和B7-2共同刺激分子有区别地激活Th1/Th2发育途径。Yi-qun等，国际免疫学837—44(1996)证实静息的与针对可溶性回忆抗原最近激活的记忆T细胞对于来自B7家族成员的共同刺激信号存在不同的要求。也参见de Boer等，欧洲免疫学杂志，233120—5(1993)。
一些小组认为与CD28相比，CTLA-4是另一种或不同的受体/配体相互作用，甚至认为是由BB1抗体识别的第三种B-7复合物。例如，参见，Hathcock等，科学，262905—7(1993)，Freeman等，科学，262907—9(1993)，Freeman等，实验医学杂志1782185—92(1993)，Lenschow等，美国国家科学院院报，9011054—8(1993)，Razi-Wolf等，美国国家科学院院报，9011182—6(1993)，和Boussiotis等，美国国家科学院院报，9011059—63(1993)。但是，参见Freeman等，免疫学杂志，1612708—15(1998)，其中讨论的发现是，BB1抗体结合与CD74的细胞表面形式相同的分子，因此，BB1单克隆抗体结合与B7-1不同的蛋白质，且该表位也存在于B7-1蛋白质上。因此，这一观察结果需要本领域重新考虑在分析CD80表达和功能中使用BB1 mAb的研究。
始于1993年且在1995年达到高潮，研究者开始进一步描绘CTLA-4在T-细胞刺激中的作用。首先，通过使用抗CTLA-4的单克隆抗体，Walunas等，免疫学，1405—13(1994)提供的证据是CTLA-4可作为T细胞激活的负调节物而起作用。随后，Waterhouse等，科学270985—988(1995)证实CTLA-4缺陷型小鼠在其淋巴结和脾中积累带有上调激活标记的T细胞母细胞。当通过T细胞受体刺激时，该母细胞也渗入肝脏，心脏，肺和胰组织，且血清免疫球蛋白的量上升，其T细胞自发且强烈增生，然而，它们对由Fas受体的交联和由γ照射诱导的细胞死亡敏感。Waterhouse等推论CTLA-4充当T细胞活化的负调节物且对控制淋巴细胞内环境稳定是必不可少的。在相同文献的评论中，Allison和Krummel，科学，270932—933(1995)认为Waterhouse等的工作指出了CTLA-4用于下调T-细胞反应性或在T-细胞活化和发育中具有抑制信号作用。Tivol等，免疫，3541—7(1995)也生产了CTLA-4-缺陷性小鼠并证实该小鼠迅速形成具有多器官淋巴细胞渗入和组织破坏的淋巴增生性疾病，特别是具有严重心肌炎和胰腺炎。他们推论出CTLA-4在下调T细胞活化和维持免疫学内环境稳定中起关键作用。另外，Krummel和Allison，实验医学杂志182459—65(1995)进一步阐述了CD28和CTLA-4在T细胞刺激反应中具有相反的作用。他们产生了抗CTLA-4的抗体且使用高度纯化的T细胞研究了其在系统中结合CTLA-4的效力。在其报道中，他们表明在新鲜移出的T细胞上低水平B7-2的存在可部分抑制T细胞增生，且这种抑制受与CTLA-4相互作用的介导。CTLA-4与TCR和CD28的交联强烈抑制增生和T细胞分泌IL-2。最后，这些结果表明在测定对抗原的反应中，CD28和CTLA-4传递似乎由T细胞整合的相反信号。因此，他们得出的结论是T细胞抗原受体刺激的结果由CD28共同刺激信号，以及来自CTLA-4的抑制信号调节。也参见Krummel等，国际免疫学，8519—23(1996)和美国专利号5811097及国际专利申请号WO97/20574。
已进行的各种其它实验进一步阐明了CTLA-4的上述功能。例如，Walunas等，实验医学杂志，1832541—50(1996)，通过使用抗-CTLA-4抗体表明CTLA-4信号不能调节细胞存活或对IL-2的反应，但能抑制CD28依赖性IL-2生产。另外，Perrin等，免疫学杂志，1571333—6(1996)证实抗-CTLA-4抗体在实验性变应反应性脑脊髓炎(EAE)中恶化该疾病且增大死亡率。疾病恶化与致脑炎的细胞因子TNF-α，IFN-γ和IL-2的生产增强相联系。因此，他们推断CTLA-4调节EAE中自身免疫反应的强度，减弱发炎性细胞因子生产和临床疾病症状。也参见Hurwitz等，神经免疫学杂志，7357—62(1997)和Cepero等，实验医学杂志，188199—204(1998)(在基因转移进鼠T-细胞模型后特异性消除CTLA-4表达的抗-CTLA-4发夹核酶)。
另外，Blair等，免疫学杂志，16012—5(1998)评价了一组CTLA-4单克隆抗体(mAbs)对静息人CD4+T细胞的功能性影响。他们的结果证实一些CTLA-4 mAb可抑制静息CD4+细胞的增生反应且细胞周期从G0转变为G1期。CTLA-4的抑制效应在4小时内较明显，此时细胞表面CTLA-4的表达检测不到。然而其它CTLA-4 mAbs检测不到抑制效应，表明mAbs单与CTLA-结合不足以介导T细胞反应的下调。令人感兴趣的是，尽管IL-2生产关闭，但抑制性抗-CTLA-4 mAb允许诱导和表达细胞存活基因bcl-X(L)。与这一观察结果一致，细胞仍然存活且CTLA-4连接后检测不到细胞程序死亡。
与无反应性相联系，Perez等，免疫，6411—7(1997)证实了经过阻断CTLA-4防止诱导T细胞无反应性且推断CD28或T细胞上的CTLA-4与B7分子的相互作用决定T细胞抗原识别的结果。另外，VanParijs等，实验医学杂志，1861119—28(1997)检查了白细胞介素12和共同刺激物在体内T细胞无反应性中的作用并发现在无反应性诱导期间通过抑制CTLA-4接合，抑制T细胞增生，且不能启动完全的Th1分化。然而，在IL-12和抗CTLA-4抗体存在下与耐受原性抗原接触的T细胞不发生无反应性，且行为与遇到免疫原性抗原的T细胞相同。这些结果表明，有两种方法帮助诱导体内无反应性CTLA-4结合导致阻断T细胞增生的能力，和缺乏原型性炎症细胞因子IL-12，它防止T细胞分化成Th1效应器细胞。IL-12与抗-CTLA-4抗体的组合足以将正常耐受原性刺激物转变为免疫原性刺激物。
与感染相联系时，McCoy等，实验医学杂志，186183—7(1997)证实抗CTLA-4抗体极大地增强和加速对Nippostrongylusbrasiliensis的T细胞免疫反应，导致成虫数显著减少且较早地终止寄生虫卵的生产。也见Murphy等，免疫学杂志，1614153—4160(1998)(Leishmania donovani)。
对于癌症，Kwon等，PNAS USA 948099—103(1997)建立了同源鼠前列腺癌模型并检查了2种不同的操作以通过增强的T细胞共同刺激诱导抗前列腺癌反应(i)经过转导表达B7.1配体的前列腺癌细胞提供直接共同刺激和(ii)体内抗体介导的T细胞CTLA-4阻断，它防止T细胞下调。已证实体内抗体介导的CTLA-4阻断增强抗前列腺癌免疫反应。另外，Yang等，癌症研究，574036—41(1997)研究了CTLA-4功能的阻断是否在肿瘤生长的各个阶段导致抗肿瘤T细胞反应的增强。根据体外和体内结果，他们发现在携带肿瘤的个体中CTLA-4阻断增强了产生抗肿瘤T-细胞反应的能力，但在其模型中这种增强效应的表达局限于肿瘤生长的早期。另外，Hurwitz等，美国国家科学院院报，9510067—71(1998)研究了T细胞介导的抗肿瘤反应的产生依赖于由主要组织相容性复合物/抗原与T细胞受体的结合以及CD28与B7的结合。某些肿瘤，如SM1乳腺癌对抗-CTLA-4免疫治疗无反应性。因此，通过使用CTLA-4阻断并结合由表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的SM1细胞组成的疫苗，观察到原发性SM1肿瘤消退，尽管单独使用的一种治疗无效。这种结合治疗导致对SM1的长期免疫并依赖于CD4(+)和CD8(+)T细胞。这些发现表明CTLA-4阻断在宿主产生的抗原呈递细胞水平上起作用。
