专利名称：鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的分离提纯工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于高附加值医用及食用蛋白质生物分离提纯领域，尤其是一种操 作简便、成本低廉、容易放大、产出率高，适应工业化生产的鸡蛋蛋黄中高附 加值蛋白质的分离提纯工艺。
背景技术：
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鸡蛋蛋黄价格低廉、来源丰富、易于获得，是非常理想的优质蛋白质的最 佳来源，其中的蛋白质主要包括脂蛋白的脱辅基蛋白、低密度脂蛋白、高密度 脂蛋白、卵黄蛋白、高磷蛋白和微量小分子蛋白等。每一大类蛋白质又包括几 种至数百种，可在食品工业、医药工业及生物技术领域广泛应用。例如低密 度脂蛋白具有优秀的乳化性质，可作为冷冻保护剂应用在诸如精子细胞等物质 的冷冻保存；卵黄蛋白中的鸡蛋免疫球蛋白家族，含有超过二百种抗体，有着 哺乳动物免疫球蛋白没有的优点，可帮助免疫系统抵御各种细菌、病毒、寄生 虫及毒素，已被广泛应用于诊断和治疗癌症、胃肠炎、乙肝、异种器官移植及 口腔等多种疾病，并在诸如诊断免疫分析和其他科学研究领域应用广泛；高磷
蛋白具有优秀的乳化性质及很强的消毒和抗氧化能力，并可显著促进人体对钙
的吸收，有效地防止钙的流失；微量小分子蛋白以及脂蛋白的脱辅基蛋白和部 分脂肪含有鸡蛋中的多种生长因子，在细胞培养等领域应用前景广阔，不仅成 本低、成分明确且由于遗传学上的远距离，不易引起被培养哺乳动物细胞的免 疫反应。各脂蛋白中的多种脂肪(如卵磷脂、不饱和脂肪酸等)也在保健食品 领域应用广泛。
目前，现有针对蛋黄蛋白质的分离提纯工艺普遍存在以下问题
(1) 对部分高附加值蛋白质(如高磷蛋白、脂蛋白和生长因子)的分离
提纯工艺研究不足，还没有开发出高效的提纯技术；
(2) 虽然针部分蛋白质的分离提纯工艺(如免疫球蛋白)研究较多，但 主要集中在实验室研究阶段，放大较难，即高效的工业化规模的提纯技术非常 有限，成本较高；(3) 现存各蛋白质分离提纯多引入有机溶剂或大量高价金属离子，限制 了这些蛋白质在食品或医药工业的进一步应用；
(4) 针对单一蛋白质的分离提纯，各工艺之间缺少整合基础、兼容性差、 无法充分综合利用各蛋白质的价值，难以灵活应对不同的市场需求。
因此尽管鸡蛋蛋黄优质蛋白质在诸多领域应用潜力巨大，但目前的实际应 用仍然有限。
发明内容
本发明是针对现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简便、成本 低廉、容易放大、产出率高，适应工业化生产的鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的 分离提纯工艺。
本发明的技术解决方案是 一种鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的分离提纯工 艺，其特征在于按如下步骤进行
a. 用去离子水稀释蛋黄原液并调节pH至4.0 7.0，凝结至上清液、蛋黄颗 粒状沉淀分层；
b. 将上清液、蛋黄颗粒状沉淀分离；
C.对分离得到的上清液用微滤或盐析处理，取富含高附加值蛋白质部分；
d. 对富含高附加值蛋白质部分超滤膜浓縮处理或用超滤膜过滤与超滤膜 浓縮组合处理，取浓縮物。
所述b步骤是离心分离，离心速度为3500 4500rpm，操作时间为20~40 分钟。
用去离子水稀释离心所得到的上清液并调节pH至4.0-7.0。 在上述步骤的基础上，还包括如下步骤
