源自颈动脉体的干细胞及其应用的制作方法

专利名称：源自颈动脉体的干细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及源自颈动脉体(CB)的干细胞的分离和表征，涉及用于其增殖和分化 的方法，和涉及其在研究和治疗中，例如在治疗神经变性疾病诸如阿尔茨海默病或帕金森 病中的潜在应用。

背景技术：
分泌神经递质、神经调质或酶的神经或神经旁细胞已被作为药物疗法的备选方 案，用于治疗神经变性疾病。这些细胞已在实验上用于临床研究中，尽管至今只获得有限的 成功。 在二十世纪70年代末和二十世纪80年代初，在大鼠中帕金森病的实验模型中观 察到肾上腺髓质内纹状体内移植的有益作用，所述肾上腺髓质具有多巴胺分泌嗜铬细胞。
在二十世纪80年代研究了神经旁肾上腺髓质自体移植物在帕金森病患者中的治 疗作用。这些移植表现出很小的功能性和早期排斥作用。在二十世纪80年代初，利用啮齿 动物帕金森病的实验模型，观察了获自胎儿黑质的神经细胞移植的有益作用。这些移植物 的功能性和存活优于嗜铬肾上腺细胞移植物的功能性和存活，但是其临床应用由于伦理或 法律标准，仅限于某些国家。而且，在患者的双盲试验中获得的结果不如预期的有利，且在 一些情形中，胎儿细胞的植入产生不理想的运动并发症。正在临床测试使用非人黑质，例如 来自猪的胎儿细胞的异种移植的应用。然而，这种技术具有一些非常重要的局限性，诸如强 免疫学排斥和可能在物种间传递传染性病原体。 颈动脉体是小的化学感受器群并支持位于颈动脉分叉附近的细胞。其由两类细胞 组成I型(血管球)细胞和II型(支持)细胞。球细胞源自神经嵴，所述神经嵴源自神 经外胚层。它们释放多种神经递质，包括乙酰胆碱、ATP、和多巴胺，其触发兴奋性突触后电 位(potentialsin)成突触神经元到达呼吸中心。II型细胞类似神经胶质，表达神经胶质标 记物S100并起支持细胞的作用。 在二十世纪90年代末，开发颈动脉体血管球细胞聚集体，以用于在啮齿动物疾病
模型中治疗帕金森病(Espejo等，1998 ;Neuron (神经元)20， 197-206)。随后，证实该技术在
灵长类模型中可行(L叫uin等，1999 ;Neuron(神经元)22， 743-750)。最后，进行了关于帕
金森病患者的第一次临床试验(Ar jona等，2003 Neurosurgery (神经外科)53， 321-328)，
其中改进通常部分可能地或原则上归因于小量可由移植获得的血管球组织。 细胞治疗法，基于来自干细胞应用的多巴胺能细胞再生能力的原则，代表神经变
性疾病的治疗中的有前途的治疗途径。该领域中研究的主要目标之一是确定能够安全和有
效应用于神经变性疾病治疗的最佳干细胞类型。适合于治疗神经变性疾病的干细胞类型应
该以能够分化为具完全功能性的特定细胞(例如多巴胺能细胞)的能力充分增殖，在神经
组织中整合，和可能尽管不必需，构建与相邻细胞的电化学接触，且最终，其应用不应该受
限于免疫排斥的问题或伦理考虑因素。 就此而论，美国专利申请US 2003/0095956描述未分化神经细胞群，包括获自小 鼠胚胎脑和纹状体和幼年和成年小鼠脑组织的具有GFAP-/巢蛋白+表型的细胞潜在有效用于治疗神经变性疾病，例如帕金森病的应用。然而，这些细胞与由本发明提供的巢蛋白+ 细胞不同，因为后者来自于颈动脉体(且不来自于脑或来自于纹状体)并表现出分化为球 细胞的特性(TH+并对低氧和低血糖灵敏)，即由脑或由纹状体分离的巢蛋白+前体不具有 的特性。而且，国际专利申请WO 00/29549描述培养来自神经嵴的干细胞(NCSC)的方法， 其包括在低氧条件下培养所述NCSC ;所述NCSC潜在有效用于治疗与缺乏神经递质有关的 神经变性疾病，例如帕金森病或阿尔茨海默病。由本发明提供的细胞是与在所述专利申请 W0 00/29549中定义的那些不同的细胞；此外，在本发明中，低氧用于剌激来自CB的细胞的 增殖，因为长期以来已知低氧剌激体内CB生长。 尽管在理解通过细胞治疗法治疗神经变性疾病中已有相当大的进展，但是尚未发 现能够安全和有效地用于治疗所述神经变性疾病的成熟干细胞群。所述细胞群应该提供用 于修复由神经变性疾病引起的损伤的简单和有效方法。因此，仍需要改进现有治疗的功效， 以及搜索能够修复由神经变性疾病引起的损伤的备选方案。 另外，仍需要分离、培养、维持、增殖和分化成熟干细胞以发育意欲用于不同应用 的细胞类型。所述应用可以包括自体干细胞治疗疾病，例如神经变性疾病，心脏病等的应 用。 发明概述 现在，本发明人意外地发现在成人外周神经系统(PNS)，更具体地在颈动脉体 (CB)中存在干细胞。所述成熟干细胞，与可能最终认为的相反，不是球细胞(或I型细胞)， 而是支持细胞或II型细胞。如本说明书中的实施例中所示，所述成熟干细胞具有分裂(增 殖)能力，通过长期细胞分裂的方式更新自身(自更新)，和在某些生理学和实验条件下被 诱导分化为其他特定分化细胞类型的能力(分化)。而且，本发明人开发了用于增殖CB的 体外方法，其使其可能获得能够表达和分泌营养因子，神经递质、神经调质、酶等的细胞聚 集体。使用所述成熟干细胞或由所述增殖方法获得的细胞聚集体的移植可以有效用于临床 实践，具体地用于治疗神经变性疾病。 如已在发明背景中提到地，用于治疗神经变性疾病的关于获自颈动脉体的细胞的 自体移植已被用于治疗变性疾病，因为已知在这些病理学中，一些分子(例如，神经递质、 生长因子等)的缺乏可以通过植入能够表达和分泌所述分子的细胞来补偿。在任何情形 中，获自CB的球细胞的自体移植证明不足以减轻由疾病，诸如阿尔茨海默病或帕金森病引 起的损伤，因此必须改进所述治疗或发现它们的备选方案。以下详述的实验显示由本发明 提供的方法获得的球细胞以及能够获得较大量的它们，使得其可能改进通过自体移植来自 目前存在的CB的细胞的治疗方法学。 因此，在一方面，本发明涉及分离的成熟干细胞，其获自CB，在下文中称 为"本发明的干细胞"，其特征在于对于表型标记物GFAP(胶质细胞原纤维酸性蛋白； EntrezGenelD2670)阳性的和对于表型标记物TH(酪氨酸羟化酶；EntrezGeneID :7054)和 巢蛋白(EntrezGenelD :10763)阴性。 在另一方面，本发明涉及分离的成熟先祖细胞，其源自所述本发明的干细胞，在下 文中称为"本发明的先祖细胞"，其特征在于对于表型标记物巢蛋白阳性。在具体的实施方 案中，本发明的所述先祖细胞对于表型标记物GFAP稍微或弱阳性且对于表型标记物巢蛋 白阳性。在另一个具体的实施方案中，所述本发明的先祖细胞对于表型标记物GFAP阴性且
5对于表型标记物巢蛋白阳性。 在另一方面，本发明涉及成熟分化细胞，其源自任何前述细胞类型(例如，来自本 发明的干细胞或来自本发明的先祖细胞)，在下文中称为"本发明的分化细胞"，其特征在于 对于表型标记物巢蛋白阴性且对于特化标记物阳性；在具体的实施方案中，所述特化标记 物是酪氨酸羟化酶(TH)或平滑肌肌动蛋白(SMA)。 在另一方面，本发明涉及可逆无限增殖化细胞，在下文中称为"本发明的无限增殖
化细胞"，所述细胞是本发明的干细胞、本发明的先祖细胞或本发明的分化细胞。 在另一方面，本发明涉及源自CB的分离的细胞群，在下文中称为"本发明的细胞
群"，其包括选自包括本发明的干细胞、本发明的先祖细胞、本发明的分化细胞、本发明的无
限增殖化细胞，及其组合的组的一组细胞。 在另一方面，本发明涉及用于增殖所述本发明的干细胞或所述本发明的先祖细胞 的方法，其包括在特异于神经嵴的培养基中，低氧条件下，培养所述本发明的干细胞或先祖 细胞。 在另一方面，本发明涉及药物组合物，在下文中称为本发明的药物组合物，其包括 治疗有效量的所述本发明的干细胞、先祖细胞或分化细胞，或其组合，或所述本发明的无限 增殖化细胞，或所述本发明的细胞群，以及药用赋形剂。 在另一方面，本发明涉及所述本发明的干细胞、先祖细胞或分化细胞或其组合，或 所述本发明的无限增殖化细胞，或所述本发明的细胞群开发用于治疗神经变性疾病，例如 治疗阿尔茨海默病，治疗帕金森病，治疗神经系统缺血性损害，治疗神经系统外伤性损害， 或治疗神经系统自体免疫损害的药物组合物的应用。 在另一方面，本发明涉及用于治疗疾病，优选神经变性疾病或由神经系统的缺血 性、外伤性或自体免疫损害引起的疾病的方法，其包括在受所述疾病影响的区域内移植 (植入或移植)治疗有效量的所述本发明的干细胞、先祖细胞或分化细胞或其组合，或所述 本发明的无限增殖化细胞，或所述本发明的细胞群，优选本发明的分化细胞，具体地球细胞 (巢蛋白_/1^+)，优选采用神经球(neurosphere)形式。 在另一方面，本发明涉及用于体外评估针对潜在治疗化合物的细胞反应的方法， 其包括使包含本发明的干细胞，先祖细胞或分化细胞或其组合，和/或本发明的无限增殖 化细胞，和/或本发明的细胞群的培养物与潜在治疗化合物相接触，和评估由所述化合物 对所述培养物中存在的细胞的作用。 在另一方面，本发明涉及所述本发明的干细胞、先祖细胞或分化细胞或其组合，所 述本发明的无限增殖化细胞，所述本发明的细胞群用于产生GDNF的应用。
附图简述

图1 :在成人颈动脉体中由长期低氧诱导的神经发生。由使用BrdU处理和暴露于 长期低氧(10%02)的小鼠分离的颈动脉体的免疫细胞化学分析。版A显示神经元TH+球 细胞质量针对低氧剌激(21天)反应的典型生长。版B显示在低氧7天后增殖细胞中引入 BrdU，和随之标记分化后代。TH染色指示球细胞，使用BrdU的染色指示增殖细胞，和DAPI 荧光显示细胞核。版C:作为动物暴露于长期低氧时间(横坐标)函数的细胞数量和颈动 脉体实质体积的变化(纵坐标)。版D:动物中颈动脉体生长的可逆性恢复到含氧量正常 (21% 02) 1个月。柱形图对在重新含氧量正常的颈动脉体中TH+细胞和双阳性的TH和BrdU细胞数量的量化，和含氧量正常和低氧的值进行比较r含氧量正常中显著不同，P〈0.01 ; #低氧中的显著不同，P < 0. 05)。版E和F以不同的放大倍数显示重新含氧量正常的颈动 脉体切片的实例，其显示约一半球细胞被新细胞代替。比例尺版A、B和E中50微米，和版 F中IO微米。 图2:先前存在的和近期形成的TH+球细胞的神经嵴(NC)来源。版A:利用 loxP-侧邻的Wntl-cre/LacZ的转基因小鼠研究源自颈动脉体中神经嵴的细胞的策略。在 该动物模型中，对于Wntl阳性的细胞，以及它们的所有衍生物，表达半乳糖苷酶，并因此在 用X-gal染色后表现出蓝色沉淀(版B中的箭头)。版C :在版B中所示的相同切片中的 TH，BrdU，和细胞核(DAPI)的免疫组化检测。版D显示组合的两个图像，其显示球细胞，BrdU 阳性和BrdU阴性，来源于神经嵴。由黑色箭头标记的BrdU+， TH-和LacZ+细胞可以代表瞬 时扩增的先祖细胞。比例尺10微米。 图3 :神经球的形成和来自颈动脉体的干细胞的体外多能性。版A :培养10日后形 成的神经球的光视野照片。详细信息显示神经球中出现的典型加厚或神经纤维球(箭头) 的实例。版B显示神经球薄切片的免疫组化分析(光视野在左侧)，显示巢蛋白+先祖在神 经球细胞核中和TH+球细胞在神经纤维球(右)中的存在。版C显示大量生长的(培养20 天)具有2个包含许多分化TH+细胞的长神经纤维球的神经球。版D显示在将神经球重新 涂布到粘附基质(substrate)上后分化为颈动脉体先祖的平滑肌细胞(SMA+)。版E以较高 放大倍数显示D中方框中区域的图像。注意，TH+球细胞存在于集落的中心。比例尺在版 A禾口 E中100微米，版B禾P C中50微米，和版D中lmm。 图4 :来自颈动脉体的干细胞的鉴定。版A :作为时间函数的大鼠颈动脉体神经球 的体外形成。球细胞的出现(TH+)在形成由巢蛋白+先祖组成的神经球的细胞核之后。版 B显示利用HNK-1和p75作为标记物的颈动脉体细胞的流式细胞计数分析。只有双阴性细 胞(选择窗#3)能够在培养物中生长，形成神经球。HNK-1+细胞(窗#1)禾Pp75+(窗ft2)的 分离通常给出阴性结果。版C显示HNK-l+细胞均是TH+球细胞。在版D中，我们可以看到 在含氧量正常、低氧、和重新含氧量正常小鼠颈动脉体中的神经胶质GFAP标记物，和BrdU 的免疫组化检测。用GFAP染色消失和随后出现应该提示由低氧活化的II型神经胶质细胞 是颈动脉体的先祖细胞。比例尺版A和D中50微米，和版C中10微米。