对于糖尿病，Luhder等，实验医学杂志，187427—32(1998)在疾病的不同阶段将抗-CTLA-4 mAb注射进糖尿病的TCR转基因小鼠模型中。他们发现首先激活潜在的致糖尿T细胞时CTLA-4的结合是关键性事件；如果发生结合，则胰岛发病，但仍有几个月是良性的。如果不结合，则胰岛炎更恶化，且很快接着发生糖尿病。
对于疫苗免疫，Horspool等，免疫学杂志，1602706—14(1998)发现完整的抗-CTLA-4 mAb而不是Fab片段抑制对pCIA/β-gal的初级体液反应而不影响回忆反应，表明CTLA-4激活抑制Ab生产而不抑制T细胞引发。CD28和CTLA-4，CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的配体阻断揭示了不同的且无重叠的功能。在起始免疫时CD80的阻断完全取消了初级和次级Ab反应，而CD86阻断抑制初级而不是次级反应。同时阻断CD80＋CD86比单独阻断后一个对于抑制Ab反应具有较小的影响。经过共同注射表达B7的质粒增强共同刺激可增大CTL反应而不是Ab反应，且没有由Th1向Th2倾斜的证据。这些发现表明CD28，CTLA-4，CD80和CD86在核酸接种后的T细胞共同刺激中具有复杂的且不同的作用。
至于同种异体移植排斥，Markees等，临床研究杂志，1012446—55(1998)发现在皮肤同种异体移植排斥的小鼠模型中，接受最初依赖于存在IFN-γ，CTLA-4和CD4(+)T细胞。在该方法中加入抗CTLA-4或抗-IFN-γ mAb与迅速移植排斥相联系，而抗IL-4 mAb无影响。
至于与CD28相关的CTLA-4的作用，Fallarino等，实验医学杂志，188205—10(1998)产生了用表达抗原的肿瘤免疫的TCR转基因/重组酶激活基因-2缺陷型/CD28-野生型或CD28-缺陷型小鼠。来自两种类型小鼠的引发的T细胞产生细胞因子且与缺乏B7表达的刺激细胞反应而增生。然而。当CD28+/+T细胞的反应被B7-1的共同刺激增大时，CD28-/-T细胞的反应被强烈抑制。这种抑制可被抗B7-1或CTLA-4的单克隆抗体逆转。因此，缺乏CD28时，CTLA-4有效地抑制T细胞激活，这表明TCR介导的信号的拮抗作用足以解释CTLA-4的抑制效应。另外，Lin等，实验医学杂志，188199—204(1998)研究了CD28缺陷型小鼠中心脏同种异体移植的排斥。H-2(g)心脏移植进同种异体野生型或CD28-缺陷型小鼠(H-2(b))。与野生型小鼠相比，在CD28-缺陷型中移植排斥延迟。用CTLA-4-免疫球蛋白(Ig)，或用抗B7-1加抗-B7-2 mAb处理野生型受体明显延长同种异体移植的存活。相反，用CTLA-4-Ig，抗-B7-1加抗B-7-2 mAb处理CD28-缺陷型小鼠或者阻断抗-CTLA-4 mAb诱导加速同种异体移植排斥。这种移植排斥速率的增加与更严重的单核细胞浸入和未处理的野生型和CTLA-4-Ig-或抗-CTLA-4mAb-处理的CD28-缺陷型小鼠供体心脏中IFN-γ和IL-6转录子水平的增加相关。因此，CTLA-4的负调控作用超过了通过配体竞争阻止CD28激活的潜力。即使在缺乏CD28时，CTLA-4在同种异体移植排斥的调节中起抑制作用。
另外，已研究了CTLA-4表达的进一步鉴定。例如，Alegre等，免疫学杂志，1574762—70(1996)认为表面的CTLA-4被迅速内吞，这可解释在细胞表面一般检测到低水平的表达。他们推断CD28和IL-2在CTLA-4表达的上调中均起重要作用。另外，CTLA-4的细胞表面积累似乎主要由其迅速的内吞来调节。此外，Castan等，免疫学，90265—71(1997)根据CTLA-4表达的原位免疫组织学分析表明CTLA-4阳性的胚中心T细胞对于免疫调节是重要的。
因此，鉴于CTLA-4似乎具有免疫反应性的广泛且关键的作用，需要产生可有效用于免疫治疗的抗CTLA-4的抗体。而且，需要产生可用于需重复施用抗体的慢性疾病的抗CTLA-4的抗体。
附图的简要描述
图1提供了根据本发明的一系列重链和κ轻链免疫球蛋白分子的核苷酸和氨基酸序列4.1.1(图1A)，4.8.1(图1B)，4.14.3(图1C)，6.1.1(图1D)，3.1.1(图1E)，4.10.2(图1F)，2.1.3(图1G)，4.13.1(图1H)，11.2.1(图1I)，11.6.1(图1J)，11.7.1(图1K)，12.3.1.1(图1L)和12.9.1.1(图1M)。
图2提供了来自克隆4.1.1,4.8.1,4.14.3,6.1.1,3.1.1,4.10.2,4.13.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1预测的重链氨基酸序列与种系DP-50(3-33)氨基酸序列的序列比较。DP-50种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还显示了抗体CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图3提供了克隆2.1.3预测的重链氨基酸序列与种系DP-65(4-31)氨基酸序列之间的序列对比。DP-65种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线表示了抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图4提供了克隆4.1.1,4.8.1,4.14.3,6.1.1,4.10.2和4.13.1的κ轻链氨基酸序列与种系A27氨基酸序列之间的序列对比。A27种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。该图还以下划线显示了抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。克隆4.8.1，4.14.3和6.1.1的CDR1中明显的缺失以“0”表示。
图5提供了克隆3.1.1,11.2.1,11.6.1和11.7.1的预期κ轻链氨基酸序列与种系012氨基酸序列之间的序列对比。012种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线表示了抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图6提供了克隆2.1.3预测的κ轻链氨基酸序列和种系A10/A26氨基酸序列之间的序列对比。A10/A26种系序列与克隆中的序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线表示了抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图7提供了克隆12.3.1的预测κ轻链氨基酸序列与种系A17氨基酸序列之间的序列对比。A17种系序列与克隆序列之间的差异以黑体字表示。图中还以下划线表示了抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图8提供了克隆12.9.1的预测的κ轻链氨基酸序列与种系A3/A19氨基酸序列之间的序列对比。A3/A19种系序列与克隆中的序列之间的差异以黑体字表示。该图中还以下划线表示了抗体的CDR1，CDR2和CDR3序列的位置。
图9提供了通过对抗体的重链和轻链进行直接蛋白质测序产生的N-端氨基酸序列的总结。
图10提供了根据本发明的某些抗体的某些其它鉴定信息。在图10A中，概括了与克隆3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.14.3和6.1.1相关的数据。提供的数据涉及浓度，等电聚焦(IEF)，SDS-PAGE，大小排阻色谱，液体色谱/质谱(LCMS)，质谱(MALDI)，轻链N-端序列。在图10B中提供了与IEF相关的其它详细信息；10C中提供了与SDS-PAGE相关的数据；10D中提供了4.1.1抗体的SEC。