e. 向分离得到的蛋黄颗粒状沉淀中加入去离子水及氯化钠，得溶解液；
f. 用超滤膜渗析溶解液；
g. 经低速离心处理所得渗析液，得到沉淀及上清液；
h. 对上清液超滤膜浓縮处理，取浓縮物。
所述a、 f步骤的凝结温度为1 6°C，凝结时间为4 20小时。 所述c步骤微滤处理的微滤膜孔径为0.11-0.22 P m、盐析处理是加入浓度
为30~40%饱和浓度的硫酸铵溶液。
所述d步骤超滤膜过滤的截留分子量分别设置为400kDa、 100 kDa、 40kDa
和20kDa;超滤膜浓縮处理的截留分子量不大于5000 Da。所述f步骤的用超滤膜渗析的超滤膜截留分子量为1000Da 5000Da。 所述a步骤是用浓度为0.34M / L的氯化钠稀释蛋黄原液；所述e步骤是 用0.5M / L 0.7 M / L氯化钠溶液溶解蛋黄颗粒状沉淀。
所述d、 h步骤中超滤膜浓縮处理得到的滤液为a步骤稀释液。 本发明同现有技术相比，具有如下优点
(1) 生产效率高。利用不同截留分子量的超滤膜分离过程，可以有效的分 离提纯蛋黄中的各蛋白组分，通过调节操作条件，可以最大限度的利用所有高 附加值的蛋白质。
(2) 过程简单、易于放大。由于所用的膜分离过程不需要加热，可防止蛋 白质失活、杂菌污染，无相变，集分离、浓缩、提纯、杀菌为一体，分离效果 高，操作简单、费用低，易于放大，适用于大规模工业化生产。
(3) 生产成本低。不使用复杂的分离提纯技术(如色谱和高速离心)，整 个过程成本很低，经济效益显著。
(4) 灵活性高。利用相互兼容的针对各蛋白的分离提纯技术，以灵活的方 式整合成一系列完整的分离工艺，快速简便的分离提纯各目标蛋白，可以适应 不同时期的需求和市场情况，充分地利用鸡蛋中每一营养组分的价值和潜力。 可根据实际需要，使用间歇式或连续式生产，灵活性很高。
(5) 绿色生产。不使用任何有机溶剂和高价金属离子，十分绿色，非常 适合蛋白产品在食品或医药工业的进一歩应用。
图1是本发明实施例1的工艺流程图。 图2是本发明实施例2的工艺流程图。 图3是本发明实施例3的工艺流程图。
具体实施例方式
实施例1是以免疫球蛋白为主要产品的分离提纯工艺，如图1所示
a. 首先使用水稀释法对蛋黄原液进行稀释，蛋黄原液可由蛋黄蛋白分离器 制得或由蛋黄粉用去离子水配制而成。用5倍蛋黄原液体积(1升)的去离子
(5升)水稀释并在混合釜1中混合均匀，加入盐酸调节pH至5.0，混合釜1 中的混合液通过泵2、阀门3、进入凝结器4中，凝结温度为3 5。C，凝结时间 为11-13小时以确保脂肪的充分凝结，即上清液、蛋黄颗粒状沉淀分层；
b. 取上清液通过泵5、阀门6、孔径为0.22um的微滤膜7中进行微滤处理，将滤过的液体(富含高附加值蛋白质部分)置入料液釜8中，滤除的沉淀即产 物1-1。
c.料液釜8中的富含高附加值蛋白质部分经过泵9、阀门IO、进入截留 分子量为400kDa的超滤膜组件11中超滤，滤过液体经过泵12进入超滤膜浓 縮组件13超滤浓縮，所得到的浓縮物即为产物1-2;超滤膜组件11中未滤过 的液体经过泵14、阀门15、进入截留分子量为100kDa的超滤膜组件16中超 滤，滤过液体经过泵17进入截留分子量不大于5000 Da的超滤膜浓缩组件18 超滤浓縮，所得到的浓縮物即为产物l-3;超滤膜组件16中未滤过的液体经过 泵19、阀门20、进入截留分子量为40kDa的超滤膜组件21中超滤，滤过液体 经过泵22进入截留分子量不大于5000 Da的超滤膜浓縮组件23超滤浓縮，所 得到的浓縮物即为产物1-4;超滤膜组件21中未滤过的液体经过泵24、阀门 25、进入截留分子量为20kDa的超滤膜组件26中超滤，滤过液体经过泵27进 入截留分子量不大于5000 Da的超滤膜浓縮组件28超滤浓縮，所得到的浓縮物 即为产物1-5;超滤膜组件26中未滤过的液体经过泵29进入截留分子量不大 于1000Da的超滤膜浓縮组件30超滤浓縮，所得到的浓縮物即为产物1-6;超 滤膜浓縮组件13、 18、 23、 28、 30所滤过的液体可以通过泵32、阀门33作为 稀释蛋黄原液用水，节能环保。