图5 :11型神经胶质细胞针对低氧响应分化为I型神经元细胞。版A :用于测试 能够分化为球细胞的颈动脉体先祖的神经胶质谱系。经历低氧的1oxP-侧邻的GFAP-cre/ LacZ转基因小鼠的颈动脉体的免疫组化分析用于研究来自11型细胞的衍生物，其以1^(^+ 出现。版B :颈动脉体薄切片的X-gal染色，转基因的和低氧的，这说明两种不同细胞中存 在蓝色沉淀(箭头)。版C显示TH，BrdU的和细胞核的免疫组化检测。版D中的两图像重 叠(合并)显示该神经纤维球中两个新形成的球细胞源自1I型GFAP+细胞。比例尺10微 米。 图6 :在体外由干细胞生成的球细胞显示成熟的化学感受器和电生理反应。版A : 与神经球分开的球细胞(TH+)组，和用于记录来自单细胞的儿茶酚胺能分泌物的碳纤维电 极的图。版B :由培养物中球细胞组针对生理学剌激诸如低氧(02部分压力由145mmHg到 15mmHg的变化)或低血糖(由5mM葡萄糖变为0葡萄糖)获得的典型安培计记录。每个安 培计峰值代表单胞吐事件。版C:由(^和葡萄糖水平下降诱导的分泌速度的定量总结。版D显示关于电压门控(gated)的流入(钙)和流出(钾)的典型膜片钳记录，由神经球的神 经纤维球中存在的球细胞记录。版E显示关于钾流量的相应电流/电压曲线，和版F显示关 于在使用胞内铯阻断钾通道后获得的钙流量的膜片钳记录。注意到这些电生理细胞特性， 非常类似于体内成熟球细胞中所述的那些，是在这些化学感受器细胞中调节胞吐作用所必 需的。版A中的比例尺20微米。 图7 :新形成的球细胞体内生成GDNF。进行暴露于长期低氧的杂合GDNF/LacZ小 鼠的颈动脉体的免疫组化分析，以观察新形成的球细胞中GDNF的产生。版A以低放大倍数 显示用X-gal染色的这些颈动脉体之一的薄切片的图像。还指示了颈上神经节(SCG)和颈 内动脉(ICA)的位置。注意到颈动脉体中X-gal沉积的浓度。版B以较高放大倍数显示A 中方框中区域的图像，其具有两处浅蓝色沉淀(箭头)，说明半乳糖苷酶的表达和因此GDNF 的产生。版C:相同切片中TH，BrdU和细胞核的免疫组化检测。版D中图像的重叠(合并) 显示沉淀(箭头)对应于新形成的球细胞中GDNF的产生。比例尺在版A中50微米，和在 版B、C和D中IO微米。 图8 :成人颈动脉体中神经发生模型。上部，具有血管和环绕其的传入神经纤维的 颈动脉体神经纤维球的图像。血管球神经元细胞被II型神经胶质细胞围绕。还显示由低 氧激活的瞬时扩增先祖。下部，在低氧重新含氧量正常周期过程中在颈动脉体中发生的细 胞事件的假设顺序。 图9 :由颈动脉体的GFAP+干细胞开始的神经球形成和多能性。(A)左由loxP-侧 邻的GFAP-cre/LacZ小鼠的颈动脉体散布的GFAP+， X_gal+细胞产生的神经球的光视野照 片。右TH+细胞的免疫细胞化学鉴定(箭头)。(B)中的放大图像显示TH+细胞中X-gal 沉积物的位置(箭头)。(C)左来自在粘附基质上培养的GFAP+， X-gal+细胞的神经球的 光视野照片。右TH+细胞的免疫细胞化学鉴定(箭头)。(D)中的放大图像显示SMA+平滑 肌细胞中X-gal沉积物的定位(箭头)。比例尺在版(A)中10微米，在版(B)和(D)中5 微米，和在版(C)中50微米。 图10 :在体内暴露于低氧/重新含氧量正常过程中颈动脉体的先祖的定量分析。 (A-C)大鼠颈动脉体中GFAP+，巢蛋白+细胞(箭头)，和GFAP薄，巢蛋白+的代表性实例， 其含氧量正常的或暴露于低氧(16天)/重新含氧量正常(18天)周期。比例尺在版(A) 和(C)中5微米，和在(B)中IO微米。(D)显示实验过程中颈动脉体的多种细胞类型的量 的变化的定量图表。为了 GFAP+和/或巢蛋白+细胞的计数，分散颈动脉体并固定细胞以 便在培养物中涂布后立即进行免疫细胞化学分析。该程序是必要的，因为II型GFAP+细胞 在组织切片中很难识别，且此外，使用巢蛋白的染色也在分散的细胞中更好地工作。注意到 处于低氧中的GFAP+细胞的明显减少，和巢蛋白+细胞的平行增多。在重新含氧量正常过 程中，发生相反的现象(重获GFAP+细胞群和减少巢蛋白+细胞数量)。(E)低氧过程中颈 动脉体GFAP+或巢蛋白+先祖的增殖。基于三个独立实验计算的细胞数量的平均值是含氧 量正常(111个GFAP+细胞的中3. 6% GFAP+，BrdU+ ;69个巢蛋白+细胞中5. 7%巢蛋白+， BrdU+)，低氧6天(30个GFAP+细胞中29. 4% GFAP+，BrdU+ ;247个巢蛋白+细胞中35. 6% 巢蛋白+， BrdU+)，低氧16天(25个GFAP+细胞中64. 3 % GFAP+， BrdU+ ;248个巢蛋白+细 胞中57. 8%巢蛋白+， BrdU+)。
图11 :来自人颈动脉体的神经球形成。版(A):在解剖颈动脉体前人颈动脉分叉
8的光视野照片。版(B)显示解剖后的人颈动脉体。版(C)也以光视野显示在酶处理产生细 胞分散前的人颈动脉体的多种部分。版(D)显示由培养IO天后的人颈动脉体的分散细胞 获得的2个神经球的光视野照片。注意到神经球表面上存在加厚或神经纤维球(箭头)， 形态学和功能特征非常类似于先前啮齿动物图中所述的那些。版(E)通过针对酪氨酸羟化 酶(TH)的免疫细胞化学分析，显示上述神经纤维球是颈动脉体的有效球细胞，由神经球的 先祖分化。所有细胞的细胞核用DAPI染色，以更加清楚。 图12 :神经球中存在的细胞能够体外生成GDNF。版A显示由GDNF/LacZ小鼠获得 的神经球的光视野照片，所述小鼠由培养10天和用X-gal染色获得，以验证神经球的细胞 中受GDNF启动子控制的P-半乳糖苷酶表达；黑色箭头表示蓝色沉积物的定位，这说明该 酶的表达。版B表示神经球薄切片的免疫组化分析，其显示神经纤维球中TH+球细胞的存 在及其定位。版C中所示的两图像合并(重叠)显示X-gal蓝色沉积物的出现如何发生在 TH+球细胞的位置，这证明在这些细胞中获得GDNF体外表达的可能性。
发明详述 本发明一般涉及获自颈动脉体(CB)的成熟干细胞(本发明的干细胞)，源自所述 成熟干细胞的先祖细胞(本发明的先祖细胞)，源自所述本发明的干细胞或先祖细胞的分 化细胞(本发明的分化细胞)，包含一组所述细胞的分离的细胞群(本发明的细胞群)，它 们的增殖方法(本发明的增殖方法)，和它们的应用，包括它们在治疗法，具体地在治疗神 经变性疾病(例如，阿尔茨海默病，帕金森病，等)，或由神经系统的缺血性，外伤性或自体 免疫损害引起的疾病中的应用。
定义 为了更好地理解本说明书，本发明上下文中使用的一些术语和表述的含义解释如 下。另外的定义会在需要时与说明一起包括进来。 术语"受试者"用于本文中时，指动物，优选哺乳动物，包括非灵长类动物(例如， 牛、猪、马、猫、狗、大鼠、小鼠，等)和灵长类动物(例如，猴、人，等)。在具体的实施方案中， 所述受试者是人。 术语"成熟干细胞"指在分化的组织中存在的细胞，其表现出干细胞特征。"成熟" 意指胚胎后的。成熟干细胞是分化组织中存在的并表现出增殖、自我更新和分化为一种或 多种细胞类型的能力的未分化细胞。该术语意指干细胞由处于胚胎期后的生长期的动物组 织或器官中分离的。本发明的成熟干细胞存在于受试者的CB中。该细胞可以优选分离自哺 乳动物，诸如人。成熟干细胞与胚胎干细胞不同，其通过其来源，胚泡的内细胞群定义。按 照本发明的成熟干细胞可以由任何非胚胎组织分离，并应该包括新生儿、儿童、青年和成年 患者。通常，本发明的干细胞应该由非新生哺乳动物，和更优选由非新生人分离。
术语"衍生的先祖细胞"(本说明书中也称为瞬时扩增子，瞬时扩增细胞，或中间先 祖)，在该说明书中，表示扩增细胞，其由本发明的干细胞产生，获自CB，具有分化为分化组 织细胞的能力，并且比干细胞更特化。该术语指具有形成比其本身更分化的后代的能力的 细胞。例如，该术语可以指未分化细胞或分化为达不到终末分化程度的细胞，其能够增殖和 产生更多具有生成大量母细胞能力的先祖细胞，所述母细胞可以继而生成分化的或可分化 的子细胞。按照本发明的先祖细胞比真正的干细胞更加分化，并且已经略微限制真正干细 胞的多能能力。术语"衍生的分化或特化细胞"在本说明书中意指这样的细胞，其最终特化
9以在组织中执行定义的功能，其由干细胞或衍生的先祖产生，且具有很少或无增殖或分化 的能力。术语"分化"指形成表达标记物的细胞，所述标记物已知与更特化且更接近成为终 末分化细胞的细胞相关，所述终末分化细胞不能进一步分裂或分化。 术语"可逆无限增殖化细胞"涉及这样的细胞，其在给定时刻，处于无限增殖化状
态但可以在稍后时间利用逆转无限增殖化过程转变为非无限增殖化状态。 术语"特化或分化标记物"在本说明书中意指鉴定"分化或特化细胞"和将其与干
细胞和先祖细胞区分开的表型标记物。 本发明的细胞对于某些表型标记物阳性和对于其他阴性。所谓"阳性"，意指标记 物在细胞中表达。为了被认为为表达，标记物必须以可检测的水平存在。所谓"可检测的水 平"意指标记物可以利用标准实验室方法学诸如PCR、印迹或FACS分析检测。认为基因被本 发明群中的细胞表达，条件是表达可以在30个PCR周期后被合理的检测到，这对应于细胞 中至少约100个拷贝/细胞的表达水平。术语"表达(express)"和"表达(expression)" 具有相应的含义。在低于该阈值的表达水平，认为标记物不表达，且然后将该细胞描述为对 该标记物阴性。认为标记物不被本发明的细胞表达，条件是表达不能以约10-20个拷贝/ 细胞的水平被合理地检测到。在这些阳性和阴性水平之间，细胞可以对特定标记物弱阳性， 例如，按照本发明的先祖细胞对GFAP(士)弱阳性且对巢蛋白阳性(+)。本发明细胞中标记 物表达水平和另一种细胞，诸如例如胚胎干细胞中相同标记物表达水平之间的比较可以优 选地通过比较由相同物种分离的两种细胞类型进行。优选，该物种是哺乳动物，和更优选， 该物种是人。所述比较可以便利地利用反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)实验进行。
认为干细胞群表达标记物，条件是该群中至少约70%的细胞显示出可检测的标记 物表达。在其他方面，该群中至少约80%，至少约90%或至少约95%或至少约97%或至少 约98%或更多细胞显示出可检测的标记物表达。在某些方面，该群的至少约99%或100% 细胞显示出可检测的标记物表达。表达可以通过使用RT-PCR实验，通过荧光活化的细胞分 选(FACS)，或通过使用特异性抗体的免疫细胞化学检测。应该理解该列表仅通过举例提供， 且不意欲进行限制。 认为干细胞群对特定标记物阴性，条件是分离的干细胞群的至少约70%细胞不 表现出可检测的标记物表达。在其他实施方案中，群中至少约80%，至少约90%或至少约 95%或至少约97%或至少约98%或至少约99%或100%细胞不应该表现出任何可检测的 标记物表达。此外，缺少可检测的表达通过使用RT-PCR实验，利用FACS，或利用免疫细胞化 学证明。 术语"分离的"表示其所指的细胞或细胞群不处于其天然环境中。所述细胞或细 胞群与周围组织充分分离。在一些实施方案中，细胞或细胞群与周围组织充分分离，条件 是该样品包含至少约75%，85%，90%，95%或更多按照本发明的干细胞、先祖细胞、分化细 胞、或无限增殖化细胞。换言之，样品与周围组织充分分离，条件是样品包含少于约25%， 在一些实施方案中少于约15%，和在一些实施方案中少于约5%的除本发明的细胞以外的 物质。所述百分比数值指重量百分比。该术语包括由其来源的生物体中移出，并存在于培 养物中的细胞。该术语还包括由其来源的生物体移出，并随后重新插入到生物体中的细胞。 含有重新插入的细胞的生物体可以是与由其移出细胞的生物体相同的生物体，或其可以是 不同的生物体。
术语"关于神经嵴_来源的细胞的特定培养基"(本说明书中也称为"NC培养基") 在本说明书中意指含有血清和一系列促进源自神经嵴(NC)的外周神经系统(PNS)先祖生 长的营养因子的培养基。合适的营养因子的实例记述在本文中。 术语"具有生物活性的分子"在本说明书中意指对细胞组的生物学具有定义的影 响，例如影响它们的存活或它们的增殖或分化行为的分子。 术语"治疗有效量的细胞"在本说明书中意指在通过细胞治疗法治疗特殊疾病中 获得有益效果所必需的细胞量。 术语"混合的培养物"在本说明书中意指相同板上存在的多种不同细胞类型的培 养物，且其可以或可以不彼此来源。 术语"纯培养物"在本说明书中意指仅有一种细胞类型存在，或非常(充分)富含 仅一种细胞类型的培养物。实践中，获得100%纯培养物在技术上具有挑战性，尽管可以获 得非常富集的培养物。在具体的实施方案中，本发明的干细胞[6 八 +/^-/巢蛋白_]或本 发明的分化细胞[TH+/巢蛋白-]的超过70 % ， 80 % ， 90 % ， 95 %或更高纯度的培养物可以通 过使用特异性荧光标记物的流式细胞计数分离来获得。 术语"本发明的细胞群"指细胞制剂，所述制剂除所述细胞外，可以包括非细胞成 分，诸如细胞培养基，例如蛋白质、氨基酸、核酸、核苷酸、辅酶、抗氧化齐U、金属等。此外，细 胞组合物可以具有不影响细胞成分生长或生存，但用于将处于特殊形式的细胞提供，例如 为用于包囊作用的聚合物基质或作为药物制剂的成分。 术语"细胞谱系的作图"在本说明书中意指在标记先祖细胞意义上追踪细胞谱系， 以便随后追踪该标记和研究源自所述先祖细胞且因此被标记的细胞。"神经变性疾病"是这样的病理学，其以已知或未知原因影响神经系统(通常，中 枢神经系统)并涉及由凋亡或坏死引起的神经元进行性死亡；所述神经变性疾病的说明 性非限制性实例包括帕金森病、阿尔茨海默病、肌萎縮性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)等。 神经系统的"缺血性损害"是由缺乏血液流动到脑的一部分产生的损害，其归因于 向所述区域提供血液的动脉的阻塞。 神经系统的"外伤性损害"的特征在于神经元或其部分(例如，轴突)的破坏，其 归因于例如机械损伤(例如，由交通事故引起的外伤性骨髓损害)。 神经系统的"免疫学损害"(例如多发性硬化等)由异常剌激免疫系统后的自体免 疫反应引起。 用于本文中时，术语"低氧"定义为意指这样的条件，其中哺乳动物的一种或多种 组织中的氧降低低于生理学水平，例如到低于最佳水平。低氧溶液的实例是用5% 0)2和 95% N2充气以达到约15mmHg的02压力的溶液。 用于本文中时，术语"特异于神经嵴的培养基"意指这样的培养基，其容许该类细 胞的生长。术语"培养基(culture medium)"或"培养基(medium)"是本领域中公认的，且公 知指用于培养活细胞的任何物质或制剂。最基本的培养基通常包括四种基本的化学基团 氨基酸、碳水化合物、无机盐、和维生素。基本培养基通常起更复杂培养基的基础的作用，向 其中添加补充剂诸如血清、缓冲液、生长因子、脂质等。基本培养基的实例包括，但不限于， Eagles基本培养基，极限必需培养基，Dulbecco改良Eagle培养基，培养基199，营养混合物Ham， s F-10和Ham' s F_12， McCoy， s 5A， Dulbecco， s MEM/F-I 2， RPMI 1640，和Iscove 改良Dulbecco培养基(MDM)。特异于神经嵴的培养基的实例是D_MEM:F_12 (GibcoBRL，格 兰德岛市，NY)，其含有15%鸡胚提取物(如Stemple和Anderson, 1992 ;Cell(细胞)71， 973-985中所述制备)，1% N2补充剂(Gibco) ， 2% B27补充剂(Gibco) ， 1 %青霉素/链霉 素(Cambrex， Verviers，比利时)，20ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) (R&D Systems (R&D系统)，Minneapolis, MN) ， 20ng/ml人重组胰岛素样生长因子_I (IGF-I) (R&DSystems (R&D系统))，和20ng/ml包含的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胰岛素样 生长因子-I(IGF-I)和人重组表皮生长因子(EGF)(R&D Systems (R&D系统))。在该培养 基中，细胞可以在具有受控的0)2水平的温育器(例如，Thermo Electron Corp(热电子公 司).，沃尔瑟姆，MA)中，在3%的固定氧水平和在37t:下培养。 贯穿本说明书和权利要求，词语"包括"及其变体不意欲排除其他技术特征、添加 剂、成分或步骤。对于本领域中的技术人员，本发明的其他目的、优势和特征应该清楚，其部 分来自于本说明书且部分来自于本发明的实践应用。