图11显示了使用抗-CD80-PE和抗-CD86-PEmAb在Raji细胞上表达B7-1和B7-2。
图12显示了用抗-CTLA-4阻断抗体(BNI3，4.1.1，4.8.1和6.1.1)诱导的T细胞母细胞/Raji测定中IL-2生产的浓度依赖性增强。
图13显示了用抗-CTLA-4阻断抗体(BNI3，4.1.1，4.8.1和6.1.1)诱导的T细胞母细胞/Raji试验中IFN-γ生产的浓度依赖性增强(相同供体T细胞)。
图14显示了在T细胞母细胞/Raji测定中以抗-CTLA-4阻断抗体诱导的来自6个供体的T细胞中IL-2生产的平均增强值。
图15显示了在T细胞母细胞/Raji测定中抗-CTLA-4阻断抗体诱导的来自6个供体的T细胞中IFN-γ生产的平均增强值。
图16显示了用SEA刺激后在72小时时测量的以抗-CTLA-4阻断mAbs诱导的来自5个供体的hPBMC中IL-2生产的增强。
图17显示了用SEA刺激后在72和96小时时测量的以抗-CTLA-4阻断mAbs诱导的来自3个供体的全血中IL-2生产的增强。
图18显示了在鼠纤维肉瘤肿瘤模型中用抗鼠CTLA-4抗体抑制肿瘤生长。
图19显示了在72小时T母细胞/Raji和超级抗原(来自6个供体的全血和外周血单核细胞)测定中以本发明的抗CTLA4抗体(4.1.1和11.2.1)诱导的IL-2生产的增强。
图20显示了在72小时T母细胞/Raji测定中以本发明的抗-CTLA4抗体(4.1.1和11.2.1)诱导的IL-2生产的剂量依赖性增强。
图21显示了在用100ng/ml超抗原刺激的72小时超抗原全血测定中以本发明的抗-CTLA4抗体(4.1.1和11.2.1)诱导的IL-2生产的剂量依赖性增强。
图22提供了在抗-CTLA-4抗体链后一系列增加的核苷酸和氨基酸序列全长4.1.1重链(cDNA22(a)，基因组22(b)，和氨基酸22(c))，全长无糖基化的4.1.1重链(cDNA 22(d)和氨基酸22(e))，4.1.1轻链(cDNA 22(f)和氨基酸22(g))，全长4.8.1重链(cDNA 22(h)和氨基酸22(i))，4.8.1轻链(cDNA 22(j)和氨基酸22(K))，全长6.1.1重链(cDNA 22(1)和氨基酸22(m))，6.1.1轻链(cDNA 22(n)和氨基酸22(o))，全长11.2.1重链(cDNA 22(p)和氨基酸22(q))，以及11.2.1轻链(cDNA 22(r)和氨基酸22(s))。
本发明概述根据本发明的第一个方面，提供了能结合CTLA-4的抗体，它包含的重链可变区的氨基酸序列包含由人VH3-33家族基因编码的从FR1序列内到FR3序列的连续氨基酸序列且在CDR1序列，CDR2序列或图2所示的构架序列中包含至少一个氨基酸取代。在优选的实施方案中，该氨基酸序列包括选自SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO8，SEQ IDNO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO63，SEQ ID NO64，SEQ ID NO66，SEQ ID NO68，和SEQ ID NO70的序列。在另一优选的实施方案中，该抗体还包含轻链可变区氨基酸序列，该序列包含选自SEQ ID NO14，SEQ IDNO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO19，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，SEQ ID NO23，SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO26，SEQ ID NO65，SEQ ID NO67，SEQ ID NO69和SEQ ID NO71。
根据本发明的第二个方面，提供了一种抗体，它包含含有SEQ IDNO1的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO14的轻链可变氨基酸序列。
根据本发明的第三个方面，提供了一种抗体，它包含含有SEQ IDNO2的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO15的轻链可变氨基酸序列。
根据本发明的第四个方面，提供了一种抗体，它包含含有SEQ IDNO4的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO17的轻链可变氨基酸序列。
根据本发明的第五个方面，提供了一种分离的人单克隆抗体，它能结合CTLA-4。在优选的实施方案中，该抗体能与选自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1的抗体竞争结合CTLA-4。在另一优选的实施方案中，该抗体与选自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1的抗体对CTLA-4具有基本上相似的结合特异性。在另一优选的实施方案中，该抗体选自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1。在另一优选的实施方案中，该抗体与来自低等哺乳动物种类，优选包括小鼠，大鼠和兔的低等哺乳动物种类且更优选小鼠和大鼠的CTLA-4无交叉反应性。在另一优选的实施方案中，该抗体与来自灵长类，优选包含Cynomolgous和猕猴的灵长类的CTLA-4交叉反应。在另一优选的实施方案中，该抗体对CTLA-4具有比CD28，B7-2，CD44和hIgG1高大约100∶1且优选大约500∶1或更高的选择性。在另一优选的实施方案中，该抗体的结合亲和性是大约10-9M或优选大约10-10M或更大。在另一优选的实施方案中，该抗体以低于大约100nM且优选低于大约0.38nM的IC50抑制CTLA-4与B7-2之间的结合。在另一优选的实施方案中，该抗体以低于大约100nM或更大且优选低于大约0.50nM的IC50值抑制CTLA-4与B7-1之间的结合。在另一优选的实施方案中，在T细胞母细胞/Raji测定中该抗体使IL-2生产增加到大约500pg/ml或更高且优选增加到大约3846pg/ml或更高。在另一优选的实施方案中，在T细胞母细胞/Raji测定中该抗体使IFN-γ生产增加到大约500pg/ml或更高且优选大约1233pg/ml或更高。在另一优选的实施方案中，在hPBMC或全血超抗原测定中该抗体使IL-2生产增加到大约500pg/ml或更高。在另一优选的实施方案中，该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中使IL-2生产增加到大约500pg/ml或优选1500pg/ml或更高或相对于对照高大约30％或优选高50％。