冷冻干燥所得到的产物。
用现有的脂肪、蛋白质的检测方法，对所得产物l-l、 1-2、 1-3、 1-4、 1-5、 l-6进行检测，检测结果表明
产物l-l:脂肪，最多达318 355 g，用作进一步的分离、提纯得到如不饱 和脂肪酸，抗氧化剂，卵磷脂等多种高附加值脂肪产品。
产物l-2: 400kDa脂蛋白脱辅基蛋白，最多达lllg。
产物l-3:免疫球蛋白，其产率可达95%，纯度超过80%，每升蛋黄原液 可以得到14g。
产物l-4: (x,卩-卵黄蛋白，最多达33g。
产物l-5:高磷蛋白，最多达19g。
产物l-6:微量小分子蛋白质，最多达2.5g。
每升蛋黄原液需用5升去离子水和4.84xl0—5mol的盐酸，由于水在整个工 艺中不断循环利用，因此实际上消耗量很低。整个工艺可为间歇式或连续式生 产，由于膜技术容易放大，因此该工艺适合各种不同规模生产的要求。实施例2是高磷蛋白为主要产品的分离提纯工艺，如图2所示
a. 首先使用水稀释法对蛋黄原液进行稀释，蛋黄原液可由蛋黄蛋白分离器
制得或由蛋黄粉用去离子水配制而成。用去离子水稀释并在混合釜1中混合均
匀，加入0.34M / L的氯化钠调节pH至4.0-7.0，混合釜1中的混合液通过泵2、 阀门3、进入凝结器4中，凝结温度为1 6'C，凝结时间为4 20小时以确保脂 肪的充分凝结，即上清液、蛋黄颗粒状沉淀分层；
b. 将上清液、蛋黄颗粒状沉淀用离心机34离心分离，离心速度为3500 4500rpm，操作时间为20~40分钟；
c. 在混合釜和凝结器35中用5倍体积的去离子水稀释离心所得到的上清 液并混合均匀，加入盐酸调节pH至4.0 7.0，随即在4 。C贮存12小时以确保 脂肪的充分凝结；
d. 取上清液在孔径为0.11 0.22um的微滤膜7中进行微滤处理，滤过的 液体即富含高附加值蛋白质部分，滤除的沉淀即产物2-1;
e. 富含高附加值蛋白质部分经过泵9、阀门10、进入截留分子量为400kDa 的超滤膜组件11中超滤，滤过液体经过泵12进入超滤膜浓縮组件13超滤浓縮， 所得到的浓縮物即为产物2-2;超滤膜组件ll中未滤过的液体经过泵14、阀门 15、进入截留分子量为100kDa的超滤膜组件16中超滤，滤过液体经过泵17 进入截留分子量不大于5000 Da的超滤膜浓縮组件18超滤浓縮，所得到的浓縮 物即为产物2-3;超滤膜组件16中未滤过的液体经过泵19、阀门20、进入截 留分子量为40kDa的超滤膜组件21中超滤，滤过液体经过泵22进入截留分子 量不大于5000 Da的超滤膜浓縮组件23超滤浓縮，所得到的浓縮物即为产物 2-4;超滤膜组件21中未滤过的液体经过泵Da的超滤膜浓縮组件28超滤浓縮， 所得到的浓縮物即为产物1-5;超滤膜组件26中未滤过的液体经过泵29进入 截留分子量不大于1000Da的超滤膜浓縮组件30超滤浓縮，所得到的浓縮物即 为产物2-5;
f. 在混合釜36中向分离得到的蛋黄颗粒状沉淀中加入离子水及0.5 0.7M /L氯化钠，重新溶解至初始溶液浓度，得溶解液；
g. 通过泵37、阀门38用截留分子量为1000~5000Da的超滤膜组件39加 入去离子水渗析溶解液；