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輛日月白奸麵 在一方面，本发明涉及分离的成熟干细胞，其源自CB(本发明的干细胞)，其特征
在于对于表型标记物GFAP(胶质细胞原纤维酸性蛋白)阳性和对于表型标记物TH和巢蛋
白阴性。因此，所述本发明的干细胞获自08并具有6 八 +/1^-/巢蛋白-表型。 定义这些来自颈动脉体的干细胞的具体特性可以通过下列特征总结-如已经提到地，它们是对于神经胶质GFAP标记物阳性和对于标记物TH和巢蛋白
阴性的细胞。-它们随着围绕I型细胞的神经纤维球的细胞延长(通常1或2个)体内发生，其 与这两种细胞类型的膜密切相关。-它们响应于连续的低氧剌激而失去它们剩余的表型(表达GFAP和延长)。
-在失去它们剩余的表型时，它们转变为更圆的中间先祖，其对于巢蛋白阳性且对 于GFAP或TH阴性。-它们能够分化为颈动脉体的成熟球细胞，其对TH阳性，且能够响应生理学剌激 分泌儿茶酚胺诸如多巴胺和营养因子诸如GDNF。因此，通过诱导它们的分化，它们可以用作 生成GDNF的来源。-它们能够在低氧剌激消失时体内重获休眠表型(表达GFAP和延长)。-它们能够增殖，体外生长，形成神经球或巢蛋白阳性先祖和TH阳性球细胞的集落。-它们可以整合到神经组织中。-它们可以形成与邻近细胞的化学或电化学接触。-它们在注射到患者中时可能不诱导免疫应答，如果它们获自所提到的患者的CB 的话。-除对于神经胶质GFAP标记物阳性和对于标记物TH和巢蛋白阴性外，它们是特 异性的，这归因于它们的定位(CB)和其他功能特性诸如与CB球细胞共同定位，对低氧反应 性，体外生长形成神经球或巢蛋白阳性先祖和TH阳性球细胞集落的能力，等。
GFAP标记物是脑神经胶质细胞、外周神经胶质细胞和定位在多种器官中"类似于"神经胶质细胞的细胞(例如，颈动脉体的II型细胞)所特有的。GFAP是细胞骨架蛋白，其准确功能未知。 标记物巢蛋白是中枢神经系统，外周神经系统中和"副神经"器官，诸如CB中若干不同类型的神经先祖所特有的。巢蛋白的功能不确定已知。 TH是若干不同儿茶酚胺能细胞亚型的特异性标记物。TH的功能是起第一反应(酪氨酸的羟基化作用)的催化剂的作用，所述第一反应在儿茶酚胺组(多巴胺，去甲肾上腺素或肾上腺素)中将氨基酸酪氨酸转化为神经递质。 最初，本发明的干细胞通过方法诸如实施例2中所述的方法鉴定。该方法形成本发明的一个方面。简言之，来自暴露于低氧的成年大鼠的CB通过酶分散，并将细胞涂布处于非粘附处理的培养板上的NC培养基中，由此诱导在漂浮条件下的生长和神经球的生成。神经球是源自单细胞的集落(克隆生长)，所述单细胞具有增殖和自我更新的特征(它们是干细胞)。在分散颈动脉体和将其细胞置于培养基中时，只有干细胞(总细胞的小群)具有形成神经球的能力。其次，通过标准免疫细胞化学流程分析所述神经球中存在的多种细胞，所述标准免疫细胞化学流程包括培养所述神经球的薄切片，所述神经球的薄切片预先用具有初次抗体(抗GFAP，抗TH和抗巢蛋白)的封闭溶液，并随后用相应二次抗体封闭，并最后用DAPI(染色细胞核)对比染色。获得的结果揭示由经历低氧的大鼠的CB获得的细胞的存在，其具有6 八 +/1^-/巢蛋白-表型。然后分析这些细胞，以观察它们增殖、自我更新和分化的能力(实施例2)。另外的测试揭示所述来自CB的干细胞是神经胶质类型(II型)的支持细胞(实施例3)。 其次，将相同方法应用于由人类供体分离的颈动脉体，从而证实在该物种中来自颈动脉体的干细胞的存在。该方法形成本发明的另一方面。如实施例6中所述，对来自心脏供体的两个颈动脉分叉应用该方法使得可能在培养物中获得处于神经球形式的神经先祖，其在其神经纤维球形式的表面上具有加厚(thickening)。神经球的免疫细胞化学分析揭示加厚是TH+球细胞的有效组，证实人中存在特异于颈动脉体的干细胞并证明它们体外分化为球细胞的能力。 基于由本说明书提供的信息，本发明的干细胞可以通过本领域中任何技术人员已知的常规方法从受试者的CB中获得。在具体的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，诸如啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)或灵长类动物(例如，人)。 本发明的干细胞的表型标记物可以通过任何合适的技术鉴定，通常基于阳性/阴性选择。在具体的实施方案中，抗体，优选单克隆抗体，可以用于所述表型标记物，所述表型标记物在本发明的干细胞中的存在或缺乏必须以基于其免疫细胞化学特征表征本发明的干细胞为目的来验证，尽管也可以使用本领域中技术人员已知的其他常规技术，例如，RT-PCR。因此，在具体的实施方案，针对GFAP的单克隆抗体用于分析所述标记物在所选细胞中的存在，和针对TH和巢蛋白的单克隆抗体用于分析所述标记物在所述选择细胞中的存在。那些具有6 八 +/^-/巢蛋白-表型，源自CB并具有增殖、自我更新和分化为其他细胞类型的能力的细胞构成本发明的干细胞。所述单克隆抗体是可商购的或可以通过常规方法由本领域中技术人员获得。关于材料和方法的部分描述一种执行不同类型细胞免疫细胞化学表征的方法。
本发明的干细胞可以在体外增殖，因为它们具有增殖和自我更新的能力。简言之，所述本发明的干细胞，一旦分离和表征，可以在合适的培养基中维持并体外增殖。在具体的实施方案中，本发明的干细胞在非粘附表面上生长，从而允许形成神经球。而且，在具体的实施方案中，培养基(先前定义为NC培养基)包括至少一种生长因子，其选自成纤维细胞生长因子(FGF)，包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)，胰岛素样生长因子-I (IGF-I)，及其组合，优选浓度为10-40ng/ml，优选20ng/ml的FGF。备选地，培养基可以除FGF外，包含其他生长因子诸如EGF和/或IGF-I，(它们中任一种的)浓度为10-40ng/ml，优选20ng/ml。所述生长因子(FGF，EGF和IGF-I)可以是天然的或重组的，或备选地，还可以使用本领域中技术人员公知的所述生长因子(FGF， EGF和IGF-I)的功能变体。在另一个具体的实施方案中，培养基包含作为主要营养源的鸡胚提取物，其浓度是总培养基重量的至少5%，优选5% _20%，和甚至更优选15%。而且，有利地，为了防止污染的目的，培养基包含抗生素，例如，青霉素和/或链霉素，其典型的浓度为相对于总培养基重量的0. 5-2%。 如果需要，本发明的干细胞可以利用适合于克隆细胞群的方法克隆增殖(实施例3)。备选地，可以收集本发明的干细胞群并将该细胞涂布单独的板上(或多孔板的孔中)。在另一个备选的实施方案中，可以以随机关系将所述干细胞亚克隆到多孔板上，以协助将单细胞置于各个孔中的操作(例如，约O. l-约l细胞/孔)。当然，本发明的干细胞可以以低密度克隆(例如，在培养皿中)并可以利用合适的装置(例如，克隆环)从其他细胞中分离。克隆群可以在合适的培养基，例如NC培养基中增殖。 本发明的这个方面由此提供分离的干细胞群，其中所述细胞群主要仅包括本发明的细胞，即该细胞群是纯的。在许多方面，所述细胞群包括本发明的干细胞的至少约70%(在其他方面，至少75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99. 5%，99. 9%或100% )。 可以培养分离的细胞直到可以评估它们的发育表型。本发明的干细胞具有分化为不同细胞类型的能力，诸如分化为本发明的先祖细胞(巢蛋白+)，例如对于GFAP稍微或弱阳性和对于巢蛋白阳性的细胞(GFAP士/巢蛋白+)，或对于GFAP阴性和对于巢蛋白阳性的细胞(GFAP-/巢蛋白+)，以及本发明的分化细胞(巢蛋白_/特化标记物+)，例如TH+(球细胞)，SMA+(平滑肌细胞)等。(参见，例如，实施例2)。本发明的干细胞分化为一种或多种细胞类型的能力可以由本领域中的技术人员通过常规方法测试。 如果需要，本发明的干细胞可以通过任何常规方法来遗传修饰，所述方法包括，通过例证而非限制，在其基因组中的转基因、缺失或插入方法等。用于获得稳定的和条件性无限增殖化细胞的一种可能方法基于通过分别使用质粒pEF321T或pRITA的脂转染稳定转染本发明的干细胞，如以下关于本发明的无限增殖化细胞所讨论的。 预期本发明的干细胞在获自受体患者时，也不会在将细胞群注射到患者中时而引发免疫应答。当使用供体获得干细胞时，可以通过使供体的单元型与受体的那些相匹配来最小化免疫应答。在本发明的某些方面中，如果分离的干细胞群中至少约70%的细胞不引发免疫应答，那么认为干细胞群不引发免疫应答。在一些实施方案中，分离的干细胞群中至少约80 % ，至少约90 %或至少约95 % ， 99 %或更多的细胞不引发免疫应答。优选地，本发明的细胞不引发抗体介导的免疫应答和/或不引发体液免疫应答和/或不引发混合的淋巴细胞免疫应答。 本领域中的技术人员应该理解，本发明的细胞引发免疫应答的能力可以以多种方式测试。仅通过例证的方式，可能通过与来自与干细胞供体不同的个体的T细胞一起培养本发明的细胞来确定本发明的干细胞是否引发免疫应答。对于能够诱导免疫应答的细胞，所述细胞的培养会导致T细胞增殖的剌激。用于测试该能力的测定法是技术熟练的读者公知的。 在一个实施方案中，如果在与来自与干细胞供体不同的个体的T细胞一起温育分离的干细胞后诱导的IL2， IFNX ， TNFP ， IL4， IL5， ILIO， IL3， TNF a和TGFP中一种或多种的表达水平是在与由非匹配个体分离的终末分化细胞一起温育等价T细胞群后IL2，IFNA ， TNFP ， IL4， IL5， ILIO， IL3， TNF a禾PTGFP中的一种或多种的表达水平的小于约50 % ，优选小于约40 % ，约30 % ，约25 % ，约20 %或约10 %或更低，那么认为本发明的细胞
不引发免疫应答。 輛日月白備目麵 在另一方面，本发明涉及分离的成熟先祖细胞，其源自所述的本发明的干细胞，在下文中称为"本发明的先祖细胞"，其特征在于其对于表型标记物巢蛋白阳性；即本发明的先祖细胞源自本发明的干细胞，即来自CB，并具有巢蛋白+表型。在具体的实施方案中，所述本发明的先祖细胞对于表型标记物GFAP稍微或弱阳性和对于表型标记物巢蛋白阳性[GFAP土/巢蛋白+]，而在另一个具体的实施方案中，所述本发明的先祖细胞对于表型标记物GFAP阴性和对于表型标记物巢蛋白阳性[GFAP-/巢蛋白+]。存在这样的GFAPV巢蛋白+细胞，其是神经先祖但具有与CB中发现的那些不同的来源和特性(关于它们分化的细胞类型)，诸如美国专利申请US 2003/0095956中所述的源自脑和纹状体的GFAP-/巢蛋白+细胞，其不仅在来源(脑或纹状体对比CB)上与本发明的先祖细胞不同，而且，此外它们缺少分化为球细胞的特性(TH+和对低氧和低血糖灵敏)，即由本发明的先祖细胞表现出的特性。 因此，表征这些细胞的特性可以总结如下-它们是对于标记物巢蛋白阳性和通常对于标记物GFAP和TH阴性的细胞，尽管它
们中的一些可以是对于表型GFAP标记物弱阳性，这取决于它们发育的时刻。-它们是圆形的，或具有非常细的延长，且它们与I型细胞的神经纤维球一起位于体内。-它们是针对连续低氧剌激增殖，并因此数量增加的细胞。
-它们源自颈动脉体的GFAP阳性干细胞。-它们能够分化为颈动脉体的成熟球细胞，对于TH阳性，且能够响应生理学剌激来分泌儿茶酚胺诸如多巴胺和营养因子诸如GDNF。因此，通过诱导它们的分化，它们可以用作产生GDNF的来源。-它们是在低氧剌激消失时，能够转化为颈动脉体的GFAP阳性休眠干细胞的细胞。-它们是能够体外生长形成神经球或巢蛋白阳性先祖和TH阳性球细胞的集落的细胞。 如已经提到地，在具体的实施方案中，本发明的先祖细胞对于表型标记物GFAP稍微或弱阳性和对于表型标记物巢蛋白阳性，即其具有GFAP+/巢蛋白+表型；这似乎归因于 这样的事实，即在其他可能的原因中，当本发明的干细胞[GFAP+/巢蛋白_]分化为本发明 的先祖细胞时，其获得巢蛋白+表型并失去GFAP表型，所以，根据它们的发育时刻，可以观 察到本发明的先祖细胞具有对GFAP稍微或弱阳性的表型。 本发明的先祖细胞可以通过方法诸如实施例2中所述的方法获得。该方法形成本 发明的一个方面。简言之，将暴露于低氧的成年大鼠的CB酶促分散，并将细胞涂布在用非 粘附处理的培养板中的NC培养基上，以获得神经球。所述具有抗GFAP和抗巢蛋白抗体的 神经球薄切片的免疫细胞化学分析和利用DAPI的对比染色揭示在获自经历低氧的大鼠CB 的干细胞(本发明的先祖细胞)的所述神经球中部核心中存在具有6 八 +/巢蛋白+表型 的细胞和具有GFAP-/巢蛋白+表型的细胞。然后分析这些细胞，以观察它们增殖、自我更 新和分化的能力(实施例2)。 基于本说明书提供的信息，本发明的先祖细胞可以通过本领域中任何技术人员已 知的常规方法，从受试者的CB，或从受试者CB的干细胞中获得。在具体的实施方案中，所述 受试者是哺乳动物，诸如啮齿动物(例如大鼠或小鼠)或灵长类动物(例如人)。
