亲水性重组蛋白的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及亲水性重组蛋白的提取方法，详细而言，本发明涉及从表达亲水性指 数（hydropathyindex)为0以下的重组蛛丝蛋白等亲水性重组蛋白的宿主中提取亲水性 重组蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，利用基因重组技术将目标外来基因导入大肠杆菌等宿主的细胞中、使目 标蛋白表达成为可能，利用该技术进行了各种有用的重组蛋白的生产。蛛丝纤维是高强度 和具有韧性的纤维，由于这样的特性，蛛丝作为新型原料受到关注，利用基因重组技术进行 了使作为蛛丝原料的蛛丝蛋白在大肠杆菌等宿主细胞中的表达、回收。通常，使用大肠杆菌 等宿主进行重组蛋白的生产时，通过将菌体破坏来回收目标蛋白。例如，专利文献1中记载 了从宿主细胞中回收重组蛛丝蛋白的方法。
[0003] 现有技术文献
[0004] 专利文献
[0005] 专利文献1 :日本特表2004-503204号公报
【发明内容】
[0006] 发明所要解决的课题
[0007] 专利文献1中，通过使用甲酸、丙酸等有机酸使宿主细胞溶解来回收重组蛛丝蛋 白，但当使用甲酸、丙酸等有机酸时，存在对酸没有耐受性的蛋白易于被分解的问题。
[0008] 本发明为了解决上述以往的问题，提供一种能够在不使用有机酸的情况下从表达 亲水性重组蛛丝蛋白等亲水性重组蛋白的宿主中提取亲水性重组蛋白的亲水性重组蛋白 的提取方法。
[0009] 用于解决课题的手段
[0010] 本发明涉及一种亲水性重组蛋白的提取方法，其是从表达亲水性重组蛋白的宿主 中提取亲水性重组蛋白的方法，其特征在于，其包含：向上述表达亲水性重组蛋白的宿主 中添加溶解用溶剂，获得宿主细胞的溶解物的溶解物获取工序，和向通过上述溶解物获取 工序获得的上述宿主细胞的溶解物中添加稀释用溶剂，然后从得到的稀释液中将不溶物分 离，从而将含有上述亲水性重组蛋白的上清液回收的工序；其中，上述亲水性重组蛋白的亲 水性指数为〇以下，上述溶解用溶剂为非质子性极性溶剂，上述稀释用溶剂为水系溶剂。
[0011] 本发明的亲水性重组蛋白的提取方法中，上述溶解用溶剂优选为不具有环状结构 的非质子性极性溶剂，偶极矩优选为3. 0D以上。上述溶解用溶剂更优选为选自二甲基亚 砜、N，N-二甲基甲酰胺、和N，N-二甲基乙酰胺中的一种以上的非质子性极性溶剂。上述溶 解用溶剂优选为在上述非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂。上述稀释用溶剂优选 为选自（1)水、（2)水与乙醇的混合液和（3)水溶性缓冲液中的一种水系溶剂。上述溶解 用溶剂相对于上述宿主的质量以体积（mL)/质量（g)比计优选添加0.5倍以上，上述稀释 用溶剂相对于上述宿主细胞的溶解物以体积比计优选添加0. 5倍以上。上述亲水性重组蛋 白优选为选自重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白和重组胶原中的一种蛋白。
[0012] 发明效果
[0013] 根据本发明，通过使用非质子性极性溶剂作为溶解用溶剂、使用水系溶剂作为稀 释用溶剂，用溶解用溶剂将表达亲水性指数为〇以下的亲水性重组蛋白的宿主溶解，向得 到的宿主细胞的溶解物中添加稀释用溶剂进行稀释、将不溶物分离，回收上清液，从而能够 在不使用有机酸的情况下，简便且高效地从宿主提取亲水性指数为〇以下的亲水性重组蛋 白。
[0014] 另外，根据本发明，通过使用不具有环状结构的非质子性极性溶剂，还能够以更高 的纯度获得亲水性指数为0以下的重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白、重组胶原等亲水性 重组蛋白。另外，根据本发明，通过使用在非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂作为 溶解用溶剂，还能够获得纯度更高的亲水性指数为0以下的重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性 蛋白、重组胶原等亲水性重组蛋白。
【附图说明】
