-MCS-EFl-GFP+Puro,以 RFP 为报告基因，将 miR-lOb sponge 序列连接到 RFP序列后，作为RFP基因的3'UTR区域。miR-lOb sponge序列由Generay公司合成并插 入至 pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP+Puro 载体的 BamHI/Notl 之间，然后将 RFP 序列插入 EcoRI/ BamHI 之间构建完成 pCDH-RFP-miR10b
[0037] sponge-EFl-GFP+puro 载体（图 2)。miRlOb sponge 克隆部分验证由 Generay 公 司测序并验证。插入的 RFP 基因的 pCDH-RFP-miR10b sponge-EFl-GFP+puro 由 PCR(图 3) 和酶切验证（图4)显示质粒构建成功。
[0038] 为构建miR-lOb的过表达载体，miR-lOb序列及其侧翼序列克隆至pMD19-T载 体，由上海桑尼生物科技有限公司测序。结果显示miR-lOb序列正确，将测序确认的 miR-lOb序列及其侧翼序列做亚克隆，插入pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP+Puro载体的EcoRI/ BamHI之间（图5)。经过PCR(图6)和酶切验证（图7)，确认载体构建完成。载体命名为 pCDH-CMV-miR10b-EFl-GFP+Puro。将载体转染入293T细胞中，构建慢病毒载体（图8)。
[0039] 病毒感染及抗性筛选稳转细胞株：在六孔板中无抗完全培养基中接种6. 4 X IO5个 细胞，37°C、5% CO2过夜，稀释病毒：稀释液（靶细胞维持液培养基UOOOul+终浓度5 μ g/ ml Polybrene，将慢病毒原液（IOOul)加入到稀释液中（此时细胞个数按IX IO6计，即MOI =10);移去细胞培养液，加入Step2稀释后的病毒液，同时建立对照（blank、negative), 37°C、5% CO2过夜（感染时细胞融合度为70-80% )，移去细胞侵染后的病毒液，加入2ml 完全培液，37°C、5 % CO2过夜；根据细胞状态，进行常规传代，传代同时（感染后48h)，换用 含嘌呤霉素（puro终浓度1 μ g/ml)的完全培养基以进行抗性筛选；以后每隔两天换用新 的含puro的培养基，直至Blank组细胞全部死亡；将存活下来的细胞换用含一半筛选浓度 药物的培养基培养，进行为期一周的抗性维持。最后采用荧光定量PCR的实验方法，分析 miR-lOb的表达。由图可见，miR-lOb在miR-10bmimic AGS细胞中的表达与AGS (Blank)细 胞相比，上调了 120多倍，而在spongeAGS细胞中的表达却未得到明显抑制，此后多次重复 sponge实验，但均未能得到理想结果（图9)。因此，我们选择了过表达miR-lOb来进行后 续的实验。
[0040] 分别培养 AGS NC (Scramble)细胞和 AGS miR-lOb mimic (miR-10b mimic)细胞 株，进入对数生长期后收集细胞，分别行荧光定量PCR，WesternBlot检测，分析miR-lOb和 KLF4核酸和蛋白表达水平的变化。结果（图10)显示，过表达miR-lOb后，KLF4mRNA表达 水平下降了近两倍（P〈〇. 05)，而KLF4蛋白表达也呈现显著的下调（P〈0. 05)。
[0041] 实施例三：荧光素酶报告检测
[0042] 采用了双荧光素酶检测法进一步验证KLF4是否是miR-lOb的直接靶基因。共转 染 pGL3-Control、pRL-TK (WT、Mut)、pCD513B-l (NegativeControl、miR10b)于 293T 细胞，检 测双突光素酶活性从而判断miRlOb对不同pRL-TK载体Renilla Iuciferase表达的影响。 结果显示（图11)，miR-lOb共转染3 ' -UTR (wt)与miR-lOb共转染3 ' -UTR (mut)相比，荧 光的表达量显著降低（P〈〇. 05)。以上结果表明，在胃癌中，KLF4是miR-lOb的直接靶基因， 且miR-lOb在核酸和蛋白水平同时调节KLF4的表达。