本发明的先祖细胞的表型标记物可以通过任何合适的技术，诸如已经提到的那些 鉴定。在具体的实施方案中，可能将抗体，优选单克隆抗体，用于所述表型标记物，其在本发 明的先祖细胞中的存在或缺乏必须以表征本发明的先祖细胞为目的，通过它们的免疫细胞 化学特征的方式来验证，尽管也可以使用本领域中技术人员已知的其他常规技术。因此，在 具体是实施方案中，将针对GFAP的单克隆抗体用于分析所述标记物在所选细胞中的存在 (少量)或缺乏，且针对巢蛋白的单克隆抗体用于分析所述标记物在所述选择的细胞中的 存在。那些具有6 八 +/巢蛋白+或6 八 -/巢蛋白+表型，诸如来自CB，或来自CB的干细 胞，并具有增殖、自我更新和分化为其他细胞类型的能力的细胞组成本发明的先祖细胞。所 述单克隆抗体是可商购的或可以由本领域中的技术人员通过常规方法获得。关于材料和方 法的部分记述执行不同细胞类型免疫细胞化学表征的方式。 本发明的先祖细胞可以在体外增殖，因为它们具有增殖和自我更新的能力。简言 之，所述本发明的先祖细胞，一旦分离和表征，可以在合适的培养基中维持并体外增殖。在 具体的实施方案中，本发明的先祖细胞在非粘附表面上生长，从而允许形成神经球。而且， 在具体的实施方案中，培养基(先前定义为NC培养基)包括至少一种生长因子，其选自 FGF，包括bFGF，EGF，IGF-I及其组合，优选FGF，浓度为10-40ng/ml，优选20ng/ml的。备选 地，培养基可以除FGF外，包含EGF和/或IGF-I，(它们每一种的)浓度为10-40ng/ml，优 选20ng/ml。所述生长因子(FGF，EGF和IGF-I)可以是天然的或重组的，或备选地，还可以 使用本领域中技术人员公知的所述生长因子(FGF，EGF和IGF-I)的功能变体。在另一个具 体的实施方案中，培养基包含作为主要营养源的鸡胚提取物，其浓度是总培养基重量的至 少5 % ，优选5 % -20 % ，和甚至更优选15 % 。而且，有利地，为了防止污染的目的，培养基包 含抗生素，例如，青霉素和/或链霉素，其典型的浓度为相对于总培养基重量的0. 5-2%。
如果需要，本发明的先祖细胞可以利用适合于克隆细胞群的方法克隆增殖。简言 之，可以机械地或通过酶将在原代培养物中获得的神经球解离为单细胞，且在非粘附条件 下，在NC培养基中再培养这些细胞，以获得它们的二次增殖。 本发明的先祖细胞具有分化为不同细胞类型，诸如本发明的分化细胞(巢蛋白_/特化标记物+)，例如巢蛋白VTH+细胞(球细胞)，巢蛋白_/3區+细胞(平滑肌细胞)，等的能力(参见，例如，实施例2)。本发明的干细胞分化为一种或多种细胞类型的能力可以通过本领域中技术人员已知的常规方法测试。 如果需要，本发明的先祖细胞可以通过任何常规方法来遗传修饰，所述方法包括，例证而非限制性地，在其基因组中的转基因、缺失或插入方法等。用于获得稳定的和条件性无限增殖化细胞的一种可能方法基于通过分别使用质粒pEF321T或pRITA的脂转染稳定转染本发明的先祖细胞，如以下关于本发明的无限增殖化细胞所讨论的。
輛日膨分德朐' 在另一方面，本发明涉及成熟的分化细胞，其源自前述细胞类型中任一种(即，来自本发明的干细胞或来自本发明的先祖细胞)，在下文中称为"本发明的分化细胞"，其特征在于其对于表型标记物巢蛋白阴性和对于特化标记物(MdeE)阳性；S卩，本发明的分化细胞源自本发明的干细胞或源自本发明的先祖细胞，即来自CB，且具有巢蛋白-/MdeE+表型。
再一次，将表征这些细胞的特性概述如 下-它们是对于标记物TH阳性和对于标记物GFAP和巢蛋白阴性的细胞。
-它们是圆形的且它们集合在一起形成神经纤维球。-它们通过响应于连续低氧剌激，由干细胞(GFAP+)开始并经过颈动脉体的先祖细胞(巢蛋白+)的分化产生。-它们是终末分化细胞，其具有电压门控(gated)的钙和钾通道，并响应于生理学剌激诸如低氧或低血糖分泌多巴胺型神经递质。
-它们执行颈动脉体的主要化学感受器功能。
-它们能够产生和分泌GDNF型营养因子。
因此，它们可以用于产生GDNF。-它们通过由巢蛋白阳性先祖开始的分化，在体外以神经球表面上的神经纤维球的形式出现。 本发明的分化细胞可以通过这样的方法获得，所述方法包括在允许所述细胞分化为合乎需要的分化细胞的条件下培养本发明的干细胞和/或本发明的先祖细胞。基于本说明书提供的信息，本发明的分化细胞可以通过本领域中技术人员已知的常规方法，由受试者的CB，或由CB的干细胞，或由源自所述CB的干细胞的先祖细胞获得。在具体的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，诸如啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)或灵长类动物(例如，人)。本发明的分化细胞的表型标记物可以通过任何合适的技术，诸如已经提到的那些，例如，使用针对所述表型标记物的单克隆抗体鉴定，所述表型标记物在本发明的分化细胞中的存在或缺乏必须验证，尽管也可以使用本领域中技术人员已知的其他常规技术。
在具体的实施方案中，所述MdeE是酪氨酸羟化酶(TH)且所述本发明的分化细胞具有巢蛋白VTH+表型(球细胞)。简言之，所述分化细胞(血管球巢蛋白VTH+细胞)可以通过方法诸如实施例2中所述的方法获得。简言之，暴露于低氧的成年大鼠的CB通过酶分散并将细胞涂布在非粘附处理的培养板上的NC培养基中，由此获得神经球，其与源自CNS和源自PNS的神经球(通常球形)相反，具有一个或两个特征形式的突出(图3A)。所述具有抗巢蛋白和抗TH抗体的神经球的薄切片的免疫细胞化学分析和使用DAPI的对比染色揭示具有巢蛋白_/TH+表型的分化细胞聚集体在肾小球突出中的存在，所述肾小球突出与中部核心通过组织的狭窄纤维(filament)相连，其在培养物中数周后，生长达到成熟CB 的尺寸(图3C)。 在另一个具体的实施方案中，所述MdeE是平滑肌肌动蛋白(SMA)且所述本发明的 分化细胞具有巢蛋白_/3區+表型(典型地源自神经嵴的细胞类型)。简言之，所述分化细 胞(巢蛋白VSMA+)可以如通过实施例2中所述的方法获得。简言之，将神经球(获自暴 露于低氧的成年大鼠的CB)重新涂布在粘附基质上的培养物中。由此得到的具有抗巢蛋白 和抗SMA抗体的细胞的免疫细胞化学分析和使用DAPI的对比染色揭示存在具有巢蛋白_/ SMA+表型的分化细胞(图3D)。 如果需要，本发明的分化细胞可以通过任何常规方法来遗传修饰，所述方法包括， 例证而非限制性地，在其基因组中的转基因、缺失或插入方法等。用于获得稳定的和条件性 无限增殖化细胞的一种可能方法基于通过分别使用质粒pEF321T或pRITA的脂转染来稳定 转染本发明的先祖细胞，如以下关于本发明的无限增殖化细胞所讨论的。
輛,，隨宫德朐' 本发明的干细胞、本发明的先祖细胞和/或本发明的分化细胞，在下文中称为"本 发明的细胞"，如果需要，可以经历可逆的无限增殖化过程。 因此，在另一方面，本发明涉及可逆无限增殖化细胞，在下文中称为"本发明的无 限增殖化细胞"，所述细胞是本发明的细胞，即本发明的干细胞、本发明的先祖细胞或本发 明的分化细胞。 在具体的实施方案中，本发明的细胞经历可逆的无限增殖化过程，其目的是获得 本发明的功能性的可逆无限增殖化细胞，其可以用于治疗目的，例如通过将所述细胞，或优 选地，源自所述干细胞的分化细胞植入发生损伤的CNS或PNS的那些区域中，来促进神经细 胞的再生。 用于本文中时，术语"无限增殖化"或"无限增殖化的"涉及这样的细胞，或涉及形 成这样的细胞的过程，所述细胞应该在避免老化的条件下，在培养物中无限增殖。按照本发 明，无限增殖化涉及这样的过程，通过该过程，细胞培养物以这样的方式转化，所述方式使 得细胞在某些方面行为如同肿瘤细胞，具体地在肿瘤细胞的增殖特征方面。因此， 〃 可逆 无限增殖化细胞〃 涉及这样的细胞，其在给定时刻，处于无限增殖化状态，但是其可以在稍 后时间利用逆转无限增殖化方法转变回非无限增殖化状态。 在具体的实施方案中，所述本发明的细胞可以通过这样的方法来可逆无限增殖 化，所述方法包括通过使用包括"可去除的多核苷酸"的载体的转化来无限增殖化本发明的 细胞，所述"可去除的多核苷酸"包含用于预防老化的致癌基因(或致癌基因的组合)，诸如 编码SV40病毒的T抗原长臂的基因，编码端粒酶的催化亚单元的基因，编码Bmi-l蛋白的 基因等，从而产生本发明的无限增殖化细胞；生长所述本发明的无限增殖化细胞；选择维 持本发明细胞功能特性的本发明细胞的克隆细胞系，和从本发明的无限增殖化细胞中去除 所述致癌基因(或致癌基因的组合)。 通过例证的方式，可以潜在用于获得本发明的稳定的和条件性的无限增殖化细胞 的方法包括基于通过分别使用质粒pEF321T或pRITA的脂转染来稳定转染来自CB原代培 养物的分散细胞的方法。 质粒pEF321T[Kim等，1990， Gene(基因)91,217-223]在延长因子1 a (EF-1 a )
18的遍在启动子的条件下，表达SV40病毒的T抗原的长臂，所述延长因子la (EF-la)能够无限增殖化表达它的细胞。该抗原活化一系列将该细胞转化为肿瘤细胞的原基因-致癌基因。然后，利用分子生物学、组织学和免疫组化技术，表征获得的多种克隆，其目的是在组成CB的那些中鉴定哪种细胞类型在它们中每一种中无限增殖化。 质粒pRITA(用T抗原的可逆无限增殖化)[Tobias M.等，2004， NucleicAcidsResearch (核酸研究)，32， 5529-5538]具有双向启动子PbiTA，对强力霉素响应的反式激活蛋白tTA与之结合。所述激活蛋白允许SV40的T抗原的mRNA的表达，并因此，在存在强力霉素的条件下细胞增殖，从而将细胞转化为可逆的无限增殖。在缺少强力霉素的条件下，表达抑制剂rtTA2M2 (SV40的T抗原的阻抑物)的mRNA，从而使得无限增殖化作用可逆，并因此减慢细胞增殖。所述阻抑物的表达，随即与编码绿色荧光蛋白(GFP)的基因的表达和新霉素抗性盒的表达相联，这使得可能选择具有新霉素的克隆和使用荧光显微镜验证无限增殖化作用的可逆性。在增殖回复前选择多种克隆并通过分子生物学、免疫组化和电生理学技术对它们进行表征。具有GFAP+细胞(本发明的干细胞)的克隆可以通过PCR鉴定并选择。而且，如果需要，在具有球细胞的典型标记物(TH+)和产生GDNF的那些克隆中，通过从培养基中除去强力霉素和添加新霉素，增殖过程的逆转是可能的，且如果需要，它们可以用于帕金森病动物模型的纹状体内植入物中。 在具体的实施方案中，所述本发明的可逆无限增殖化细胞是本发明的可逆无限增殖化的干细胞，或本发明的可逆无限增殖化的先祖细胞，或本发明的可逆无限增殖化的分化细胞，和有利地，本发明的可逆无限增殖化的分化细胞。 在另一个具体的实施方案中，本发明提供两种或多种类型的本发明的可逆无限增殖化细胞的组合，即本发明的可逆无限增殖化的干细胞和/或本发明的可逆无限增殖化的先祖细胞和/或本发明的可逆无限增殖化的分化细胞的组合。
本发明的细胞群 在另一方面，本发明涉及源自CB的分离的细胞群，在下文中称为"本发明的细胞群"，其包括选自包括以下各项的组的一组细胞本发明的干细胞，本发明的先祖细胞，本发明的分化细胞，本发明的无限增殖化细胞，及其组合。已经提到了所述细胞的特征。本发明的细胞可以通过在-S(TC冷冻，长期保存在合适的培养基，例如NC培养基中，其具有高血清含量(典型地高于20% )和冷藏剂(cryopreservative)，诸如二甲亚砜(DMSO)，其量为约10重量％。 所述本发明的细胞群可以，如果需要，在用于移植的细胞文库(cell bank)中。在具体的实施方案中，所述细胞文库包括许多本发明的可逆无限增殖化细胞，优选本发明的可逆无限增殖化的分化细胞，其关于关键抗原的至少一种或多种基因，即编码组织相容性抗原的基因(例如，人群中存在的主要组织相容性复合物(MHC)的等位基因)纯合。由所述文库，可能选择关于组织相容性抗原的一种或多种等位基因纯合的本发明的可逆无限增殖化细胞，所述组织相容性抗原的一种或多种等位基因与需要移植的受试者的MHC的等位基因相容。 如果需要，本发明的细胞群可以在这样的条件下冷冻保存，所述条件下在重构后，既不影响也不破坏其存活性。 增殖本发明的干细胞、先祖细胞、和分化细胞
在另一方面，本发明涉及用于增殖或制备所述本发明的干细胞或所述本发明的先 祖细胞的方法，在下文中称为"本发明的增殖方法"，其包括在低氧条件下，在特异于神经嵴 的培养基中培养所述本发明的干细胞或先祖细胞。 按照本发明的这个方面，因此，提供制备按照上述本发明任一方面的干细胞的方 法，所述方法包括分散由暴露于低氧的生物体分离的颈动脉体，和分离具有形成神经球能 力的那些细胞。优选地，本发明的细胞分离自血管球组织。合适的细胞是神经胶质型(II 型)支持细胞。 血管球组织优选是利用本领域中已知的技术，通过酶分散的。适合用于分散的酶
包括胶原酶(1、 n和/或iv型)、胰蛋白酶和弹性蛋白酶。血管球组织可以进一步分散，
