一种基于石墨烯氧化物芯片dna解旋酶的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医学领域中的蛋白质检测，尤其一种基于生物芯片的DNA解旋酶检测方法。
【背景技术】
[0002]DNA解旋酶是一种蛋白质，利用三磷酸腺苷(ATP)水解提供的能量打开互补的核酸双链，获得单链，在DNA的复制、修复、重组以及转录等代谢过程都起着重要作用。它们常常依赖于单链的存在，并能识别复制叉的单链结构。一般在DNA复制过程中起到催化双链DNA解旋的作用，这在病毒复制以及细胞繁殖需要单链DNA的反应中有着十分重要的作用，已被用于治疗许多病毒性疾病，因此检测DNA解旋酶的活性有着极其重要的意义。
[0003]目前存在的DNA解旋酶活性的检测方法多数通过32P的标记DNA链中的一条，通过凝胶电泳的方法来检测，但这种方法成本较高、耗时、检测的通量低。
[0004]2004年英国曼彻斯特大学的两位科学家安德烈?海姆(Andre Geim)和康斯坦丁.诺沃肖罗夫(Konstantin Novoselov)首次制备出石墨稀，并获2010年的诺贝尔物理学奖，受到了全世界研宄人员的关注。石墨烯的氧化物制备简单，成本比较低，表面有较多的功能基团，如醛基、羧基等，在石墨烯氧化物表面固定FAM (羧基荧光素)标记的双链DNA时，当DNA由双链变为单链时，FAM与石墨烯氧化物表面的距离发生改变，石墨烯氧化物通过荧光谐振能量传递(FRET)能淬灭FAM荧光的程度不同，基于这个特点，通过FAM荧光强度的变化对DNA解旋酶活性进行检测。生物芯片是一种高通量的工具，利用石墨烯氧化物的特性，把生物芯片与石墨烯氧化物相结合，发展一种灵敏度较高的DNA解旋酶检测方法。
【发明内容】
[0005]针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种基于石墨烯氧化物芯片对DNA解旋酶的检测方法，能低成本、高通量、高灵敏性对DNA解旋酶进行检测。
[0006]本发明是通过以下技术手段实现上述技术目的的。
[0007]一种基于石墨烯芯片的DNA解旋酶的检测方法，包括如下步骤:
(O制备具有氧化石墨烯点阵的玻片:
Iml石墨稀氧化物溶液(0.3 mg/ml)点在氨基修饰的玻片(长76mm，宽25mm，厚Imm)上，干燥后，用超纯水冲洗，在具有石墨烯氧化物点阵的玻片上，加入I ml含有0.6 nM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和6.0 nM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)的混合物后在室温下12h。
[0008](2)连接双链DNA序列到具有石墨烯氧化物点阵的玻片:
一端氨基修饰另一端FAM标记的单链DNA序列，与互补的单链DNA按照1:1的比例混合后，放置在杂交盒中和步骤(I)制备的玻片进行化学反应12h，用PBS洗去多余的探针，扫描记录玻片上DNA标记的FAM荧光强度Fp
[0009](3) DNA解旋酶检测: ATP为10 mM时，将不同数量的DNA解旋酶加入到步骤(2)处理过的玻片上，作用30min以下，PBS冲洗，扫描记录玻片上DNA标记的FAM荧光强度F2。
[0010]本发明的机理为:加入不同数量的DNA解旋酶在不同作用时间通过对步骤(2)中双链DNA的作用，在DNA解旋酶作用前后发生变化，引起FAM的荧光强度发生改变，通过FAM荧光强度的变化前后的比较，PBS冲洗后扫描和分析，从而对溶液中是否存在DNA解旋酶进行检测，当DNA解旋酶作用后FAM荧光强度F2/DNA解旋酶作用前FAM荧光强度F1K值接近于O时，说明溶液中存在DNA解旋酶。
[0011]本发明的有益效果是:
(I)本发明把石墨烯氧化物和微阵列芯片技术相结合，能低成本、高通量、高灵敏性对DNA解旋酶进行检测。
[0012](2)本发明充分运用生物芯片上互补双链DNA与单链DNA上标记的FAM，与石墨烯氧化物表面的距离不同，DNA解旋酶对双链DNA作用后，FMA与石墨烯氧化物的距离发生改变，引起FAM的荧光强度变化，根据这个原理对DNA解旋酶进行检测，相对简单而且有效。
【附图说明】
[0013]图1为本发明的流程示意图。
【具体实施方式】
[0014]下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0015](I)氨基修饰玻片的制备:在放有玻片的烧杯中加入5 ml过氧化氢(H2O2)，然后用移液管加入15 ml浓硫酸(H2SO4),在摇床上缓慢振荡或静置30 min使之
充分反应，此反应可使表面羟基化，倒掉上步反应的液体，用去离子水清洗3次。先用无水乙醇清洗2次，然后倒入20 ml无水乙醇，反应后的获得的羟基化
硅片转移到烧杯中，用无水乙醇清洗3次。清洗完成后倒掉乙醇，迅速加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和无水乙醇的混合液(体积比为1:15)，或者先加15ml无水乙醇，然后用移液管加I ml APTES，摇床上振摇反应2 h。