h. 用离心机40离心分离，离心速度为4000rpm，操作时间为30分钟，得 到沉淀及上清液，沉淀即产物2-6;i.上清液进入截留分子量不大于5000 Da的超滤膜浓縮组件28超滤浓縮， 所得到的浓縮物即为产物2-7;
超滤膜组件39、超滤膜浓縮组件13、 18、 23、 28、 30所滤过的液体可以 通过泵32、阀门33作为稀释蛋黄原液用水，通过阀门42、 43可作为氯化钠溶 液使用，节能环保。
冷冻干燥所得到的产物。
用现有的脂肪、蛋白质的检测方法，对所得产物2-l、 2-2、 2-3、 2-4、 2-5、 2-6进行检测，检测结果表明
产物2-l:脂肪，最多达2卯g，用作进一步的分离、提纯得到如不饱和脂 肪酸，抗氧化剂，卵磷脂等多种高附加值脂肪产品。
产物2-2: 400kDa脂蛋白脱辅基蛋白，最多达45g。
产物2-3:免疫球蛋白，最多达14g。
产物2-4: a，p-卵黄蛋白，最多达33g。
产物2-5:微量小分子蛋白质，最多达2.5g。
产物2-6:高密度和低密度脂蛋白，最多达90g。
产物2-7:高磷蛋白，每升蛋黄原液可以得到9.1g至13.5g。
每升蛋黄原液需消耗11升去离子水和1.34mol的氯化钠。由于水和氯化钠 在整个工艺中不断循环利用，因此实际上消耗量很低。
实施例3是以高磷蛋白和免疫球蛋白为主要产品分离提纯工艺，如图3所
示
a. 首先使用水稀释法对蛋黄原液进行稀释，蛋黄原液可由蛋黄蛋白分离器 制得或由蛋黄粉用去离子水配制而成。用去离子水稀释并在混合釜1中混合均 匀，加入0.17M / L的氯化钠调节pH至5.0，混合釜1中的混合液通过泵2、 阀门3、进入凝结器4中，凝结温度为3~5°C，凝结时间为11~13小时以确保 脂肪的充分凝结，即上清液、蛋黄颗粒状沉淀分层；
b. 将上清液、蛋黄颗粒状沉淀用离心机34离心分离，离心速度为3800 4200rpm，操作时间为25~35分钟；
c. 在混合釜和凝结器35中用去离子水稀释离心所得到的上清液并混合均 匀，加入硫酸铵制得35%饱和溶液盐析，随即在4 。C储存12小时以确保脂肪 的充分凝结；
d. 经由低速离心机44 (速度为4000rpm，时间为30分钟)离心分离，所得清液返回至混合釜和凝结器35中循环利用，得到的沉淀即富含高附加值蛋白 质部分；
e.富含高附加值蛋白质部分在混合釜45中加入去离子水混合后，通过泵 46、阀门47由超滤膜浓縮组件18后，得浓縮物即产品3-l，滤过水返回至混 合釜45中，循环利用。
对于分离得到的蛋黄颗粒状沉淀处理工艺同实施例2的f i步骤，得产物 3-2、 3-3。
超滤膜组件39、超滤膜浓縮组件28所滤过的液体可以通过泵32、阀门46、 48、 49循环使用，节能环保。 冷冻干燥所得到的产物。
用现有的脂肪、蛋白质的检测方法，对所得产物2-l、 2-2、 2-3、 2-4、 2-5、
2-6进行检测，检测结果表明
产物3-l:免疫球蛋白，最多达14g。
产物3-2:高密度和低密度脂蛋白，最多达90g。
产物3-3:高磷蛋白，每升蛋黄原液可以得到9.1g至13.5g。
每升蛋黄原液需消耗7升去离子水、1.34mol的氯化钠和2.7mol的硫酸铵，
由于水、氯化钠和硫酸铵在整个工艺中不断循环利用，因此实际上消耗量很低。
权利要求
1. 一种鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的分离提纯工艺，其特征在于按如下步骤进行a. 用去离子水稀释蛋黄原液并调节pH至4.0～7.0，凝结至上清液、蛋黄颗粒状沉淀分层；b. 将上清液、蛋黄颗粒状沉淀分离；c. 对分离得到的上清液用微滤或盐析处理，取富含高附加值蛋白质部分；d. 对富含高附加值蛋白质部分超滤膜浓缩处理或用超滤膜过滤与超滤膜浓缩组合处理，取浓缩物。