例如，利用细镊子，和/或通过机械吸取它们。 在具体的实施方案中，所述本发明的干细胞或先祖细胞在非粘附表面上培养，从 而允许形成神经球，这容许在神经球形成所必需的漂浮条件下的培养。 所述特异于神经嵴的培养基包括培养基、营养源、抗生素和生长因子。在具体的 实施方案中，所述培养基是匿EM:F-12 ;所述营养源包括鸡胚提取物，优选是胚性的，浓度 为总培养基的至少5%，优选5% _20%，更优选15% ;所述抗生素选自青霉素、链霉素及其 混合物，典型浓度为相对于总培养基重量的0. 5-2% ;且所述生长因子选自FGF，包括bFGF， 或其功能变体，IGF-I或其功能变体，EGF或其变体，和所述因子的组合，其浓度(每种)为 10-40ng/ml，优选，20ng/ml。所述生长因子(FGF，EGF和IGF-I)可以是天然的或重组的，尽 管，作为备选方案，还可能使用本领域中技术人员公知的所述生长因子的功能变体。在具体 的实施方案中，所述特异于神经嵴的培养基(NC培养基)包括人重组bFGF、人重组IGF-I和 人重组EGF。另外，如果需要，特异于神经嵴的培养基可以增补氮源和B27。
培养在低氧条件下，即在存在小于15%，优选1-10%，更优选2-5%和甚至更优选 3%氧浓度下进行。(参见Morrison等，2000， J Neurosci (神经科学杂志)20， 7370-7376)。 所述条件剌激产克隆增殖。 而且，所述培养在35 。C _391:，优选在37。C的温度下进行。 使用本发明的增殖方法，可能获得充足量，诸如治疗有效量的提及的所述细胞类 型(本发明的干细胞或本发明的先祖细胞)任一种的纯培养物或所述细胞类型的混合培养 物。 按照这些方法产生的细胞可以通过观察它们的增殖、自我更新和分化能力来检 测。为了测定自我更新能力，可以将各个初级神经球重新涂布在用聚L-赖氨酸处理的粘附 基质上，和用NC培养基温育48小时。其次，用胰蛋白酶分离它们并机械分散，最后再在具 有NC培养基的非粘附板上培养。10天培养后计数次级神经球。 可以使用分别结合GFAP、 TH和巢蛋白之一的1、2或3种抗体检测细胞。合适的 抗体是可商购的，例如在兔中产生的抗TH抗体(1 : 1000， Pel-Freez， Roger, AR)，和也在 兔中产生的抗GFAP抗体(1 : 500， DAK0Cytomation，柯林斯堡，CO)。为了通过免疫组化 分析检测标记物，可以使用组织切片。首先，在室温下，用封闭溶液(磷酸盐缓冲液加10% 山羊血清，O. 1%牛血清清蛋白(BSA)，和0. 3% Triton X-100 (Sigma(西格玛)))预封闭
切片i小时。针对标记物的初次抗体(稀释的，例如i : ioo)在组织上4t:温育过夜，随
后在室温下与二次抗体(例如，荧光素缀合的二次抗体，稀释的，例如1 : 200;JacksonImmunoresearch(杰克逊免疫研究)，West Grove， PA ;或与Alexa 568缀合的二次抗体(1 : 500，Molecular Probes (分子探针)，Eugene,OR)) —起温育4小时。最后，可以用例如2. 5mg/ml 4' ， 6- 二脒基-2-苯基喷哚二盐酸[DAPI] (Sigma (西格玛))在室温下染色组织10分钟，以标记细胞核，随后使用在磷酸盐缓冲液[PBS]中制备的70%甘油进行组合。
用于分离细胞的具体方法不是本发明的基本特性。然而，在知晓本发明的干细胞的物理和功能特性的条件下，本领域中已知许多可以用于从组织中分离这些细胞的方法。该方法是仅以例证，而非意欲限制的方式提供的。 当然，本领域中已知的许多物理分离方法中的任何一种，作为上述那些方法的备选方案，可以用于选择本发明的细胞和将其与其他细胞类型区分。所述物理方法可以涉及FACS和多种基于由本发明的细胞特异性表达的标记物的常规免疫_亲和法。例如，本领域中的技术人员应该清楚的是，利用抗GFAP抗体的FACS分析应该提供纯化的细胞群。然而，在一些实施方案中，可能优选进一步通过进行另一轮FACS分析来纯化细胞群，所述另一轮FACS分析使用以上列出的一种或多种其他可鉴定的标记物，任选地，其通过阳性或阴性选择与已知的干细胞标记物协同作用。
药物组合物 在另一方面，本发明涉及药物组合物，即下文中的本发明的药物组合物，其包括治疗有效量的所述本发明的干细胞，先祖细胞或分化细胞，或其组合，或所述本发明的无限增殖化细胞，或所述本发明的细胞群，和药用赋形剂。 先前已经记述了所述细胞和细胞群的固有特征，包括可逆无限增殖化细胞的那胜。 在具体的实施方案中，本发明的药物组合物包括治疗有效量的所述本发明的分化细胞，或所述本发明的可逆无限增殖化分化细胞，或包括所述本发明的分化细胞和/或所述本发明的可逆无限增殖化分化细胞的本发明的细胞群。 用于本文中时，术语"治疗有效量"涉及本发明的干细胞、先祖细胞或分化细胞，或其组合，或所述本发明的无限增殖化细胞，或所述本发明的细胞群的这样的量，所述量是能够产生理想治疗效果的本发明的药物组合物必须包含的量；通常，除其他因素外，所述治疗有效量应该通过细胞的固有特征和追求的理想治疗效果来决定。 一般地，必须施用的本发明的细胞的治疗有效量，除其他因素外，应该取决于待治疗疾病的严重性，受试者的固有特征，受影响的区域，等。由于该原因，本说明书中提到的剂量必须仅认为是对本领域中专家的指导，所述专家必须根据上述因素调节所述剂量。通过例证而非限制的方式，本发明的药
物组合物可以以单一剂量，即包含约1X105-1X1()9，优选1X106-1X1()8，更优选1X107-5X1()7本
发明的干细胞，先祖细胞或分化细胞，或其组合，或本发明的无限增殖化细胞来施用。根据患者的状态和发展，该剂量可以以日、周或月的时间间隔重复，这必须由每个病例中的专家确定。 本发明的干细胞，先祖细胞或分化细胞，本发明的无限增殖化细胞，以及本发明的细胞群中存在的细胞可以是自体、异源或异种来源的细胞。在具体的实施方案中，所述细胞是自体来源的且分离自将它们施用于其中的受试者的CB，由此减少与针对所述细胞的抗原性和/或免疫原性相关的潜在并发症。
如果需要，本发明的干细胞，先祖细胞或分化细胞，或其组合，本发明的无限增殖 化细胞以及本发明的细胞群的那些可以，如前提及地，利用依靠抗体的阳性和/或阴性细 胞选择来纯化，其目的是选择单一细胞类型或富集细胞群以增加功效，减少发病率或促进 该方法。在具体的实施方案中，所述本发明的药物组合物主要包括本发明的分化细胞，例如 球细胞(^+/巢蛋白-)，或本发明的可逆无限增殖化分化细胞，例如可逆无限增殖化球细 胞，或所述细胞，例如球细胞中充分富集的本发明的细胞群。 按照本发明，本发明的干细胞，先祖细胞或分化细胞，本发明的可逆无限增殖化细 胞，以及本发明的细胞群的细胞可以在无需对其应用另外的处理的条件下或在应用另外的 处理以纯化所述细胞后，施用于受试者。而且，所述本发明的干细胞、先祖细胞或分化细胞， 所述本发明的无限增殖化细胞，以及本发明的细胞群的细胞，可以分别地，或与其他细胞群 一起，例如与将其植入其中的CNS或PNS区域的其他细胞一起施用。 术语"药用赋形剂"用于本文中时，指这样的事实，即其必须是由联邦政府或国 家政府的管理机构批准的或在美国药典(United StatesPharmacopoeia)或欧洲药典 (European Pharmacopoeia)，或在动物中和在人中一般公认的一些其他药典中列出的赋形 剂。术语"载体"涉及稀释剂、赋形剂、载体(carrier)或佐剂，本发明的干细胞，先祖细胞 或分化细胞，本发明的无限增殖化细胞，以及本发明的细胞群的细胞必须与其一起施用；显 然，所述载体必须与所述细胞相容。所述载体的例证性非限制实例包括任何生理学相容载 体，例如等张溶液(例如无菌盐溶液(0.9^NaCl)，磷酸盐缓冲溶液(PBS)，林格(Ringer) 乳酸溶液，等)，任选地增补血清，优选自体血清；培养基(例如DMEM， RPMI， McCoy，等)；或 优选地，固态、半固态、凝胶状或粘性支持培养基，诸如胶原，胶原_葡糖胺_多糖，血纤蛋 白，聚氯乙烯，聚氨基酸，诸如聚赖氨酸，或聚鸟氨酸，水凝胶，琼脂糖，右旋糖酐硫酸酯硅树 脂。而且，如果需要，所述支持培养基，在特定的实施方案中，可以包含生长因子或其他试 剂。如果所述支持物是固态、半固态、或凝胶状的，则可以以载体的液相引入细胞，随后处理 所述载体以使其转化为更具固态的相。在本发明的一些实施方案中，其中所述载体具有固 态结构，所述载体可以根据损害的形式成形。 本发明的药物组合物，如果需要，也可以包含，当必要时，用于增加和/或控制细 胞的合乎需要的治疗效果的添加剂，例如缓冲剂，表面活性剂，防腐剂，等。药用载体可以包 括支持细胞生存的细胞培养基。该培养基通常应是无血清的，从而避免在受体中激起免疫 应答。所述载体通常应是缓冲的和/或无热原的。此外，为了稳定细胞混悬液，可能添加金 属螯合剂。本发明的药物组合物的液体培养基中的细胞稳定性可以通过添加另外的物质， 诸如，例如，天冬氨酸、谷氨酸等来改进。所述可以用于本发明的药物组合物的药用物质是 本领域中技术人员普遍已知的，且通常用于产生细胞组合物。合适的药物载体的实例记述 在E. W.Martin的〃 Remington' sPharmaceutical Sciences (雷明顿药物科学) 〃 中。关 于所述载体的另外的信息可参见任何药物技术手册(即，草药药学)中。
本发明的药物组合物应该以合适的药物给药形式施用。为此，本发明的药物组合 物应该按照所选给药形式来配制。剂型应适合于给药方法。在具体的实施方案中，所述药 物组合物以液态、固态或半固态剂型，例如混悬液的形式制备，从而通过植入、注射或输注 施用于需要治疗的受试者。例证性非限制实例包括处于无菌混悬液中的本发明药物组合物 剂型，所述无菌混悬液具有药用赋形剂，例如等张溶液，例如，磷酸盐缓冲溶液(PBS)，或任
22何其他适合用于肠胃外施用于受试者的药用载体，尽管也可以使用其他给药途径。
本发明的药物组合物向由此需要的受试者的施用应该利用常规方法进行。在具体的实施方案中，所述本发明的药物组合物可以利用合适的装置诸如注射器、导管、套针、套管等肠胃外施用于受试者。在所有情形中，本发明的药物组合物应该利用适合于施用细胞组合物和本领域中技术人员已知的设备、仪器和装置施用。 在另一个实施方案中，将本发明的药物组合物直接施用于意欲受益的位点可以是有利的。在该方法中，直接施用本发明的药物组合物到所需的器官或组织可以通过插入合适的装置，例如合适的套管，或通过输注(包括逆流机制)或通过本专利中所述或本领域中已知的其他方法，直接施用(例如通过注射等)到受影响的器官或组织的外表面上来实现。在优选的实施方案中，应该将本发明的药物组合物直接施用于CNS或PNS的受损区域中。
可以保存本发明的药物组合物，直到其通过本领域中的技术人员已知的常规方法应用的时刻。为了短期保存(少于6小时)，可以将本发明的药物组合物保存在室温或低于室温的密封容器中，其中增补或不增补营养溶液。中期保存(少于48小时)优选在2-8°C进行，且本发明的药物组合物另外包括由防止细胞粘附的材料制成或内衬该材料的容器中的等渗、缓冲溶液。长期保存优选通过合适的深低温贮藏和在促进细胞功能保持的条件下的保存方法来进行。 在具体的实施方案中，本发明的药物组合物可以用于组合治疗法中。在优选的具
体实施方案中，所述药物组合物与用于治疗神经变性疾病或用于治疗由神经系统的缺血
性，外伤性或自体免疫损害引起的疾病的另外药物组合物组合施用。因此，本发明的细胞可
以作为单治疗法或作为与用于治疗所述疾病的其他常规方法组合的治疗法使用。 本发明的药物组合物可以用在与有效用于治疗神经变性疾病或用于治疗由神经
系统的缺血性，外伤性或自体免疫损害引起的疾病的其他药物一起的组合治疗法中，如已
经描述的。所述其他的医药产品可以形成相同的药物组合物的部分，或可以，备选地，以分
开的组合物形式提供，从而相对于本发明药物组合物的施用，同时或相继(在时间上连续)
施用。在具体的实施方案中，所述其他药物组合物同时或连续施用于包含本发明的干细胞、
先祖细胞和/或分化细胞，或本发明的细胞群的药物组合物，其随着时间展开，以任何顺
序，即可以首先施用本发明的药物组合物，然后是用于治疗神经变性疾病或用于治疗由神
经系统的缺血性，外伤性或自体免疫损害引起的疾病的其他另外的医药产品或其他药物组
合物，或可以首先施用用于治疗所述疾病的其他另外的医药产品或其他药物组合物，然后
是本发明的药物组合物。备选地，这两种成分中的任一种可以在相同组合物中混合在一起
并共同施用。在另一个备选的实施方案中，同时施用所述本发明的药物组合物和用于治疗
所述神经变性疾病或用于治疗由神经系统的缺血性，外伤性或自体免疫损害引起的疾病的
其他另外的医药产品或其他药物组合物。 本发明的细胞和细胞群的治疗应用 在另一方面，本发明涉及所述本发明的干细胞、先祖细胞或分化细胞或其组合，或所述本发明的无限增殖化细胞，或所述本发明的细胞群在开发用于治疗神经变性疾病，例如在治疗阿尔茨海默病，在治疗帕金森病，在治疗神经系统缺陷性损害，在治疗神经系统外伤性损害，或在治疗神经系统自体免疫损害的药物组合物中的应用。 在具体的实施方案中，所述细胞是本发明的分化细胞，或本发明的可逆无限增殖化分化细胞，或包括所述本发明的分化细胞和/或所述本发明的可逆无限增殖化分化细胞 的本发明的细胞群。尽管所述细胞可以是自体、异源或异种来源的，但是，在具体的实施方 案中，所述细胞是自体来源的且分离自向其中施用它们的受试者的CB，由此减少与针对所 述细胞的抗原性和/或免疫原性反应有关的潜在并发症。此外，在具体的实施方案中，所述 细胞采用神经球的形式。 在另一方面，本发明涉及治疗疾病，优选神经变性疾病或由神经系统的缺血性，外 伤性或自体免疫损害引起的疾病的方法，其包括向受所述疾病影响的区域内移植(植入或 移植)治疗有效量的所述本发明的干细胞、先祖细胞或分化细胞或其组合，或所述本发明 的无限增殖化细胞，或所述本发明的细胞群，优选本发明的分化细胞，任选地，其是可逆无 限增殖化。在具体的实施方案中，所述神经变性疾病是阿尔茨海默病或帕金森病。而且，在 具体的实施方案中，所述细胞是球细胞(巢蛋白_/^+)，优选是采用神经球形式的球细胞。