[0015] 图1为表示实施例1中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)的结 果的照片。
[0016] 图2为表示实施例2~5中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照 片。
[0017] 图3为表示实施例6~8中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照 片。
[0018] 图4为表示实施例9~13中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照 片。
[0019] 图5为表示实施例16中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
[0020] 图6为表示实施例17~21中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的 照片。
[0021] 图7为表示实施例22中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
[0022] 图8为表示实施例23~26中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的 照片。
[0023] 图9为表示实施例28中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
[0024] 图10为表示比较例1中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
[0025] 图11A为表示实施例32中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照 片，图11B为表示实施例33中得到的蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照片。
【具体实施方式】
[0026] 本发明中，蛋白的亲水性指数（hydropathyindex)是如下算出的数值。首先，求 出蛋白中存在的氨基酸的亲水性指数的总和。接着，用该总和除以蛋白中的氨基酸残基数 求出平均值，将算出的平均值作为蛋白的亲水性指数。其中，关于氨基酸的亲水性指数，使 用公知的指标（Hydropathyindex:Kyte，J. &Doolittle，R.F. (1982)Asimplemethodfor displayingthehydropathiccharacterofaprotein.J.Mol.Biol. 157,105-132. )〇 具 体而言，各氨基酸的亲水性指数（下文也记为HI)如下表1所示。
[0027]表 1
[0029]本发明者们发现：通过在表达亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白的宿主中添 加非质子性极性溶剂、使宿主细胞溶解，然后在得到的宿主细胞的溶解物中添加水等水系 溶剂进行稀释，能够将亲水性指数为〇以下的亲水性重组蛋白通过上清液回收，从而完成 了本发明。即发现了，通过将宿主细胞用非质子性极性溶剂溶解，能够获得亲水性指数为0 以下的亲水性重组蛋白溶解在非质子性极性溶剂中而成的溶解物，当在该溶解物中添加水 等水系溶剂时，亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白不发生凝聚、而除亲水性指数为0以 下的亲水性重组蛋白以外的大部分蛋白发生凝聚，从而完成了本发明。下文中，在没有特别 说明的情况下，亲水性蛋白是指亲水性指数为0以下的亲水性蛋白。另外，下文中，在没有 特别说明的情况下，重组蛋白是指亲水性指数为0以下的亲水性重组蛋白。
[0030] 上述非质子性极性溶剂没有特别限定，从降低夹杂物的观点出发，优选纯度为 90%以上、更优选为95%以上。上述非质子性极性溶剂优选为不具有环状结构的非质子性 极性溶剂。当使用不具有环状结构的非质子性极性溶剂时，能够以更高的纯度提取重组蛛 丝蛋白、重组节肢弹性蛋白、重组胶原等亲水性重组蛋白。作为不具有环状结构的非质子性 极性溶剂，可列举出二甲基亚砜（DMS0)、N，N-二甲基甲酰胺（DMF)和N，N-二甲基乙酰胺 (DMA)等。