根据本发明的第六个方面，提供了一种人源化抗体，它与选自3.1.1,4.1.1,4.8.1,4.10.2,4.13.1,4.14.3,6.1.1,11.2.1,11.6.1,11.7.1,12.3.1.1和12.9.1.1的抗体具有基本上相似的对CTLA-4的结合特异性。在优选的实施方案中，该抗体与来自低等哺乳动物种类，优选包括小鼠，大鼠和兔的低等哺动物种类且更优选小鼠和大鼠的CTLA-4无交叉反应性。在另一优选的实施方案中，该抗体与来自灵长类，优选包括cynomolgous和猕猴的灵长类的CTLA-4交叉反应。在另一优选的实施方案中，该抗体对CTLA-4的选择性比CD28，B7-2，CD44和hIgG1高大约100∶1且优选大约500∶1或更高。在另一优选的实施方案中，该抗体的结合亲和性是大约10-9M或更大且优选大约10-10M或更大。在另一优选的实施方案中，该抗体以低于大约100nM且优选低于大约0.38nM的IC50值抑制CTLA-4和B7-2之间的结合。在另一优选的实施方案中，该抗体以低于大约100nM或更大且优选低于大约0.50nM的IC50值抑制CTLA-4与B7-1之间的结合。在另一优选的实施方案中，该抗体在T细胞母细胞/Raji测定中使IL-2生产增加到大约500pg/ml或更大且优选增加到大约3846pg/ml或更大。在另一优选的实施方案中，该抗体在T细胞母细胞/Raji测定中使IFN-γ生产增加到大约500pg/ml或更高且优选增加到大约1233pg/ml或更高。在另一优选的实施方案中，该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中诱导的IL-2生产为大约500pg/ml或更高。在另一优选的实施方案中，该抗体在hPBMC或全血超抗原测定中使IL-2生产增加到大约500pg/ml或优选1500pg/ml或更高或相对于对照高大约30％或优选50％。
根据本发明的第7个方面，提供了结合CTLA-4的抗体，它包含在构架上与CDR1，CDR2和CDR3序列有效连接的含有由人VH3-33基因家族编码的人FR1，FR2和FR3序列的重链氨基酸序列，其中CDR1，CDR2和CDR3序列独立地选自图2所示的CDR1，CDR2和CDR3。在优选的实施方案中，权利要求32的抗体进一步包含对图2所示的FR1，FR2和FR3序列的任意体细胞突变。
根据本发明的第8个方面，提供了结合CTLA-4的抗体，它包含在构架上与CDR1，CDR2和CDR3序列有效连接的含有由人VH3-33基因家族编码的人FR1，FR2和FR3序列的重链氨基酸序列，该抗体具有下列特征对CTLA-4具有大约10-9或更高的结合亲和性，以大约100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4与B7-1之间的结合；以大约100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4与B7-2之间的结合；在人T细胞测定中使细胞因子生产增加到500pg/ml或更高。
根据本发明的第9个方面，提供了结合CTLA-4的抗体，它包含在构架上与CDR1，CDR2和CDR3序列有效连接的含有FR1，FR2和FR3序列的重链氨基酸序列，其中CDR1，CDR2和CDR3独立地选自图2和3所示的CDR1，CDR2和CDR3序列，该抗体具有下列特征对CTLA-4具有大约10-9或更高的结合亲和性；以大约100nM或更低的IC50抑制CTLA-4和B7-1之间的结合；以大约100nM或更低的IC50值抑制CTLA-4和B7-2之间的结合；在人T细胞测定中使细胞因子生产增加到500pg/ml或更高。
根据本发明的第10个方面，提供了一种测定T细胞刺激的细胞培养系统，包括将人T细胞母细胞的培养物与Raji细胞系共同培养。在优选的实施方案中，在与Raji细胞系培养前洗涤T细胞母细胞。
根据本发明的第11个方面，提供了一种测量T细胞刺激的测定法，包括提供人T细胞母细胞和Raji细胞系的培养物；将该培养物与一种试剂接触；和测量由该培养物产生的细胞因子。
根据本发明的第12个方面，提供了筛选T细胞刺激功能部分的功能测定法，包括提供人T细胞母细胞和Raji细胞系的培养物；将该培养物与该部分接触并评估由该培养物产生的细胞因子。
根据本发明的第13个方面，提供了一种用于CTLA-4抑制功能的T细胞刺激测定法，包括将含有人T细胞母细胞和Raji细胞系的培养物与一种试剂接触并评估该培养物的细胞因子生产。
根据本发明的第14个方面，提供了一种筛选试剂T细胞刺激活性的方法，包括将该试剂与含有人T细胞母细胞和Raji细胞系的细胞培养物接触；并评估该培养物的细胞因子生产。
在本发明的第10到第14方面的每一个方面中，在优选的实施方案中，在用Raji细胞系培养前洗涤T细胞母细胞。在另一优选的实施方案中，该细胞因子是IL-2或IFN-γ。在优选的实施方案中，在从培养物分离的上清中测量细胞因子生产。在优选的实施方案中，该试剂是一种抗体且优选与CTLA-4结合。
根据本发明的第15个方面，提供了一种测定T细胞刺激的测定法，包括提供用葡萄球菌肠毒素A刺激的人外周血单核细胞的群体或人全血；将该培养物与一种试剂接触并测量由该细胞群体产生的细胞因子。
根据本发明的第16个方面，提供了一种筛选T细胞刺激功能部分的功能测定法，包括提供人外周血单核细胞的群体或用葡萄球菌肠毒素A刺激的人全血；将该培养物与该部分接触，并评价该细胞群体的细胞因子生产。
根据本发明的第17个方面，提供了CTLA-4抑制功能的T细胞刺激测定法，包括将人外周血单核细胞群体或用葡萄球菌肠毒素A刺激的人全血与一种试剂接触并评估该细胞群体的细胞因子生产。
根据本发明的第18个方面，提供了一种筛选一种试剂的T细胞刺激活性的方法，包括将该试剂与人外周血单核细胞的群体或用葡萄球菌肠毒素A刺激的人全血接触；并评估该细胞群体的细胞因子生产。
在本发明的第15到第18方面中的每一个方面，在优选的实施方案中，细胞因子是IL-2。在另一优选的实施方案中，在从该培养物分离的上清中测量细胞因子生产。在一个优选的实施方案中，该试剂是抗体且优选与CTLA-4结合。
优选实施方案的详细描述根据本发明，提供了抗人CTLA-4的全人源单克隆抗体。提供了包含重链和轻链免疫球蛋白分子的编码核苷酸序列和氨基酸序列，特别是相应于从FR1和CDR1到CDR3和FR4的连续重链和轻链序列。还提供了具有相似结合特性的抗体和与本文公开的抗体具有相似功能的抗体(或其它拮抗剂)。还提供了表达该免疫球蛋白分子和单克隆抗体的杂交瘤。
定义除非本文另有限定，本发明中所用的科技术语具有本领域的普通技术人员通常理解的意义。而且，除非说明书另有需要，单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。一般来说，用于本文的命名法和本文所述的技术，细胞和组织培养，分子生物学，和蛋白质及寡聚或多聚核苷酸化学和杂交是众所周知的且是本领域中常用的。重组DNA，寡核苷酸合成和组织培养及转化(例如，电穿孔，脂转染)均使用标准技术。酶反应和纯化技术按厂家说明书进行或按本领域常规完成或按本文所述进行。上述技术和方法一般按本领域熟知的常规方法进行且按本说明书中引用和讨论的各种普通和更专业的参考文献中所述进行。例如，参见，Sambrook等，分子克隆实验室手册(第2版，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(1989))，本文引用以供参考。用于本文的命名法，本文的实验方法和技术，及本文所述的分析化学，合成有机化学，和药物及制药化学是熟知的且是本领域中常用的。化学合成，化学分析，药物制备，配制和传递及病人的治疗均使用标准技术。
用于本说明书时，下面的术语，除非另有说明，应理解为具有如下含义本文使用的术语“分离的多核苷酸”是指基因组，cDNA或合成来源的多核苷酸或其某种组合，相对于其来源，该“分离的多核苷酸”(1)与天然情况下发现该“分离的多核苷酸”的全部或部分多核苷酸不相联，(2)与天然情况下不与其相连的多核苷酸有效连接，或(3)天然情况下不以更大序列的一部分出现。
本文提及的术语“分离的蛋白质”指cDNA，重组RNA或合成来源的蛋白质或其某种组合，相对于其来源，或衍生来源，该“分离的蛋白质”(1)与天然发现的蛋白质不相联，(2)游离于相同来源的其它蛋白质，例如，游离于鼠蛋白，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在天然状况下不出现。
本文使用的术语“多肽”作为泛指术语是指天然蛋白质，片段，或多肽序列的类似物。因此，天然蛋白质，片段和类似物是多肽类中的种。根据本发明优选的多肽包含图1所示的人重链免疫球蛋白分子和人κ轻链免疫球蛋白分子，以及由含有重链免疫球蛋白分子与诸如κ轻链免疫球蛋白分子的轻链免疫球蛋白分子组合，和相反组合形成的抗体分子，以及其片段和类似物。