[0043] 实施例四：miR-lOb和KLF4在胃癌临床组织中表达相关性的研究
[0044] a)miR-10b在胃癌组织中的表达
[0045] 收集至2011年-2014年入住我院的能米集到胃癌标本的胃癌患者癌组织和癌芳 正常组织，共67对，离体30min内液氮速冻后，-80°C冰箱保存备用。此后使用Trizol抽提 组织中总RNA，采用茎环逆转录（RT)引物设计miR-lOb引物（表1)，SYBR Green I荧光定量 PCR法检测miR-lOb在胃癌组织中的表达，并分析其表达水平与临床病理特征的相关性。研 究结果显示，将癌旁正常组织用来消除个体差异，以2_ AZiCT=l为界，大于1定义为miR-l〇b 表达水平上调，小于1定义为miR-lOb表达水平下调，结果发现，36例（53. 73%，36/67) 组织中miR-lOb的表达水平上调（图12)，而将67例患者按分化程度分类为普通腺癌组 和印戎细胞癌组（包括印戎细胞癌和粘液腺癌）发现，印戎细胞癌组中有15例（15/20， 75. 00% )miR-10b的表达水平上调，而普通腺癌组中20例数（20/47,42. 55% )miR-10b的 表达水平上调，两者比较有显著地统计学差异，提示，恶性程度越高，miR-10b表达水平越 高。此外，对miR-lOb的表达与胃癌的临床病理特征相关性分析发现，miR-lOb的表达与肿 瘤大小，浸润深度，发生位置以及分化程度密切相关（表2)。
[0046] TablelReverse transcription and stem-loop primers for Real-Time PCR
[0047]
【主权项】
1. 一种miR-lOb基因作为KLF4靶基因的调控者在制备调节癌症细胞中KLF4表达水 平药物或试剂盒中的用途。
2. 根据权利要求1中所述用途，其中调节癌症细胞中KLF4表达水平为MiRNA-10b抑 制KLF4的表达。
3. 根据权利要求1中所述用途，其中癌症细胞主要为胃癌细胞。
4. 根据权利要求1中所述用途，其中所述miR-10b在RNA和蛋白水平同时调节靶基因 KLF4的表达。
5. -种KLF4作为癌症治疗靶点在制备治疗癌症药物或试剂盒中的用途。
6. 根据权利要求5中所述用途，其中癌症细胞主要为胃癌细胞。
7. -种验证胃癌细胞中KLF4是miR-10b靶基因的研究方法，具体为： a) 生物信息学方法对miR-10b的靶基因进行预测； b) 不同胃癌细胞中miR-10b、KLF4 mRNA表达水平的相关性检测； c) 荧光素酶报告验证KLF4是miR-10b的靶基因； d) 建立稳定表达miR-10b的细胞株，荧光定量PCR技术和western blot技术阐明 miR-10b作用于靶基因KLF4的核酸水平或蛋白水平； e) 胃癌组织中验证miR-10b和KLF4的表达相关性。
【专利摘要】本发明公开了一种miR-10b基因在胃癌中的应用。本发明发现一种促进胃癌生长的微小RNA，miR-10b，KLF4是miR-10b的直接靶基因，miR-10b在RNA和蛋白水平同时调节靶基因的表达。在不同细胞中观察到miR-10b，KLF4 mRNA的表达水平呈相反趋势后，利用荧光素酶报告基因分析，初步验证了KLF4是miR-10b的靶基因；此后通过miR-10b稳定表达株的建立，进一步发现miR-10b在RNA和蛋白水平同时调节靶基因的表达，最后在临床胃癌组织中再次证实了以上的调控方式。所公开的为在胃癌细胞系中KLF4是miR-10b的靶基因的首次报道，该发明利用miRNA为胃癌提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。本发明可为胃癌的诊断和预后提供有利的技术支持。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104611429
【申请号】CN201510030461
【发明人】姚行, 马志红, 戴利成
【申请人】湖州市中心医院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月21日