[0031] 另外，上述非质子性极性溶剂的偶极矩优选为3. 0D以上。偶极矩被用作表示分子 的极性强度的指标，偶极矩越大则极性强度也越大。通常，偶极矩为3. 0D以上的分子的极 性强，当溶解蛋白等具有极性的化合物时，极性大的溶剂是有效的。下表2中记载了基于讲 谈社Scientific公司出版的溶剂手册（2007年）的各种有机化合物（有机溶剂）的偶极 矩。作为偶极矩为3.0D以上的非质子性极性溶剂，可列举出二甲基亚砜（DMSO)、N，N-二甲 基甲酰胺（〇1^)、1^二甲基乙酰胺（0嫩)、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮（010)、^甲基-2-吡 咯烷酮（NMP)、乙腈等。
[0032]表2
[0034] 从重组蛋白的提取纯度高的观点出发，上述非质子性极性溶剂更优选偶极矩为 3. 0D以上且不具有环状结构，进一步优选为选自二甲基亚砜（DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺 (DMF)和N，N-二甲基乙酰胺（DMA)中的一种以上的非质子性极性溶剂。
[0035] 上述溶解用溶剂优选为在非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂。当在非质 子性极性溶剂中添加无机盐时，能够获得纯度更高的重组蛛丝蛋白、重组节肢弹性蛋白、重 组胶原等亲水性重组蛋白，因此优选。上述无机盐没有特别限定，从提高重组蛋白的纯度的 观点出发，优选为碱金属卤化物、碱土类金属卤化物、碱土类金属硝酸盐和硫氰酸盐中的至 少一种。作为上述碱金属卤化物，优选使用例如LiCl、LiBr等。作为上述碱土类金属卤化 物，优选使用例如〇&(：12等。作为上述碱土类金属硝酸盐，优选使用例如Ca(N03)2等。作为 上述硫氰酸盐，优选使用例如NaSCN等。
[0036] 当上述溶解用溶剂为在非质子性极性溶剂中添加无机盐而成的溶剂时，没有特别 限定，从提高重组蛋白的纯度的观点出发，无机盐的浓度优选为〇. 1M以上、更优选为0. 25M 以上、进一步优选为0. 5M以上。另外，上述溶解用溶剂中，无机盐的浓度的上限没有特别限 定，优选为饱和状态以下，例如可以为2. 5M以下。
[0037] 上述溶解用溶剂的添加量只要是能够溶解上述宿主的量即可，没有特别限定，从 提高溶解性的观点出发，相对于上述宿主（细胞）的质量以体积（mL)/质量（g)比计优选 为0. 5倍以上、更优选为0. 75倍以上、进一步优选为1倍以上。另外，从操作的简便性出发， 上述溶解用溶剂的添加量相对于上述宿主的质量以体积（mL)/质量（g)比计优选为10倍 以下、更优选为6倍以下、进一步优选为4倍以下。上述宿主（细胞）可以为干燥的状态、 也可以为湿的状态。
[0038] 将上述溶解用溶剂添加到宿主中、获得宿主细胞的溶解物的溶解物获取工序没 有特别限定，从重组蛋白的溶解性的观点出发，优选在20°C以上的条件下进行、更优选在 45°C以上的条件下进行、进一步优选在50°C以上的条件下进行。另外，从抑制重组蛋白分解 的观点出发，上述溶解物获取工序优选在100°C以下的条件下进行、更优选在95°C以下的 条件下进行。另外，上述溶解物获取工序没有特别限定，例如优选进行10~300分钟、更优 选进行30~180分钟。在向通过溶解物获取工序得到的宿主细胞的溶解物中添加稀释用 溶剂之前，可以将不溶物分离。不溶物的分离只要能够将沉降物（凝聚物）分离即可，没有 特别限定。从操作的简便性出发，优选通过利用过滤的分离和/或离心分离来进行。利用 过滤的分离例如可以使用滤纸、过滤膜等来进行。离心分离的条件没有特别限定。例如可 以在室温（20±5°C)、8000Xg~15000Xg下进行5~20分钟。上述不溶物的分离可以进 行2次以上。
[0039] 上述稀释用溶剂为水系溶剂。本发明中，水系溶剂是指包含水的溶剂，可列举出例 如水、水与水混和性有机溶剂的混合液、水溶性缓冲液、酸性水溶液、碱性水溶液等。作为酸 性水溶液，可列举出甲酸、乙酸、稀盐酸等酸性水溶液；作为碱性水溶液，可列举出氢氧化钠 水溶液、氢氧化钙水溶液等碱性水溶液。作为水混和性有机溶剂，只要是能够与水混合的有 机溶剂即可，可以使用公知的有机溶剂。具体而言，可列举出甲醇、乙醇等醇类。
[0040] 上述稀释用溶