本文使用的术语“天然存在的”用于某物质时是指该物质可在自然界找到的事实。例如，存在于生物(包括病毒)中的，可从天然来源分离出的且未经实验人员或其它人员有目的修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
本文使用的术语“有效连接”是指所述成份的位置关系使其以目的方式发挥功能。与编码序列“有效连接的”调控序列是指其连接方式使得在与调控序列相适应的条件下实现编码序列的表达。
本文所用的术语“调控序列”指对实现与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。该调控序列的特性依赖于宿主生物而有所区别；在原核生物中，该调控序列一般包括启动子，核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，一般来说，该调控序列包括启动子和转录终止序列。术语“调控序列”最少打算包括其存在对表达和加工是必需的所有成份，且也可包括其存在是有益的其它成份，例如，先导序列和融合配偶体序列。
本文提及的术语“多核苷酸”指至少10个碱基长的核苷酸的多聚体形式，所述核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括DNA的单链和双链形式。
本文提及的术语“寡核苷酸”包括以天然存在和非天然存在的寡核苷酸键连接起来的天然存在的和修饰的核苷酸。寡核苷酸是多核苷酸的亚群，一般包括200个碱基长或更短。优选的寡核苷酸是10至60个碱基长，更优选12,13,14,15,16,17,18,19或20至40个碱基长。寡核苷酸通常是单链的，例如，用于探针；但寡核苷酸也可以是双链的，例如，用于构建基因突变体。本发明的寡核苷酸可以是有义或反义的寡核苷酸。
本文提及的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰的或取代糖基的核苷酸及类似物。本文提及的术语“寡核苷酸键”包括诸如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，硒代磷酸酯，二硒代磷酸酯，phosphoroanilothioate，phoshoraniladate，酰胺磷酸等的寡核苷酸键。例如，参见，LaPlanche等，核酸研究，149081(1986)；Stec等，美国化学协会杂志，1066077(1984)；Stein等，核酸研究，163209(1988)；Zon等，抗癌药设计，6539(1991)；Zon等，寡核苷酸和类似物实践探讨，第87—108页(F.Eckstein编辑，牛津大学出版社，英国牛津(1991)；Stec等，美国专利号5,151,510；Uhlmann和Peyman化学回顾90543(1990)，本文引用其公开内容以供参考。如果需要，寡核苷酸可包括检测标记。
本文提及的术语“选择性杂交”指可检测地且特异性地结合。根据本发明的多核苷酸，寡核苷酸及其片段在使与非特异性核酸可检测的结合的可见量最小化的杂交和洗涤条件下与核酸链选择性地杂交。高度严格条件可用于实现本领域已知的和本文所讨论的选择性杂交条件。一般来说，本发明的多核苷酸，寡核苷酸及其片段与目的核酸序列之间的核酸序列同源性至少为80％，更典型地优选至少85％，90％，95％，99％和100％的逐渐增加的同源性。两个氨基酸序列如果其序列之间具有部分或完全的相同性，则它们是同源的。例如，85％的同源性是指当两序列进行对比达到最大匹配时85％的氨基酸是相同的。缺口(在匹配的任意两个序列之间)允许达到最大匹配；缺口长度优选5个或更少，更优选2个或更少。择一且优选的是，当本文使用该术语时，如果使用具有突变数据矩阵和6或更大的缺口罚分的程序ALIGN它们具有至少5分的对比值(标准偏差单位)时，2个蛋白质序列(或其衍生的至少30个氨基酸长的多肽序列)是同源的。参见，Dayhoff，M.O.，蛋白质序列和结构图表，第101—110页(第5卷，国家生物医学研究基金(1972))及该卷的增刊，第1—10页。两个序列或其部分如果使用ALIGN程序最佳对比时其氨基酸大于或等于50％的相同性时是更优选的具有同源性。本文使用的术语“相应于”是指一个多核苷酸序列与对照多核苷酸序列的全部或部分是同源的(即，是相同的，在进化上不严格相关)，或指一个多肽序与一个对照多肽序列是相同的。相反，本文所用的术语“互补于”是指互补序列与对照多核苷酸序列的全部或部分是同源的。例如，核苷酸序列“TATAC”相应于对照序列“TATAC”且互补于对照序列“GTATA”。
下面的术语用于描述2个或多个核苷酸或氨基酸序列之间的序列关系“对照序列”，“比较窗口”，“序列相同性”，“序列相同性百分数”和“基本相同”。“对照序列”是用作序列比较基础的确定序列；对照序列可以是更大序列的亚群，例如，在序列表中给出的全长cDNA或基因序列的片段或可包含完整cDNA或基因序列。一般来说，对照序列是至少18个核苷酸或6个氨基酸长，通常是至少24个核苷酸或8个氨基酸长，且通常是至少48个核苷酸或16个氨基酸长。由于2个多核苷酸或氨基酸序列分别可能(1)含有两分子之间相似的序列(即，全部多核苷酸或氨基酸序列的一部分)，和(2)还含有2个多核苷酸或氨基酸序列之间有差异的序列，因此，2个(或多个)分子之间的序列比较一般经过在一个“比较窗口”内比较两个分子的序列以鉴定和比较局部区域的序列相似性来进行。本文所用的“比较窗口”指至少18个连续的核苷酸位置或6个氨基酸的概念性片段，其中一个多核苷酸序列或氨基酸序列可与至少18个连续的多核苷酸或6个氨基酸序列的对照序列进行比较且其中在比较窗口中的多核苷酸序列的位置与对照序列(不包含添加或缺失)相比可含有20％或更少的添加，缺失，取代等(即，缺口)以实现两序列的最佳对比。用于对比比较窗口的序列最佳对比可用Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，分子生物学杂志，48443(1970)的同源性对比算法，Pearson和Lipman，美国国家科学院院报，852444(1988)的相似性检索方法，这些算法的计算机补充(Wisconsin遗传软件包释放7.0中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA(遗传计算机集团公司，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，Geneworks或MacVector软件包)，或经过检查并选择由各种方法产生的最佳序列比较法来进行。
术语“序列相同性”指在比较窗中两个多核苷酸或氨基酸序列是相同的(即，根据核苷酸与核苷酸或残基与残基)。术语“序列相同性百分数”是经过比较在比较窗口中的2个最佳对比序列，测定在两序列中均存在的相同核酸碱基(即，A，T，C，G，U或I)或残基的位置数以获得匹配位置的数目，用匹配的位置数除以比较窗口中的位置总数(即，窗口大小)并将结果乘以100得到序列相同性的百分数来计算的。本文所用的术语“基本上相同”指多核苷酸或氨基酸序列的特征，其中，多核苷酸或氨基酸包括与对照序列相比在至少18个核苷酸(6个氨基酸)位置的比较窗口中，通常是在至少24—48个核苷酸(8—16个氨基酸)位置的窗口中有至少85％序列相同性，优选至少90—95％序列相同性，更通常是至少99％序列相同性的序列，其中序列相同性百分数经过比较在比较窗口中的对照序列与该序列来计算，该序列在占对照序列总共20％或较少的序列中可包括缺失或添加。对照序列可以是更大序列的亚序列群。
