利用ssr引物鉴定石榴品种的方法与应用
【专利说明】
[0001]
技术领域： 本发明涉及分子生物技术领域，具体来说是利用ssr引物鉴定石榴品种的方法与应 用。
[0002]
【背景技术】： 品种鉴定是农业生产、作物育种和种子检验上的重要方法，也是保护作物品种、防止假 冒伪劣品种进入市场的重要手段。传统的果树品种检验方法有形态学鉴定与同工酶鉴定 等，但是，形态学鉴定所需周期长，耗费大量人力、物力和财力。石榴品种的纯正是石榴生产 的重要环节。在石榴生产中，各种品种混杂现象严重，同名异物、同物异名现象严重，常规鉴 定耗时较长，田间形态学鉴定难度较大，随着分子生物学技术的飞速发展，分子标记技术不 断成熟，给果树从品种基因组水平上的鉴定开辟了途径。
[0003]
【发明内容】
： 为实现上述石榴品种鉴定中出现的问题，本发明的目的在于，提出利用ssr引物鉴定 石榴品种的方法与应用，该方法利用分子标记技术，在营养生长期实现石榴品鉴定，具有周 期短，成本低，结果可靠，节约人力、物力及土地资源，大大提高了品种鉴定的准确性。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种SSR引物组，该SSR引物组的 序列如下： Pom04 F:TCCTTTTTACCCAATTTTCA R:TGCACATCTTTTGCTGTAAG Pom06 F:TACTAGGTGGAACCGAACTT R:CCTTGACAACCTCATCTCAT PomlO F:CCTCATTGCTGATGAATCTT R:ACTCGAGAAGCTCTGTGAAG Poml3 F:CACACCCTTCATCAAAAGAT R:GGACTAACAACCAGCCATAG Poml4 F:CGCATTTGGTTGTAGAAGAC R:AGGAGCGTCTGTTTTAATCTT Pom21 F:GACTGGAAGAAGCAGAGACT R:GAAAAGGAAGTAGCAGAGCA Pom24 F:GGAGATTTGAATTGGGAAGT R:GTGGACTAACTCAAGCAAGG Pom39 F:TAGTTGAATAGGCCACATCC R:CTATACAGTCCGAGGACCAC Pom46 F:CTTCCTCCTACCGAACTATG R:CCCACTTTGACACTTCTACC Pom55 F:GAGACAATTGGGATCAGAAA R:AGTCGACGAACTGTGAAATC Pom56 F:CTCGCCATACTACTGAAAGG R:ATTGGGTGAGATATGTTTGG 本发明的另一个目的是提供一种利用SSR引物组鉴定石榴品种的方法，包括如下步 骤： (1)提取各样品石槽种质DNA ; ⑵利用设计的11对石榴SR引物，扩增石榴的基因组DNA ; (3) 电泳检测每个样品的扩增条带； (4) 记录每个样品每对引物的DNA扩增带型； (5) 根据DNA扩增带型区分鉴定石榴品种； 进一步，所述步骤（2)中PCR扩增程序为94°C预变性5min ;94°C变性45s，60°C复性 45s，72°C延伸lmin，35个循环；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。
[0005] 进一步，所述步骤（2)中PCR扩增体系包括20ng模板DNA，2. 5 mmol/L Mg2+, 0. 2mmol/L dNTPs, IU TaqDNA 聚合酶，每条引物 250 nmol/L，10 X Buffero,体系中余量用 CldH2O 补齐。
[0006] 进一步，所述步骤（5)结果判定时，如果两个品种在两个或两个以上SSR标记位点 具有不同等位，则判定为不同品种。
[0007] 本发明的有益技术效果是：本发明的引物特异性高，扩增效率好，能快速鉴定石榴 的不同品种，具有周期短，成本低，结果可靠，节约人力、物力及土地资源特点。
[0008]
【附图说明】： 图1本发明方法SSR引物经PCR扩增后产物检测图。引物Pom21和Pom46在石榴种质 中的扩增图。
[0009] 图2利用本发明方法产生的不同品种聚类分析树形图。
[0010] 图3利用引物PomH检测不同品种聚丙烯酰胺电泳结果图。