移植所述细胞和/或神经球可以通过现有技术中已知的技术进行，尽管优选地， 它们应该通过使用硬套管的立体定位手术植入。待移植的组织(细胞和/或神经球)的定 位和量应该取决于疾病的类型和严重性。在帕金森病患者的情形中，细胞植入应该优选地 在尾状核和/或豆状核中两侧进行。优选地，将最少106个细胞，107个细胞，108个细胞或 更多植入到脑的任一侧。在另一个实施方案中，可将细胞植入到粘附于生物相容植入物的 受损伤组织中。在该实施方案中，细胞在植入到患者之前，可以体外粘附于生物相容的植入 物。本领域中技术人员应该清楚地，大量粘附剂中的任一种可以用于在植入前，使细胞粘附 于植入物。仅通过举例的方式，所述粘附剂可包括血纤蛋白，整联蛋白家族中的一个或多个 成员，钙粘蛋白家族中的一个或多个成员，选择蛋白家族中的一个或多个成员， 一种或多种 细胞粘附分子(CAMs)，免疫球蛋白家族中的一种或多种和一种或多种人造粘附剂。该列表 仅以例证的方式提供，且不意欲进行限制。本领域中技术人员应该清楚地，可以使用一种或 多种粘附剂的任意组合。 在另一个实施方案中，可以将细胞包埋在基质中，之后将该基质植入到患者中。通 常，应该将基质植入到患者的受损伤组织中。基质的实例包括基于胶原的基质、基于血纤蛋 白的基质、基于层粘连蛋白的基质、基于纤连蛋白的基质和人造基质。该列表仅以例证的方 式提供，且不意欲进行限制。 在另一个实施方案中，可以将细胞与基质形成成分一起植入或注射到患者中。这 可能容许细胞在注射或植入后形成基质，从而确保细胞保持在患者内的合适位置。基质形 成成分的实例包括血纤蛋白粘着液态烷基，氰基丙烯酸酯单体，增塑剂，多糖诸如葡聚糖， 包含环氧乙烷的低聚物，嵌段共聚物诸如泊洛沙姆(poloxamer)和泊洛沙姆(Pluronics)， 非离子表面活性剂诸如吐温和Triton' 8'，和人造基质形成成分。该列表仅以例证的方 式提供，且不意欲进行限制。本领域中技术人员应该清楚地，可以使用一种或多种基质形成 成分的任意组合。 在另一个实施方案中，细胞可以包含在微球体中。在该实施方案中，细胞可以包封 在微球体的中心。而且在该实施方案中，细胞可以包埋在微球体的基质材料中。所述基质 材料可以包括任何合适的可生物降解的聚合物，包括但不限于藻酸盐、聚乙二醇(PLGA)、和 聚氨基甲酸酯。该列表仅以例证的方式提供，且不意欲进行限制。 在另一个实施方案中，细胞可以粘附于意欲用于植入的医学装置。所述医学装置的实例包括斯滕特固定模、针、缝线、薄板(split)、起搏器、修复术关节、人造皮肤、和杆。该 列表仅以例证的方式提供，且不意欲进行限制。本领域中技术人员应该清楚地，细胞可以通 过多种方法粘附于医学装置。例如，细胞可以利用血纤蛋白，整联蛋白家族中的一个或多个 成员，钙粘蛋白家族中的一个或多个成员，选择蛋白家族中的一个或多个成员， 一种或多种 细胞粘附分子(CAMs)，免疫球蛋白家族中的一种或多种和一种或多种人造粘附剂粘附于医 学装置。所述列表可以仅通过举例说明的方式提供，并且不意欲进行限制。本领域中技术 人员应该清楚地，可以使用一种或多种粘附剂的任意组合。 所述本发明的干细胞、先祖细胞或分化细胞以及所述本发明的无限增殖化细胞， 和所述本发明的细胞群可以通过上述方法学获得。 肝碰i平微鍾粉台mt洽麵麵慈白勺诚 在另一方面，本发明涉及用于体外评估针对潜在治疗化合物的细胞应答的方法， 其包括使包含本发明的干细胞，先祖细胞或分化细胞或其组合，和/或本发明的无限增殖 化细胞，和/或本发明的细胞群的培养物与潜在治疗化合物相接触和评估由所述化合物对 所述培养物中存在的细胞引起的作用。 在具体的实施方案中，所述细胞是本发明的分化细胞，具体地，分化为球细胞的细 胞(巢蛋白_/TH+)，其任选地采用神经球的形式。
本发明的细朐用于产牛GDNF的应用 意外地，如实施例7中所示，由来自颈动脉体的干细胞产生的神经球能够体外产 生GDNF，这与体内从新形成的球细胞相类似(实施例4)，其也获得合成GDNF的能力。该产 生可以在对应于球细胞的神经球区域内检测到。因此，本发明的干细胞，先祖细胞或分化细 胞或其组合，或本发明的细胞群可以用于产生GDNF。 为了该目的，本发明的分化细胞应该通过这样的方法获得，所述方法包括在这样 的条件下培养本发明的干细胞和/或先祖细胞，以允许所述干细胞和/或先祖细胞分化为 合乎需要的分化细胞，诸如在连续低氧剌激下培养；一旦分化，所述细胞可以在含氧量正常 条件下培养，以使用它们产生GDNF。因此，基于本说明书中提供的信息，本发明的分化细胞 可以通过本领域中任何技术人员已知的常规方法，从CB，或从CB的干细胞，或从源自所述 CB的干细胞的先祖细胞中获得并培养。 优选使用获自人的本发明的细胞，因为这可以解决临床试验过程中观察到的一 些障碍，所述临床试验是为了评估GDNF作为治疗剂治疗帕金森病的可用性而进行的。灵 长类动物研究显示在接受GDNF基因的动物中改善的运动表现(与不接受治疗的动物相 比)。在受治疗的动物中，帕金森氏病症状减少，并且，在处死动物后，发现健康多巴胺神 经元的数量显著上升。该发现的总结公开在Kordower等，Science (科学)290， 767 (2000) 中。基于此和由Don Gash (University of Rochester (罗彻斯特大学)和University of Kentuchy(肯塔基大学)，美国)博士进行的其他研究，开始了人类随机双盲GDNF试验。由 该试验获得的结果是有争议的，其显示非常少或没有来自GDNF的益处。在该试验过程中发 现的另一方面是在一些参与者中检测到"中和抗体"。这两个原因导致负责临床试验的公 司在2004年中断了关于GDNF的试验。由于已经提示了中和抗体的出现，且试验过程中观 察到的不良结果可以与这样的事实有关，即所用的GDNF是由细菌中分离的重组GDNF，由人 细胞直接获得的GDNF可以证明更有效用作治疗帕金森病的治疗剂，而不产生中和抗体。因
25此，其由本发明的分化人细胞的培养物的产生和分离可以用于克服治疗帕金森病中的一些 问题。 以下实施例举例说明本发明，但不得被认为是对其的限制。 实施例 用于开发本发明的材料和方法，以及其应用实施例详述如下。所述实施例不限制 本发明——它们的目的是对其进行举例说明，从而证明干细胞在颈动脉体中的存在，促进 其增殖和分化的方式，及其应用。
材料和方法
1.动物 用于这些研究的野生型Wistar大鼠(查理斯河，巴塞罗纳，西班牙)，野生型 C57BI16小鼠(查理斯河，巴塞罗纳，西班牙)和转基因小鼠遵从以下由欧洲委员会确定的 指导方针(861609/EEC)来饲养和处理。转基因小鼠(loxP-侧邻的GFAP-Cre/LacZ，GDNF/ LacZ)获自Jackson Laboratories (杰克逊实验室)(Bar Harbor, ME)，而loxP-侧邻的 Wnt 1-Cre/LacZ小鼠由AndrewMcMahon博士 (Department of Molecular and Cellular Biology (分子细胞生物学系)，Harvard University (哈佛大学)，美国)提供。转基因动 物的基因型测定通过遵从进行PCR的研究者的指示的PCR进行。
2.体内长期低氧处理和提供BrdU 月龄2-3个月的野生型C57BI16小鼠长期暴露于具有10 %氧气的环境大气中，为 此使用特殊的密封室，提供关于02和C02水平的控制，并监测温度和湿度(COY Laboratory Products INC. (COY实验室产品公司)，Grass Lake，MI)。为了揭示颈动脉体中的增殖事件， 在贯穿实验始终，每7天，对小鼠腹膜内注射50mg/kg 5-溴-2-脱氧尿苷[BrdU] (Sigma(西 格玛))。另外，向饮用水中增补lmg/ml BrdU。在低氧/含氧量正常处理后处理动物包括 通过心脏内输注4%固定剂多聚甲醛(PFA) (Sigma(西格玛))来固定所有组织。其次，去 除颈动脉分叉并在固定后在PFA中2小时。在30%蔗糖(Sigma(西格玛))中低温保护12 小时后，将该分叉包埋在化合物OCT(Sakura Finetek，托兰斯，CA)，基于可水溶乙二醇和树 脂的制剂中，以产生阻断和容许在低温恒温器中切割该分叉，从而获得厚度为10微米的颈 动脉体切片。 3.免疫组化分析 为了在组织切片中通过免疫组化分析检测BrdU，用2M HC1在室温下变性DNA 45 分钟，然后用O. 1M硼酸钠进行中和。接着，在室温下，使用封闭溶液(磷酸盐缓冲液加10% 山羊血清，O. 1%牛血清清蛋白(BSA)，和0. 3% Triton X-100 (Sigma(西格玛)))预封闭 该切片1小时。针对BrdU的初次抗体(1 : 100， Accurate Chemical (精确化学制品)， Westbury， NY)在组织上4"C温育过夜，随后在室温下用荧光素缀合的二次抗体(1 : 200， Jacksonlmmunoresearch(杰克逊免疫研究)，West Grove， PA)温育4小时。按照与关于 BrdU相同但没有DNA变性/中和步骤的方案，所用的其他抗体是兔中产生的小鼠抗TH 抗体(1 : 1000， Pel-Freez， Roger, AR)，和也在兔中产生的小鼠抗GFAP抗体(1 : 500， DAK0 Cytomation，柯林斯堡，CO)，二者后使用与Alexa 568缀合的抗兔二次抗体(1 : 500， Molecular Probes (分子探针)，Eugene, OR)。最后，在用在磷酸盐缓冲液[PBS]中制备的70%甘油进行组合前，用2. 5mg/ml 4' ， 6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸[DAPI] (Sigma (西格玛))在室温下染色组织IO分钟，以标记细胞核。在这些测试中，TH+细胞显现处于红色，BrdU+处于绿色且DAPI+处于蓝色。
4.将颈动脉体解离为单细胞 解剖20日龄Wistar大鼠的颈动脉体并将其置于冷磷酸盐缓冲液中。血管球组织在酶溶液(lml磷酸盐缓冲液，具有0. 6mg胶原酶II， 0. 3mg胰蛋白酶，7. 5微升猪弹性蛋白酶(储液250U/毫升)，和10微升来自5mM储液的CaCl2)中在37。C温育20分钟。其次，利用细镊子破坏血管球组织，再在37t:温育7分钟，并最后通过机械吸取它们而分散细胞。将细胞密度利用血细胞计数器(Sigma(西格玛))确定。
5.测试神经球形式的体外生长 将分散的颈动脉体细胞典型地培养在非粘附处理的6孔板中(CorningInc.(科宁公司)，Corning(科宁)，NY)，其处于促进形成各个可识别的神经球的克隆密度。对于关于克隆生长和个性化的实验，使用非粘附处理的板，但其具有96孔代替6孔。培养基含有D-MEM:F-12(Gibco BRL，Grandlsland，NY) ， 15%鸡胚提取物(如Stemple和Anderson,1992 ;Cell(细胞)71,973-985中所述制备)，1 % N2补充剂(Gibco) ， 2 % B27补充剂(Gibco) ， 1%青霉素/链霉素(Cambrex，Verviers，比利时)，20ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) (R&D Systems (R&D系统)，明尼阿波利斯，丽)，20ng/ml人重组胰岛素样生长因子-I (IGF-I) (R&D Systems (R&D系统))，和20ng/ml包含的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)和人重组表皮生长因子(EGF) (R&D Systems (R&D系统))。贯穿这个工作始终，该培养基组合物称为神经嵴培养基(NC培养基)。所有培养在具有受控的0)2水平的温育器(Thermo Electron Corp.(热电子公司)，沃尔瑟姆，MA)中，在3%的固定氧水平和在37t:下进行。 为了测试来自颈动脉体的干细胞的自我更新能力，使用各种初级神经球，将它们重新涂布在用聚L赖氨酸处理的粘附基质上，并用NC培养基温育48小时。其次，用胰蛋白酶分解它们并对其进行机械分散，最后再在具有NC培养基的非粘附板上培养细胞。在10天培养后，计数次级神经球。 对于免疫细胞化学鉴定神经球中的多种细胞，将其在4% PFA中固定，并对它们应用相同的流程，以获得如同完整颈动脉体的薄切片(低温保护，包埋，和精细切割IO微米)。
在其他情况时，将神经球重新涂布在粘附处理的板上，用NC培养基温育IO天，且集落一旦增殖，用4% PFA固定。然后，应用典型的免疫细胞化学流程在室温下预封闭1小时，用初次抗体温育1小时，和用二次抗体再温育1小时，和最后用DAPI对比染色，所述DAPI将细胞核染色为蓝色。封闭溶液与用于组织(见上)的相同。在处于粘附条件的样品中使用的抗体是小鼠中产生的抗TH抗体(1 : 500，Sigma(西格玛))，随后是山羊中产生并与若丹明缀合的抗小鼠二次抗体(1 : 100， Chemiconlnternational， Temecula， CA)，和抗平滑肌肌动蛋白抗体(SMA， Sigma(西格玛))，随后是驴中产生并与Cy2缀合的抗小鼠二次抗体(1 : 200， Jacksonlmmunoresearch(杰克逊免疫研究))。神经球薄切片上使用的抗体是兔中产生的小鼠抗TH抗体(与用于组织的相同，见上)和小鼠中产生的大鼠抗巢蛋白抗体(1 : 200，Chemicon International)，随后是驴中产生并与Cy2缀合的抗小鼠二次抗体(1 ^ 200， Jackson Imm皿oresearch (杰克逊免疫研究))。