本文所用的20个常规氨基酸及其缩写按常规用法。参见，免疫学—合成(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren，编辑，SinauerAssociates，Sunderland，Mass.(1991))，本文引用以供参考。20个常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)，非天然氨基酸，如α-，α-双取代的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸，和其它非常规氨基酸也可以是本发明多肽的合成组份。非常规氨基酸的例子包括4-羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰赖氨酸，O-磷酰丝氨酸，N-乙酰丝氨酸，N-甲酰甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，σ-N-甲基精氨酸和其它相似氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟脯氨酸)。在本文使用的多肽标记中，按照标准用法和常规左手方向是氨基末端方向，右手方向是羧基末端方向。
同样，除非另有所说，单链多核苷酸序列的左手端是5′端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5′方向。新生RNA转录子5′向3′的添加方向称为转录方向；与RNA具有相同序列的DNA链上的序列区且其5′端位于RNA转录子的5′端称为“上游序列”；与RNA具有相同序列的DNA链上的序列区且其3′端位于RNA转录子的3′端称为“下游序列”。
应用于多肽时，术语“基本相同”指使用诸如程序GAP或带错误缺口权重的BESTFIT进行最佳序列对比时两个肽序列具有至少80％的序列相同性，优选至少90％序列相同性，更优选至少95％序列相同性，且最优选至少99％的序列相同性。优选的是，不相同的残基位置区别在于有保守氨基酸取代。保守氨基酸取代指具有相似侧链的残基互换。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的氨基酸组是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸基团是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸基团是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，和天冬酰胺-谷氨酰胺。
如本文所述，本发明预期包含在抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列中进行轻微的变化，只要该变化能使氨基酸序列保留至少75％，更优选至少80％,90％,95％且更优选99％。特别是包括保守氨基酸取代。保守取代是在其侧链相关的氨基酸家族中进行的取代。遗传编码的氨基酸一般分成下列家族(1)酸性二谷氨酸，天冬氨酸；(2)碱性二赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极性二丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸；和(4)不带电极性二甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。更优选的家族是丝氨酸和苏氨酸是脂肪族羟基家族；天冬酰胺和谷安是含酰胺家族；丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸是脂肪族；苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸是芳香族。例如，预期用异亮氨酸或缬氨酸单独取代亮氨酸，用谷氨酸取代灭冬氨酸，用丝氨酸取代苏氨酸是合理的，用结构相关的氨基酸对氨基酸的相似取代对所得分子的结合或特性不会有显著的影响，特别是如果该取代不涉及构架位点内的氨基酸时更是如此。经过测定多肽衍生物的特定活性可较容易地测定氨基酸改变是否会产生功能性肽。本文详细描述了该测定法。本领域的普通技术人员可较容易地制备抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物。优选的片段或类似物的氨基和羧基端靠近功能域的边界。经过比较核苷酸和/或氨基酸序列数据与公众的或专卖的序列数据库可鉴定结构和功能域。优选的是，使用计算机比较方法鉴定在已知结构和/或功能的其它蛋白质中出现的序列基序或预期的蛋白质构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等，科学，253164(1991)。因此，上述例子证实本领域的技术人员可认识序列基序和结构构象以用于限定根据本发明的结构和功能域。
优选的氨基酸取代是那些(1)降低对蛋白水解敏感性；(2)降低氧化敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和性，(4)改变结合亲和性和(4)赋予或修饰该类似物的理化或功能特性的取代。类似物可包括非天然存在的肽序列的各种序列突变体。例如，可在天然存在的序列上(优选在形成分子内接触的结构域外的肽部分)进行单个或多个氨基酸取代(优选保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代应基本上不改变亲本序列的结构特征(例如，取代氨基酸应不会断裂在亲本序列中存在的螺旋、或破坏作为亲本序列特征的其它类型的二级结构)。本领域认识到的肽二级和三级结构的例子在下列文献中描述蛋白质，结构和分子原理(Creighton编辑，W.H.Freeman和Company，纽约(1984))；蛋白质结构引言(C.Branden和J.Tooze编辑，Garland Publishing，纽约(1991))；和Thornton等，自然354105(1991)，分别作为参考文献在本文中引用。
本文使用的术语“多肽片段”指具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽，但其中剩下的氨基酸序列与从，例如，全长cDNA序列推出的天然存在的序列中的相应位置相同。片段一般是至少5,6,8，或10个氨基酸长，优选至少14个氨基酸长，更优选至少20个氨基酸长，通长至少50个氨基酸长，且甚至更优选至少70个氨基酸长。本文所用的术语“类似物”指由至少25个氨基酸的片段组成的多肽，该氨基酸与推断的氨基酸序列的一部分基本上相同且其具有至少一种下列特性(1)在合适的结合条件下与CTLA-4特异性结合，(2)阻断CTLA-4与其它受体结合的能力，或(3)在体外或体内抑制表达CTLA-4的细胞生长的能力。一般来说，多肽类似物相对于天然存在的序列包括保守的氨基酸取代(或添加或缺失)。该类似物一般是至少20个氨基酸长，优选至少50个氨基酸长或更长且通常与全长的天然存在的多肽一样长。
肽类似物通常用于制药工业，作为与模板肽具有类似特征的非肽药物。这些类型的非肽化合物称为“肽模拟物”或“模拟肽”。Fauchere，药物研究进展杂志，1529(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；和Evans等，药物化学杂志，301229(1987)，本文作为参考文献引用。该化合物通常借助于计算机化的分子模型来形成。结构上类似于治疗上有用的肽的肽模拟物可用于产生相当的治疗或预防效果。一般来说，肽模拟物在结构上相似于模板肽(即，具有生化特征或药物学活性的肽)，如人抗体，但有一个或多个肽键以本领域熟知的方法任选被由下列基团组成的键取代-CH2NH-，-CH2S-，-CH2-CH2-，-CH＝CH-(顺式和反式)，-COCH2-，-CH(OH)CH2-，和CH2SO-。共有序列的一个或多个氨基酸被相同类型的D-氨基酸系统取代(例如，D-赖氨酸代替C-赖氨酸)可用于产生更多稳定的肽。另外，含有共有序列或基本上相同的共有序列变异的约束肽可用本领域已知的方法产生(Rizo和Gierasch，生化年鉴，61387(1992)，本文引用以供参考)；例如，经过增加能形成分子内二硫键以环化多肽的内部半胱氨酸残基。