[0011] 图4利用引物Pom55检测不同品种聚丙烯酰胺电泳结果图。
[0012]
【具体实施方式】： 下面结合具体实施实例对本发明做进一步的说明： 实施实例 材料与方法 材料 供试材料均采自安徽省水果产业技术体系蛘埠市水果综合试验站石榴品种园。收集蛘 埠市怀远县栽培的石榴主要品种。其中包括大笨子及其芽变新品种（'73-06'）。对各品种 编号标记见表1。
[0013] 表1石榴品种名称、编号
【主权项】
1. 利用ssr引物鉴定石榴品种的方法与应用，其特征在于，包括以下步骤： (1)提取各样品石槽种质DNA ; ⑵利用设计的11对石榴SSR引物，扩增石榴的基因组DNA ; (3) 电泳检测每个样品的扩增条带； (4) 记录每个样品每对引物的DNA扩增带型； (5) 根据DNA扩增带型区分鉴定石榴品种； 所述的11对石榴SSR引物序列如下： Pom04 F:TCCTTTTTACCCAATTTTCA R:TGCACATCTTTTGCTGTAAG Pom06 F:TACTAGGTGGAACCGAACTT R:CCTTGACAACCTCATCTCAT PomlO F:CCTCATTGCTGATGAATCTT R:ACTCGAGAAGCTCTGTGAAG Poml3 F:CACACCCTTCATCAAAAGAT R:GGACTAACAACCAGCCATAG Poml4 F:CGCATTTGGTTGTAGAAGAC R:AGGAGCGTCTGTTTTAATCTT Pom21 F:GACTGGAAGAAGCAGAGACT R:GAAAAGGAAGTAGCAGAGCA Pom24 F:GGAGATTTGAATTGGGAAGT R:GTGGACTAACTCAAGCAAGG Pom39 F:TAGTTGAATAGGCCACATCC R:CTATACAGTCCGAGGACCAC Pom46 F:CTTCCTCCTACCGAACTATG R:CCCACTTTGACACTTCTACC Pom55 F:GAGACAATTGGGATCAGAAA R:AGTCGACGAACTGTGAAATC Pom56 F:CTCGCCATACTACTGAAAGG R:ATTGGGTGAGATATGTTTGG 根据权利所要求1所述利用ssr引物鉴定石榴品种的方法与应用，其特征是，所述步骤 (2)中PCR扩增程序为94°C预变性5min ;94°C变性45s，60°C复性45s，72°C延伸lmin，35 个循环；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。
2. 根据权利要求3所述利用ssr引物鉴定石榴品种的方法与应用，其特征是，所述步骤 (2)中PCR扩增体系包括包括20ng模板DNA，2.5 mmol/L Mg2+，0.2mmol/L dNTPs，lU TaqDNA 聚合酶，每条引物250 nmol/L，10 X Buffero,体系中余量用ddH20补齐。
3. 根据权利要求2所述利用ssr引物鉴定石榴品种的方法与应用，其特征是所述步骤 (5)结果判定时，如果两个品种在两个或两个以上SSR标记位点具有不同等位，则判定为不 同品种。
【专利摘要】本发明涉及分子生物技术领域，具体来说是一种SSR引物组及其利用该引物鉴定石榴品种的方法；该SSR引物组由20条引物组成；鉴定步骤包括（1）石榴叶片DNA提取；（2）PCR扩增；（3）电泳检测；（4）数据记录；（5）结果判定。本发明引物特异性高，扩增效率好，能快速鉴定石榴的不同品种，具有周期短，成本低，结果可靠，节约人力、物力及土地资源特点。本发明可以用于对供试石榴品种与已知石榴品种进行品种鉴定，或构建石榴品种数据库。该方法为准确鉴定石榴种质资源，尤其是同物异名和同名异物现象奠定了基础，也为新品种保护奠定了基础。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104611414
【申请号】CN201410612733
【发明人】潘海发, 徐义流, 高正辉, 张金云, 束冰
【申请人】安徽省农业科学院园艺研究所
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年11月5日