巢蛋白阳性细胞显现绿色。
6.流式细胞计数 通过细胞计数进行的所有分析和细胞分离在三激光流式细胞计数器MoFlo型(DAK0 Cytomation，柯林斯堡，CO)中进行。将分散的颈动脉体细胞重新悬浮在染色溶液中并用多种抗体温育，各在4t:进行20分钟。染色溶液包含(对于50ml) :44ml L15培养基(Gibco) ，0. 5ml青霉素/链霉素(Cambrex) ，0. 5ml HEPES 1M缓冲液(Gibco)，O. lgBSA(Sigma(西格玛))，和5ml蒸馏去离子水。用于流式细胞计数的抗体如下兔中产生的小鼠抗p75抗体(1 : 2000， Chemicon International)，随后是山羊中产生并与荧光素-5-异硫氰酸酯[FITC]缀合的抗兔二次抗体(1 : 200， Jackson Immunoresearch (杰克逊免疫研究))，和小鼠抗HNK-l(l : 600， Pharmingen/BD Biosciences (BD生物科学)，圣何塞，CA)，随后是山羊中产生并与藻红蛋白[PE]缀合的抗小鼠二次抗体(l : 200，JacksonImmunoresearch (杰克逊免疫研究))。 一旦保留，清洗非粘附抗体，将细胞重新混悬在具有2mg/ml 7-氨基-放线菌素D[7-AAD]的染色培养基中(Molecular Probes (分子探针)，Eugene, OR)中。通过其7-AAD阳性表型除去细胞计数器中的死亡细胞。
7.安培计记录细胞分泌 将一些由颈动脉体生长的神经球重新涂布在用聚-L-赖氨酸处理的盖玻片上，并在正常培养基中温育过夜。将具有粘附神经球的盖玻片转移到记录室中并连续灌输含有NaCl 117mM，KCl 4. 5mM，NaHC03 2 3mM，MgCl2 lmM，CaCl2 2. 5mM，葡萄糖5mM和蔗糖5mM的溶液。 〃 低血糖〃 溶液具有蔗糖5mM而非葡萄糖，即总蔗糖10mM，从而防止重量摩尔渗透压浓度改变。"含氧量正常"溶液充气5% C02， 20% 02，和75% N2的气体混合物(02压145mmHg)。"低氧"溶液充气5% C02和95% N2以使室内02压达到约15mmHg。所有的实验均在室内温度约36t:下进行。分泌速度，以毫微微库仑(fC)/分钟为单位，计算为给定时间内转移到记录电极的电荷量(Pardal禾口L6pez—Barneo，2002 ;Nat Neurosci (自然神经禾斗学)5， 197—198)。
8.通过"膜片钳"技术记录 神经球的神经纤维球中的电压依赖性宏观球细胞流利用"片钳"技术的"完整细胞"构型记录，如先前在本发明人的实验室中改进的(L6pez-Barneo等，1988 ;Science (科学)241,580-582)。为了记录宏观钾流，记录溶液的组成是:80谷氨酸钾80mM， KC150mM， MgCl2 lmM， H印es 10mM， MgATP 4mM，乙二醇四乙酸[EGTA]O. lmM(pH，7.2):和外部NaCl 117mM，KCl 4.5mM，NaHC03 23mM，MgCl2 lmM， CaCl22. 5mM，葡萄糖5mM和蔗糖5mM(pH通过充气5%0)2调节)。静止时，电压固定为-SOmV。对于用于记录宏观钙流的实验，溶液的组成是内部CsCl 100mM， CsF 25mM， MgCl2 2mM， H印es 10mM， MgATP 4mM， EGTA 0. 5mM(pH7.2):和外部BaCl。 10mM，NaCl 140mM，KCl 2.7mM，H印es 10mM和葡萄糖5mM(pH 7. 4)。静止时的保持电压是-80mV。
9.统计学分析 统计学数据显示为平均值±标准偏差，括号中是实验重复次数。统计学显著性通
过配对斯氏-t检验评估。 10.获得人颈动脉体的神经球 两个颈动脉分叉获自年龄60岁以下的心脏供体。在显微镜下由颈动脉中切割出颈动脉体，其始终保持组织低温并浸没在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中。 一旦提取后，将颈动脉体切成小片段，将其立即经历酶分散。分散溶液由具有60iU CaCl2 (储液5mM)的6ml 磷酸盐缓冲液，1. 6mg胰蛋白酶，2. 5mg I型胶原酶，2. 5mg IV型胶原酶和7. 5 yl猪弹性蛋 白酶组成。将人血管球组织在分散溶液中37t:并搅拌温育20分钟。然后利用细镊子破坏 该组织，将其再次在37t:另外温育IO分钟，并最后通过吸取组织机械分散细胞。 一旦分散 后，将细胞涂布在具有培养基的低粘附板上，所述培养基包含与关于啮齿动物细胞相同的 成分，仅用遵从标准血液学方法从来自志愿供体的外周血获得的人血清替换鸡血清(试剂 盒名称Vacuette Z血清SEP凝固活化剂)。培养10天后，对人神经球进行照相并以与来 自啮齿动物的那些相同的方式进行处理以进行免疫组化研究。
11.用X-gal染色 染色分散的细胞、组织切片或神经球切片，以检测13 -半乳糖苷酶的表达，在具有 X-gal的缓冲液中37t:温育它们过夜。所述缓冲液使用PBS(pH = 7. 4)制备，其补充MgC^ 2mM (Sigma (西格玛))，亚铁氰化钾5mM (Sigma (西格玛))和高铁氰化钾(Sigma (西格玛))。 在即将使用前，将X-gal (Molecular Probes (分子探针)，Eugene, OR)加入到缓冲液中，以 达到最终浓度lmg/ml。
实施例1 诵讨低,氧'i總页云應本4^禾口f射胸申麵隨鄉朐' 将野生型C57BL/6小鼠暴露于等压大气中的低氧(10% 02) 3周来诱导颈动脉体尺 寸相对于最初尺寸增加约2-3倍，这归因于血管的扩张和增多，以及实质的扩张，其TH+球 细胞(对于酪氨酸羟化酶阳性)数量增加(图1A)。 对于分析新球细胞的增殖和形成，用BrdU处理C57BL/6小鼠并然后将其保持在含 氧量正常(21% 02)或低氧(10% 02)环境中数天。含氧量正常动物中没有观察到TH+和 BrdU+细胞，这说明缺少增殖(图1B，左图)。相反，在低氧中数天后，甚至在CB生长明显 前，观察到大量TH+和BrdU+细胞(图IB右图中的箭头)，这说明出现新球细胞。响应低氧 在CB中产生的变化在图1C中显示为时间的函数。与CB的过度生长平行，在低氧条件下的 处理过程中从新形成的TH+球细胞数量也增加2-3倍。 该定量分析还揭示，尽管在应用低氧条件后一天观察到CB组织中的BrdU引入，但 是新球细胞(BrdU+，TH+)在处于低氧中5或6天后才开始出现。这些数据应该提示在出现 新神经元细胞前存在增殖和分化的过程。而且，当将长期使用低氧处理的小鼠重新引入到 含氧量正常环境(重新-含氧量正常)中时，与球细胞数量下降同时进行正常尺寸CB的恢 复。因此，在重新-含氧量正常CB中，约50X的球细胞是BrdU+(图1D-F，箭头)。这些数 据再一次说明存在前体或先祖细胞(BrdU+，TH-)，其在低氧中的增殖(BrdU的引入)先于它 们分化为球细胞(TH+)。而且观察到由低氧诱导的结构改变类似于年轻小鼠(4-6周，图1C) 和老年小鼠(超过8个月；TH+细胞含氧量正常中1555+25， n = 4和低氧中2470±358， n =3)中的。 形成球细胞的前体细胞的神经来源通过利用loxP-侧邻Wntl-Cre/LacZ转基因 小鼠分析细胞谱系来测试，其中标记源自神经嵴的细胞(Chai等2000Development(发 育)127， 1671-1679 ; Jiang等，2000Development (发育)127， 1607-1616)(图2A)。这些动 物中的CB含有大量与TH+细胞共同定位的X-gal沉积。X-gal沉淀也在BrdU+， TH+细胞 中观察到(图2B-C)。这些数据显示预先存在球细胞和经历低氧的动物中新形成的球细胞均源自神经嵴。
实施例2 自顿船口缝附页云應好麵 为了鉴定暴露于低氧的成年啮齿动物中形成球细胞的前体，用酶分散年轻Wistar 大鼠(> P20)的颈动脉体并将细胞涂布在含有bFGF， IGF-I和EGF的神经嵴(NC)培养基 中(Morrison等，1999， Cell (细胞)96， 737-749)。利用非粘附处理的培养基，在漂浮条件 下诱导生长并由此获得神经球。通过在适度低氧(3% 02)，即模拟体内由低氧剌激CB生长 的条件中培养细胞来剌激产克隆增殖(Morrison等，2000， J Neurosci (神经科学杂志)20， 7370-7376)。 在这些实验中，涂布的细胞中的1. 04±0. 4% (n = 6标本)形成神经球(图3A)。 在培养10天后，神经球的直径是85士34微米(n = 112)，即与关于获自其他神经先祖群的 神经球所述的相当的数值(Molofsky等2003 ;Nature(自然)425， 962-967)。神经球的生长 需要用于NC的培养基(NC培养基)中存在生长因子，且此外，如果培养在含氧量正常(21% 02)条件下进行，则获得的神经球明显更小。此外，还观察到，形成神经球的效率在老年动物 中降低到0. 17±0. 02% (n = 3标本)。 然而，与源自中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)的其他区域的神经球 的典型球形形状相比(Doestsch等，1999， Cell (细胞)97， 703-716 ;Molofsky等，2003， Nature (自然)425,962-967)，源自CB的神经球中的大部分(在培养10天时>85% )特征 性地具有1或2个突出(图3A中的箭头)。神经球薄切片的免疫细胞化学分析揭示中部核 心存在巢蛋白(巢蛋白+)(神经先祖细胞的典型标记物)，且肾小球突出中存在分化的^+ 和巢蛋白-细胞的聚集体，所述肾小球突出与中部核心通过组织的狭窄纤维相连(图3B)， 且其形式表明原位CB的神经纤维球特征。在培养数周后，这些神经纤维球生长直到它们达 到成熟CB的尺寸(图3C)。 神经球的克隆来源通过利用分别涂布细胞的实验来验证，其中使用具有超低粘附 的96孔板。培养10天后，在显微镜下检查两次，许多接受单细胞的孔有具有神经纤维球的 单神经球，这说明这些神经球由仅一个源自CB的细胞的增殖产生。估计的形成神经球的效 率是11.6±1.5% (实验11 = 4)，其显著高于在培养所有细胞的实验中获得的值。该差别 可以简单地归因于涂布所有细胞的实验中培养物中减少的细胞存活，这是因为存在死亡细 胞和细胞碎片。在任何情形中，估计的形成神经球的频率提示正常大鼠CB中应该存在达到 200-300数量级的干细胞。 而且，还通过解离初级神经球和在具有NC培养基的非粘附皿上再涂布在相同 条件下培养物中分散的细胞来测试CB的先祖细胞的自我更新能力。获得的次级神经球 的数量(7±2/初级神经球，n = 10)充分低于关于其他神经先祖群的文献中所述的值 (Molofsky等，2003Nature(自然)425， 962-967)。然而，在解离CB的神经球过程中遇到的 困难，即需要强酶处理和有力的破坏过程，提示细胞可能已经经历了损伤并且，因此，改变 它们的次级生长。在该含义下，不可能排除CB的先祖细胞的更强的自我更新能力，如果该 测试在更好的条件下进行。 大神经球的中部核心中存在TH-，巢蛋白_细胞(图3B和3C)提示，CB的先祖细 胞，以及球细胞，可以分化为其他细胞类型。这通过再涂布于在粘附基质上的培养物中神经球的免疫细胞化学分析验证。CB的干细胞能够分化为SMA+细胞(平滑肌肌动蛋白的特异性 抗原)，典型源自培养物中的神经嵴的细胞类型(图3D和3E) (Kruger等，2002，Neuron (神 经元)35， 657-669)。 GFAP+染色不出现在神经球中，因为，如体内实验中所示(参见实施例 3)，细胞在它们开始分化过程的时刻失去该标记物。因此，CB的先祖的行为类似于其他源 自神经嵴的干细胞(Bixby等，2002， Neuron (神经元)35， 643-656)，其能够产生产克隆集落 并自我更新和分化为多种细胞类型。
实施例3 鹏月夺腳射寺M, CB白奸麵 至今，始终认为，在某些情形中，球细胞能够进入有丝分裂周期(Nurse和 Vollmer， 1997Dev Biol(发育生物学)184， 197-206 ;Wang和Bisgard， 2002Microsc Res Tech (显微研究技术)59， 168-177)。然而，充分确定TH+球细胞，在解离后，可以在培养物 中维持数天(L6pez-Barneo等，1988Science (科学)241， 580-582 ;Villadiego等，2005J Neurosci (神经科学杂志)25， 4091-4098)。为了验证球细胞的增殖是否生成CB神经球，在 神经球形成的不同阶段进行免疫细胞化学分析(图4A)。最初，神经球很小且通过TH-，巢 蛋白+和其他巢蛋白-细胞的组形成。该阶段后不久在生长的神经球的外围出现具有一些 TH+细胞的小胚核(突出)。TH+细胞的数量逐渐增多直到它们形成前述球细胞的特征聚集 体。该连续发育提示解离和涂布后，先祖细胞(与成熟球细胞不同)增殖并经历自我更新， 以形成神经球的中部核心，这发生在先祖分化为成熟球细胞(TH+)之前。