2. 根据权利要求1所述的鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的分离提纯工艺，其 特征在于所述b步骤是离心分离，离心速度为3500 4500rpm，操作时间为 20~40分钟。
3. 根据权利要求2所述的鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的分离提纯工艺， 其特征在于用去离子水稀释离心所得到的上清液并调节pH至4.0~7.0。
4. 根据权利要求2或3所述的鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的分离提纯工 艺，其特征在于e. 向分离得到的蛋黄颗粒状沉淀中加入去离子水及氯化钠，得溶解液；f. 用超滤膜渗析溶解液；g. 经低速离心处理所得渗析液，得到沉淀及上清液；h. 对上清液超滤膜浓縮处理，取浓縮物。
5. 根据权利要求1或4所述的鸡蛋蛋黄屮高附加值蛋白质的分离提纯工艺， 其特征在于所述a、 f步骤的凝结温度为1 6°C，凝结时间为4 20小时。
6. 根据权利要求1所述的所述的鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的分离提纯 工艺，其特征在于所述c步骤微滤处理的微滤膜孔径为0.11 0.22um、盐析 处理是加入浓度为30 40%饱和浓度的硫酸铵溶液。
7. 根据权利要求1所述的鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的分离提纯工艺， 其特征在于所述d步骤超滤膜过滤的截留分子量分别设置为400kDa、 100 kDa、 40kDa和20kDa;超滤膜浓縮处理的截留分子量不大于5000 Da。
8. 根据权利要求4所述的鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的分离提纯工艺，其 特征在于:所述f步骤的用超滤膜渗析的超滤膜截留分子量为1000Da~5000 Da。
9. 根据权利要求1或4所述的鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的分离提纯工 艺，其特征在于所述a步骤是用浓度为0.34M/L的氯化钠稀释蛋黄原液； 所述e步骤是用0.5M / L~0.7 M / L氯化钠溶液溶解蛋黄颗粒状沉淀。
10. 根据权利要求1或4所述的鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的分离提纯工 艺，其特征在于所述d、 h步骤中超滤膜浓縮处理得到的滤液为a步骤稀释液。
全文摘要
本发明公开一种操作简便、成本低廉、容易放大、产出率高，适应工业化生产的鸡蛋蛋黄中高附加值蛋白质的分离提纯工艺，是按如下步骤进行用去离子水稀释蛋黄原液并调节pH至4.0～7.0，凝结至上清液、蛋黄颗粒状沉淀分层；将上清液、蛋黄颗粒状沉淀分离；对分离得到的上清液用微滤或盐析处理，取富含高附加值蛋白质部分；对富含高附加值蛋白质部分超滤膜浓缩处理或用超滤膜过滤与超滤膜浓缩组合处理，取浓缩物。
文档编号A23J1/09GK101438761SQ20081023004
公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者刘仁辰, 崔占峰, 崔科研, 郑彦杰 申请人:大连英斯特生物技术有限公司