“抗体”或“抗体肽”指完整抗体或与完整抗体竞争特异性结合的其结合片段。结合片段以重组DNA技术，或经过酶或化学裂解完整抗体产生。结合片段包括Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，和单链抗体。非“双特异性”或“双功能”抗体的抗体理解为其各个结合位点相同。当过量抗体使结合反受体的受体量减少至少大约20％,40％,60％或80％且更通常是大于大约85％(在体外竞争结合试验中测量)时，抗体显著抑制受体与反受体的附着。
术语“表位”包括能特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何蛋白决定族。表位决定族通常由分子的具有化学活性的表面集合，如氨基酸或糖侧链组成并通常具有特定的三维结构特征，以及特定的带电特性。当解离常数为≤1μM，优选≤100nM且最优选≤10nM时，认为抗体特异性地结合抗原。
本文使用的术语“试剂”指化合物，化合物的混合物，生物学大分子，或从生物学材料制备的提取物。
本文使用的术语“标记”或“标记的”指掺入可检测的标记，例如，经过掺入放射性标记的氨基酸或将可用标记的抗生物素蛋白检测的生物素部分附着在多肽上(例如，可用光学或比色法检测的含荧光标记或酶活性的链霉抗生物素蛋白)。在某些情况下，标记或标记物也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的且均可使用。多肽标记物的例子包括但不限于放射性同位素或放射性核素(例如，3H，14C，15N，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I)，荧光标记(例如，FITC，罗丹明，镧磷光体)，酶标记(例如，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，荧光素酶，碱性磷酸酶)，化学发光物，生物素基团，被第二报道基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，第二抗体的结合位点，金属结合结构域，表位标记)。在有些实施方案中，标记以各种长度的间隔臂附着以减小潜在的空间障碍。
本文使用的术语“药用试剂或药品”指当适当施用给患者时能诱导所需治疗效果的化合物或组合物。本文的其它化学术语按本领域的常规用法使用，例如见，McGraw-Hill化学术语词典(Parker，S.Ed.，McGraw-Hill，San Francisco(1985)，本文作为参考文献引用)。
本文使用的术语“抗肿瘤剂”指具有抑制人体肿瘤，特别是恶性(癌)病变，如癌，肉瘤，淋巴瘤，或白血病的发育或进展的功能特性。抑制癌转移通常是抗肿瘤剂的一个特性。
本文使用的“基本上纯”是指物质种类以占优势的种类存在(即，按摩尔计算，它比组合物中的任何其它种类更丰富)，且优选基本上纯化的馏份是一种组合物，其中该物质种类占所存在的所有大分子种类的至少大约50％(按摩尔算)。一般来说，基本上纯的组份含有在组合物中存在的所有大分子种类的至少大约80％，更优选超过大约85％,90％,95％和99％。更优选的是，该物质种类纯化成基本上匀质(在组合物中以常规检测方法检测不到污染物种类)，其中该组合物基本上由单一大分子种类组成。
术语患者包括人和兽医受试者。抗体结构基本抗体结构单位已知包含四聚体。各四聚体由2个相同的多肽链对组成，每对具有一个“轻链”(大约25kDa)和一个“重链”(大约50—70kDa)。各链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的大约100到110或更多氨基酸的可变区。各链的羧基末端部分限定了一个主要负责效应器功能的恒定区。人轻链分类的κ和λ轻链。重链分类为μ，δ，γ，α或ε，且分别将抗体同种型限定为IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区以大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，该重链也包括大约10多个氨基酸的“D”区。一般参见，基础免疫学，第7章(Paul，W.编辑，第二版，Raven出版社，纽约(1989))(将其全文作为参考文献引用用于所有目的)。各轻/重链对的可变区形成抗体结合位点。
因此，完整的IgG抗体具有2个结合位点。除了双功能或双特异性抗体外，2个结合位点是相同的。
所有这些链显示出相同的相当保守的构架区(FR)的一般结构，该构架区由3个外部可变区，也称为互补性决定区域CDR连接。每对中两条链的CDR经构架区排列，能与特异性表位结合。从N端到C端，轻链和重链均包含结构域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。各结构域中氨基酸的排列按Kabet，免疫学目的的蛋白质的序列，(国家卫生组织，Bethesda，Md.(1987和1991))或Chothia & Lesk，分子生物学杂志，196901—917(1987)；Chothia等，自然，342878—883(1989)的限定。
双特异性或双功能抗体是一种人工杂交抗体，它具有两种不同的重/轻链对和2个不同的结合位点。双特异性抗体可经过各种方法生产，包括杂交瘤的融合或Fab′片段的连接。例如，参见Songsivilai和Lachmann，临床实验免疫学，79315—321(1990)，Kostelny等，免疫学杂志，1481547—1553(1992)。此外，双特异性抗体可形成“diabodies”(Holliger等，“‘Diabodies’小的双价和双特异性抗体片段”，PNAS USA，906444—6448(1993))或“Janusins”(Traunecker等，“在HIV感染的细胞上双特异性单链分子(Janusins)靶向细胞毒性淋巴细胞”，EMBO J103655—3659(1991)和Traunecker等，“Janusin双特异性试剂的新分子设计”，国际癌症杂志增刊751—52(1992))。双特异性抗体的生产与常规抗体的生产相比是劳动强度更高的过程，且双特异性抗体的产量和纯度一般更低。双特异性抗体不以具有单个结合位点的片段的形式(例如，Fab，Fab′和Fv)存在。
人抗体和抗体的人源化人抗体避免了与具有鼠或大鼠可变和/或恒定区的抗体相关的某些问题。存在该鼠或大鼠来源的蛋白质可能导致该抗体的迅速清除或可导致患者产生抗该抗体的免疫反应。为了避免使用鼠或大鼠产生的抗体，有人假定可通过将人抗体功能引入啮齿类使得啮齿类可产生具有全人序列的抗体，以此形成人源化抗体或产生全人抗体。
人抗体在YAC中克隆和重建兆碱基大小的人基因座并将它们导入小鼠种系的能力提供了解释极大型或粗略定位的基因座的功能成份以及产生有用的人类疾病模型的有力方法。而且，将该技术用于以其人类等价物取代小鼠基因座可提供对发育期间人基因产物表达和调节，其与其它系统的联系和其涉及的疾病诱导和进展的独特认识。
该策略的重要实际应用是小鼠体液免疫系统的“人源化”。将人免疫球蛋白(Ig)基因座导入内源性Ig基因已被灭活的小鼠提供了研究抗体的程序化表达和装配的机制以及其在B-细胞发育中的作用的机会。而且，该策略可提供生产全人单克隆抗体(Mab)的理想来源，它是实现人类疾病的抗体疗法的重要里程碑。预期全人抗体可使体内对小鼠或小鼠产生的Mab的免疫原性和过敏反应减到最小并因此增加了施用抗体的效力和安全性。预期使用全人抗体在需要重复抗体用药的慢性和复发性人类疾病，如炎症，自身免疫和癌症的治疗中提供显著的优势。
针对这一目的的一种方案是用人Ig基因座的大片段改造小鼠抗体生产缺陷型的小鼠品系预期该小鼠在缺乏小鼠抗体的情况下会产生大型人抗体库。大量人Ig片段可保存大量的可变基因多样性以及抗体生产和表达的适当调节。经过研究小鼠抗体多样化和选择及对人蛋白质缺乏免疫学耐受性的机制，在这些小鼠品系中再生的人抗体库应产生针对包括人抗原的任何目的抗原的高亲和性抗体。使用杂交瘤技术，容易产生和筛选具有所需特异性的抗原特异性人Mab。