通过流式细胞计数的分离提示TH+细胞不起始神经球的形成，因为表达大量 HNK-1，即源自神经嵴的神经元前体的标记物(图4B中的视窗ftl)的细胞(Young等， 1998Dev Biol (发育生物学)202，67-84)从不产生神经球。如图4C中所示，由于标记物 HNK-1而富集的群全是TH+球细胞。 然而，分离强表达p75，即来自神经嵴的其他干细胞群的典型标记物的细胞级分 (Morrison等，1999， Cell (细胞)96， 737-749)(图4B中的视窗#2)不增加神经球的产生。 使用干细胞标记物(c-ret， CD133，整联蛋白a-4和SSEA-1)的其他分析也证实未能通过 流式细胞计数从CB富集先祖群。鉴定干细胞的线索来自在体内进行的实验，其显示尽管在 含氧量正常动物的CB中用GFAP标记物(GFAP+)清楚地鉴定II型细胞，但是所述标记物随 着暴露于低氧而逐渐消失，同时BrdU+或增殖细胞的数量增加(图4D)。而且，在将II型 细胞引入低氧环境中时，还出现增殖标记物巢蛋白，其在返回到含氧量正常环境中时消失 (图9A-D) 。 GFAP+细胞在低氧动物一旦返回到含氧量正常环境中时再出现，并且CB恢复到 其初始尺寸。这些数据提示II型细胞响应低氧经历活化过程并因此可以是CB的干细胞。
鉴定CB的干细胞的直接证据通过用于作图细胞谱系的体内实验获得，其中使用 loxP-侧邻的GFAP-Cre/LacZ转基因小鼠(图5A)。在这些动物模型中，GFAP的转基因启 动子在脑中相当活跃，其中许多细胞(神经胶质细胞和神经元)源自GFAP+先祖且，因此， 全部以B-gal+标记出现(Malatesta等，2003， Neuron (神经元)37， 751-764)。相反，GFAP 的转基因启动子的活性含氧量正常时在CB中相当低且，此外，在从未经历低氧条件的动物 的CB中没有检测到B-gal+细胞。为了活化GFAP的转基因启动子，使动物经历低氧/重新 含氧量正常周期，由此导致支持细胞中GFAP表达的消失和再出现和转基因构型的活化。在 这些动物中，第二次暴露于低氧产生CB的生长和X-gal在新球细胞(TH+和BrdU+)中的选择性沉积。这证明它们源自GFAP+先祖。X-gal在BrdU+，TH+细胞上的沉积的定位通过分 散细胞和染色分离的细胞来验证。 由图9可见，表现出X-gal沉积的CB的II型GFAP+细胞是干细胞，因为它们引起 神经球形式(TH+球细胞)的生长。
实施例4 碰f制勺鄉朐'储成纖仆,，齢、电顿糾峰仆,對封!H
球细胞在生理学上非常复杂，因为它们是可电激活的，且它们能够检测血液中的 某些物理化学变量。当通过02或胞外葡萄糖浓度的下降激活时，CB的球细胞表现出儿茶 酚胺释放的急剧增加，这可以通过电流测定法来监测(Pardal等，2000Proc Natl Acad Sci USA (美国国际禾斗学院学报)97， 2361-2366， Pardal和L6pez-Barneo， 2002Nat Neurosci (自 然神经科学)5， 197-198)。在体外获自本发明的干细胞或先祖细胞的球细胞中检测到针对 低氧和低血糖的这些相同反应(图6A-C)。 体外产生的神经纤维球的球细胞通过"膜片钳"技术分析。图6D显示新球细胞表 现出内向离子流和随后的大的外向流(图6E)。如关于正常球细胞发生地，用Cs+阻断外向 流揭示电压门控的Ca"通道的存在(图6F)。这些数据说明体外源自CB的先祖的TH+细 胞具有与成熟球细胞相同的功能特征。 然而，因为也是高多巴胺能的，CB的球细胞能够生成大量GDNF，即促进多巴胺能 神经元存活的有效神经营养因子。在杂合GDNF/LacZ敲除小鼠中，通过X-gal沉积的出现 标记GDNF的产生(Sanchez等，1996Nature(自然)382， 70-73)，所述X-gal的沉积似乎选 择性集中在球细胞中。利用该相同的工具，该实验显示使前述小鼠暴露于低氧体内引起CB 中TH+，BrdU+细胞上X-gal的沉积(图7A_D)。这些数据说明从新形成的球细胞也获得合 成GDNF的能力。
实施例5 细胞治疗法在帕金森病中的适用性 将基于由选择性破坏多巴胺能神经元的有毒物质，即6-羟多巴胺(6-0HDA)弓|起 的黑质单侧损害的Wistar大鼠的帕金森病模型用于该实验。具有多于90%黑质损害的大 鼠表现出与人中帕金森病类似的症状运动不能，强直，运动单侧化(大鼠中的旋转)和感 觉运动缺陷。这些功能缺陷可以使用合适的成套测试来评估。此外，运动的单侧化可以注 射苯丙胺(5mg/kg)加剧，这诱导强烈的"同侧旋转"(朝向具有损害的一侧)，其频率，如果 大于360次旋转/小时，则是大于90%的损害的指示。 对于每只帕金森小鼠，从使用1微升6-0HDA (4mg/ml ;坐标AP = -5. 3 ;L = -2. 3 ; V = -8. 2)处理黑质单侧损害起10天时，将约20个来自颈动脉体的神经球植入到去神经的 纹状体中(相对于前囟的坐标AP = 0. 2 ;L = -3 ;V = -5. 5)。颈动脉体神经球在通过在无 钙或镁但有胶原酶(0.6mg/ml)和胰蛋白酶(0.3mg/ml)的生理溶液中温育20分钟分散和 解离颈动脉体后获得。将分散的细胞涂布在具有培养基的非粘附板上，所述培养基含有特 异于源自神经嵴的干细胞的营养因子。通过该方法获得的每个神经球含有50-100个血管 球或优选分化的I型细胞。 在移植神经球后10、30和90天时，从神经化学、形态学和行为的观点评估移植物 的功能性和功效。神经化学研究基于脑组织切片中纹状体内多巴胺水平的安培计记录。形态学研究是免疫细胞化学特征的，其利用使用针对酪氨酸羟化酶(TH)的抗体染色，其说明 产生多巴胺细胞的存在或缺乏。行为评估利用合适的成套测试进行，以评估动物的运动和 感觉运动反应。
功能结果是非常积极的在无移植物的去神经的纹状体中检测到大于90%多巴
胺下降的安培计记录揭示具有三个月进展移植物的纹状体中恢复到65%的多巴胺水平。
形态学研究显示存在具有对酪氨酸羟化酶阳性的球细胞的移植物，其在神经纤维球中联合
并还表达GDNF型营养因子(图7)。前述内容与非常好的行为恢复有关a)自发的和苯丙
胺-诱导的旋转在第一个月过程中消失，和b)三个月后恢复感觉运动反射。 实施例6 m跪應本白奸麵 为了确证来自颈动脉体的干细胞在人组织中的存在，本作者参与在Seville的 Virgen del Rocio医院的器官捐献计划。他们因此开始接受60岁以下心脏供体的两个颈 动脉分叉(图IIA)，其表现出血管组织的较好保存。解剖和切割(图11C)颈动脉体(图 11B)并然后使其经历酶处理。分散的细胞在具有人血清的神经嵴培养基中和在低氧条件下 培养。培养IO天后，观察到神经先祖的存在，其以神经球的形式生长(图IID)，外观上非 常类似于啮齿动物中所述的那些，即具有存在于表面上的处于神经纤维球形式的加厚(图 11D中的箭头)。这些神经球的详细免疫细胞化学研究揭示该加厚是有效的TH+球细胞组 (图IIE)，其由先祖开始分化。这些发现因此证实人中存在特异于颈动脉体的干细胞，并且 显示出它们在体外分化为球细胞的能力。
实施例7
证明由神经球产牛GDNF 如已经提到地，来自颈动脉体的干细胞是能够分化为颈动脉体的成熟球细胞，对 TH阳性和能够响应于生理学剌激分泌儿茶酚胺诸如多巴胺和营养因子诸如GDNF的细胞。 为了证实确实如此，进行用于验证神经球是否能够产生GDNF的测试。 为此，颈动脉体由GDNF/LacZ转基因小鼠(其是在GDNF启动子控制下表达P -半 乳糖苷酶的小鼠)摘除，解剖并以与关于Wistar大鼠所述相似的形式分散细胞，体外培养 它们以获得神经球。将神经球重新涂布在粘附处理的板上，如"测试神经球形式的体外生 长"部分所述，并然后对所述板应用该相同方法学中所述的免疫细胞化学测试流程。另外， 在板上进行使用X-gal的染色过程，以验证酶13 -半乳糖苷酶的表达。
测试结果显示在图12中，其中显示X-gal沉积的出现(版A)发生在这样的区域 中，其中检测到由于抗TH抗体引起的荧光，即球细胞的区域。而且，所述点的密度与染色的 细胞中高水平的GDNF产生有关，这证明在由来自颈动脉体的干细胞产生的神经球中体外 产生GDNF。
獵 尽管已知在成年哺乳动物的脑的特殊小生境中保持神经发生，但是PNS中存在生 发中心是未知的。现在，本发明人意外地发现了成年小鼠的CB中存在干细胞。从事的研究 证明神经元样球细胞的从新生成取决于CB中存在的干细胞群，其在体外形成多能性自我 更新集落。体内细胞谱系的分析说明意外地，CB的干细胞是具有神经胶质表型的支持细胞 或II型细胞。
至今为止关于颈动脉体的细胞聚集体进行的自体移植减轻了帕金森病患者的症 状(Arjona等，2003)，但是观察到存在限制该治疗法的因素，其存在于老年CB的组织学完 整性，以及不足量的可用于移植的组织。由本发明人进行的实验显示通过本发明的增殖方 法处理的成年啮齿动物的CB的干细胞和/或先祖细胞，在培养IO天后，如何能够非常有效 地产生球细胞。 此外，培养单神经球中球细胞过量聚集体超过三周能够达到完整CB尺寸，因此可 能获得大量用于治疗处理的细胞生物质。而且，这些新细胞具有与原位成年成熟球细胞相 同的化学感受器和电生理性质(图6)，是高儿茶酚胺能的，合成营养因子诸如GDNF(图7) 并已在针对帕金森病的细胞治疗法中产生非常积极的结果。
因此，进行的测试确定了 a)CB是PNS的生发中心，其中体内发生成熟神经元细胞的神经发生，正如同哺乳 动物的CNS中发生的，其中成熟神经组织保持在贯穿动物生命始终产生新神经元的先祖；
b)CB的生发中心具有突出的体内再生能力，其在适应长期低氧过程中具有重要的 生理学作用； c)CB含有具有自我更新能力(II型细胞)，和体内和体外分化为I型或球细胞的 能力的多能干细胞；禾口 d)通过本发明的增殖方法获得的细胞移植物能够逆转神经变性疾病的临床特征。
权利要求
分离的成熟干细胞，其源自颈动脉体，特征在于其对于表型标记物GFAP(胶质细胞原纤维酸性蛋白)阳性和对于表型标记物TH(酪氨酸羟化酶)和巢蛋白阴性。
2. 分离的成熟先祖细胞，其源自所述按照权利要求l的干细胞，特征在于其对于所述 表型标记物巢蛋白阳性。
3. 按照权利要求2的先祖细胞，特征在于其对于所述标记物GFAP弱阳性和对于所述表 型标记物巢蛋白阳性。
4. 按照权利要求2的先祖细胞，特征在于其对于所述标记物GFAP阴性和对于所述表型 标记物巢蛋白阳性。
5. 分化的成熟细胞，其源自所述按照权利要求1的干细胞或所述按照权利要求2-4中 任一项的先祖细胞，特征在于其对于表型标记物巢蛋白阴性和对于特化标记物阳性。
6. 按照权利要求5的分化细胞，特征在于所述特化标记物是酪氨酸羟化酶(TH)。
7. 按照权利要求5的分化细胞，特征在于所述特化标记物是平滑肌肌动蛋白(SMA)。
8. 按照权利要求1-7中任一项的细胞，特征在于其进行了遗传学操作。
9. 可逆无限增殖化细胞，特征在于所述细胞选自包括按照权利要求l的干细胞、按照 权利要求2-4中任一项的先祖细胞、和按照权利要求3-5中任一项的分化细胞的组。
10. 按照权利要求1-8中任一项的细胞，其是人来源的。
11. 源自所述颈动脉体的分离的细胞群，其包括一组按照权利要求i-io中任一项的细 胞或其组合。
12. 药物组合物，其包括治疗有效量的按照权利要求1-10中任一项的细胞或其组合， 或按照权利要求11的细胞群，和药用赋形剂。
13. 按照权利要求1-10中任一项的细胞或其组合，或按照权利要求11的细胞群在开发 治疗神经变性疾病的药物组合物中，在治疗神经系统缺血性损害中，在治疗神经系统外伤 性损害中，或在治疗神经系统自体免疫损害中的应用。
14. 按照权利要求13的应用，其中所述神经变性疾病是阿尔茨海默病或帕金森病。
15. 按照权利要求13或14中任一项的应用，其中所述细胞是从新球细胞(巢蛋白_/ TH+)，其源自所述按照权利要求1的干细胞或所述按照权利要求2-4中任一项的先祖细胞。
16. 按照权利要求15的应用，其中所述从新球细胞在神经球内。
17. 用于制备或增殖按照权利要求1的干细胞或按照权利要求2-4中任一项的先祖细 胞的方法，其包括在低氧条件下，在特异于神经嵴的培养基中培养所述干细胞或先祖细胞。
18. 按照权利要求17的方法，特征在于所述干细胞或先祖细胞在非粘附表面上培养。
19. 按照权利要求17的方法，特征在于所述特异于神经嵴的培养基包含培养基、营养 源、抗生素和生长因子。
20. 按照权利要求19的方法，特征在于所述生长因子选自成纤维细胞生长因子(FGF) 或其功能变体，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)或其功能变体，表皮生长因子(EGF)或其变 体，和所述因子的组合。
21. 按照权利要求17的方法，特征在于所述干细胞或先祖细胞的培养在存在小于 15%，优选1_10%，更优选2-5%和甚至更优选3%氧浓度的条件下进行。
22. 用于体外评估针对潜在治疗化合物的细胞反应的方法，所述方法包括使包含按照 权利要求i-io中任一项的细胞的培养物与潜在治疗化合物相接触和评估由所述化合物对所述培养物中存在的细胞引起的作用。
23.按照权利要求1-10中任一项的细胞或其组合，或按照权利要求11的细胞群用于生 成GDNF的应用。
全文摘要
描述了获自颈动脉体的成熟干细胞，其特征在于它们对于表型标记物GFAP(胶质细胞原纤维酸性蛋白)阳性和对于表型标记物TH(酪氨酸羟化酶)和巢蛋白阴性。这些干细胞可以经历增殖、自我更新和分化为先祖细胞和分化细胞。所述通过任何方法增殖的干细胞、先祖细胞和分化细胞可以用于治疗神经变性疾病诸如阿尔茨海默病或帕金森病。
文档编号A61K35/30GK101784654SQ200880101564
公开日2010年7月21日 申请日期2008年8月1日 优先权日2007年8月2日
发明者何塞·洛佩斯·巴内奥, 安东尼奥·奥多内兹·费尔南德斯, 帕特里夏·奥尔特加-萨恩斯, 理查多·帕尔达尔, 维多利亚·欧亨尼娅·博尼利亚·埃纳奥, 罗西奥·杜兰, 胡安·何塞·托莱多·阿拉尔 申请人:塞维利亚大学