[0016](2)石墨烯氧化物的制备:根据改进的Hummer法，在三口烧瓶中，加入3g鳞片石墨粉、1.5 g NaN03与69 ml浓硫酸后放入恒温水浴锅中搅拌。反应Ih后加入Ig KMnO4,35°C下反应5个小时后加入150 ml去离子水。在温度98°C下反应30 min后，再加入50 ml的去离子水、5 ml H2O2以及250 ml的10%稀盐酸，将溶液倒入1000 ml的大烧杯中，洗涤至PH值为5-6。
[0017](3)制备具有石墨烯氧化物点阵的玻片:1 ml石墨烯氧化物溶液(0.3 mg/ml)点在氨基修饰的玻片上，干燥后，用超纯水冲洗。加入I ml EDCI (0.6 nM)和sulfo-NHS(6.0 nM)后在室温下12ho
[0018](4)连接目标双链 DNA:合成 DNA 序列，5’-NH2-GAG CGG ATT ACTATA CTA CAT TAGMT TCC-FAM-3’，与 5’-GGA ATT CTA ATG TAG TAT AGT MT CCG CTC-3’，在浓度为 10 pmol下按照1:1比例的混合液，在含有50 mM三(羟甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)与50 mM氯化钠(NaCl)的pH 8.0缓冲液中变性杂交2 h后，取0.6 ul液体滴加到I)制备的玻片表面，在杂交盒中进行化学反应12 h，并固定到石墨烯氧化物点阵上。
[0019](5) DNA解旋酶的检测:在含有0.5 mM乙二胺四乙酸(EDTA)，10 mM三磷酸腺苷(ATP)，1.3 mM氯化镁(MgCl2)及10%丙三醇溶液中加入10 nM的严重急性呼吸综合征病毒的DNA解旋酶进行反应30 min以下，一条单链DNA脱离具有氨基修饰的固定在石墨烯氧化物上的单链DNA，FMA与石墨烯氧化物的距离发生改变，引起FAM的荧光强度变化，从而使石墨烯氧化物对固定在表面单链DNA标记的FAM的荧光发生淬灭，用PBS冲洗后，在扫描仪上于520 nm下扫描和分析，测量反应后的荧光强度F2/DNA解旋酶作用前FAM荧光强度F1比值接近于0，上述结果表明，DNA解旋酶能有效对双链DNA进行解旋，进一步测量对不同浓度DNA解旋酶在不同作用时间下FAM荧光强度减少的程度，可以反映DNA解旋酶的活性，从而对严重急性呼吸综合征病毒DNA解旋酶的进行检测。
[0020]所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种基于石墨烯氧化物芯片DNA解旋酶的检测方法，其特征在于:包括如下步骤: (O制备具有氧化石墨烯点阵的玻片； (2)—端氨基修饰另一端FAM标记的单链DNA与互补的单链DNA变性杂交后，连接到具有石墨烯氧化物点阵的玻片上，反应完成后洗涤，扫描记录玻片上DNA标记的FAM荧光强度F1; (3)DNA解旋酶检测: ATP为10 mM时，将不同数量的DNA解旋酶加入到步骤(2)处理过的玻片上，作用30min以下，PBS冲洗，扫描记录玻片上DNA标记的FAM荧光强度F2。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述步骤(I)是将Iml石墨烯氧化物溶液点在氨基修饰的玻片上，干燥后，用超纯水冲洗，然后加入Iml EDCI和sulfo-NHS混合物后在室温下12h。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于:所述石墨烯氧化物溶液的浓度为0.3mg/ml ；EDCI溶液的浓度为0.6 nM ；sulfo-NHS溶液的浓度为6.0 nM。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于:所述步骤(2)的具体方法为:一端氨基修饰另一端FAM标记的单链DNA序列，与互补的单链DNA按照1:1的比例混合后，放置在杂交盒中和步骤(I)制备的玻片进行化学反应12h，用PBS洗去多余的探针。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于:当DNA解旋酶作用后FAM荧光强度FJDNA解旋酶作用前FAM荧光强度F1比值接近于O时，说明溶液中存在DNA解旋酶。
【专利摘要】本发明属于生物医学领域中的蛋白质检测，尤其是一种基于石墨烯氧化物芯片的DNA解旋酶的检测方法：本发明主要包括如下步骤：（1）制备具有氧化石墨烯点阵的玻片；（2）连接双链DNA序列到具有石墨烯氧化物点阵的玻片：（3）DNA解旋酶的检测：加入不同数量的DNA解旋酶在不同作用时间下，PBS冲洗后，进行扫描和分析，通过FAM荧光强度的变化，进行检测。本发明运用石墨烯氧化物能淬灭单链DNA标记的FAM上的荧光，DNA解旋酶对双链DNA作用后，一条单链DNA脱离互补的固定在石墨烯氧化物上的单链DNA后，FAM与石墨烯氧化物表面的距离发生改变，引起FAM的荧光强度变化的特点，结合高通量的微阵列芯片技术，能低成本﹑高灵敏度地对DNA解旋酶进行检测。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-34
【公开号】CN104611419
【申请号】CN201410832817
【发明人】高力, 时海霞, 李琴, 李娆祺, 周阳, 陈克平, 张春霞, 连超群
【申请人】江苏大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年12月29日