我们于1994年公开的所生产的首例XenoMouseTM品系证实了这种一般策略。见Green等，自然遗传学，713—21(1994)。用含核心可变和恒定区序列的分别含人重链基因座和κ轻链基因座的245kb和190kb大小的种系表形片段的酵母人工染色体(YAC)改造XenoMouseTM品系，如上所述。含人Ig的YAC被证实与小鼠抗体重排和表达的系统相容且能取代灭活的小鼠Ig基因。其诱导B-细胞形成的能力，产生类似成人的全人抗体库的能力和产生抗原特异性人Mab的能力证实了这一点。这些结果也表明导入更大部分的含更大数目的V基因，其它调控元件和人Ig恒定区的人Ig基因座可基本上重演针对感染和免疫的特征性人体液反应的全部组成成份。最近，Green等的工作通过导入兆碱基大小的分别含人重链基因座和κ轻链基因座的种系表形YAC片段导入超过大约80％的人抗体库以产生XenoMouseTM小鼠。参见，Mendez等，自然遗传学，15146—156(1997)，Green和Jakobovits，实验医学杂志，188483—495(1998)，和1996年12月3日申请的美国专利申请系列号08/759,620，本文分别作为参考文献引用。
在下列文献中进一步讨论和描绘了该方案1990年1月12日申请的美国专利申请系列号07/466,008，1990年11月8日申请的07/610,515，1992年7月24日申请的07/919,297，1992年7月30日申请的07/922,649，1993年3月15日申请的08/031,801，1993年8月27日申请的08/112,848，1994年4月28日申请的08/234,145，1995年1月20日申请的08/376,279，1995年4月27日申请的08/430,938，1995年6月5日申请的08/464,584，1995年6月5日申请的08/464,582，1995年6月5日申请的08/463,191，1995年6月5日申请的08/462,837，1995年6月5日申请的08/486,853，1995年6月5日申请的08/486,857，1995年6月5日申请的08/486,859，1995年6月5日申请的08/462,513，1996年10月2日申请的08/724,752，1996年12月3日申请的08/759,620。也参见Mendez等，自然遗传学，15146—156(1997)和Green及Jakobovits，实验医学杂志，188483—495(1998)。也参见1996年6月12日授权公开的欧洲专利号EP0463151B1，1994年2月3日公开的国际专利申请号WO94/02602，1996年10月31日公开的国际专利申请号WO96/34096，和1998年6月11日公开的WO98/24893。上面引用的各专利，申请和参考文献的公开内容以其全文在本文中作为参考文献引用。
在一个可供选择的方案中，包括GenPharm国际有限公司的其他人使用了“小基因座”方案。在小基因座方案中，通过包括来自Ig基因座的片段(单个基因)模仿外源性Ig基因座。因此，一个或多个VH基因，一个或多个DH基因，一个或多个JH基因，μ恒定区，第二恒定区(优选γ恒定区)形成插入动物中的构建体。该方案在下列文献中有描述Surani等的美国专利号5,545,807，均属于Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5625825,5625126,5633425,5661016,5770429,5789650和5814318，Krimpenfort和Berns的美国专利号5591669，Berns等的美国专利号5612205,5721367,5789215，Choi和Dunn的美国专利号5643763，GenPharm国际公司的1990年8月29日申请的美国专利申请系列号07/574,748，1990年8月31日申请的07/575,962，1991年12月17日申请的07/810,279，1992年3月18日申请的07/853,408，1992年6月23日申请的07/904,068，1992年12月16日申请的07/990860，1993年4月26日申请的08/053,131,1993年7月22日申请的08/096762，1993年11月18日申请的08/155,301，1993年12月3日申请的08/161,739，1993年12月10日申请的08/165,699，1994年3月9日申请的08/209741，本文引用其公开内容作为参考。也参见欧洲专利号0546073B1，国际专利申请号WO92/03918，WO92/22645，WO92/22647，WO92/22670，WO93/12227，WO94/00569，WO94/25585，WO96/14436，WO97/13852和WO98/24884，其说明书作为整体在此引用以供参考。还参见Taylor等，1992，Chen等，1993，Tuaillon等，1993，Choi等，1993，Lonberg等(1994)，Taylor等，(1994)，和Tuaillon等，(1995)，Fishwild等，(1996)，其公开内容作为整体在此引用以供参考。
上面引用的Surani等且转让给医学研究顾问(“MRC”)的发明人通过使用小基因座研究产生了具有Ig基因座的转基因小鼠。上面引用的GenPharm国际公司的工作的发明人，Lonberg和Kay在本发明人的领导下建议灭活内源性小鼠Ig基因座并结合大量复制Surani等的工作。
小基因座方案的优势是其快速，可产生包括Ig基因座部分的构建体并导入动物。然而，相对应的是，小基因座方案的明显缺点在于，理论上，通过包括少数V，D，和J基因导入的多样性不够。事实上，已公开的工作似乎支持了这一观点。通过使用小基因座方案产生的动物B-细胞形成和抗体生产似乎受到阻碍。因此，围绕本发明的研究一般是针对导入大部分的Ig基因座以实现更大的多样性且努力重建动物的免疫库。
人抗小鼠抗体(HAMA)反应产生了制备嵌合或其它人源化抗体的工业。由于嵌合抗体具有人恒定区和小鼠可变区，因此预期可观察到某些人抗嵌合抗体(HACA)反应，特别是在慢性病或多剂量使用抗体的情况下。因此，需要提供抗CTLA-4的全人抗体以消除这些顾虑和/或HAMA或HACA反应的影响。
人源化和展示技术正如上面关于人抗体产生所讨论的，产生具有免疫原性降低的抗体具有优势。在一定程度上，使用合适的文库及人源化技术和展示技术可实现这点。预期使用本领域熟知的技术可人源化或灵长类化鼠抗体或来自其它物种的抗体。例如，参见Winter和Harris，当今免疫学，1443—46(1993)和Wright等，Crit.Reviews in Immunol.12125—168(1992)。经过重组DNA技术用相应的人序列取代CH1，CH2，CH3，铰链区，和/或构架区可改造目的抗体(见WO92/02190和美国专利号5,530,101,5,585,089,5693.761,5693792,5714350，和5777085)。另外，使用Ig cDNa构建嵌合免疫球蛋白基因在本领域中是已知的(Liu等，PNAS，843439(1987)和免疫学杂志，1393521(1987))。从杂交瘤或其它产生抗体的细胞中分离mRNA并用于产生cDNA。目的cDNA可使用特异性引物经聚合酶链反应扩增(美国专利号4683195和4683202)。另外，可制备并筛选文库以分离目的序列。然后将编码抗体可变区的DNA序列融合到人恒定区序列上。人恒定区基因的序列可参见Kabat等(1991)，免疫学目的的蛋白质序列，N.I.H.
发明者D·C·汉森, M·J·尼维, E·E·穆勒, J·H·汉克, S·C·吉尔曼, C·G·戴维斯, J·R·科瓦兰 申请人:辉瑞大药厂, 阿布格尼克斯公司