一种用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，旨在提供一种同时筛选嗜水气单胞菌复合群、温和气单胞菌复合群、豚鼠气单胞菌复合群3种常见水产源气单胞菌复合群，且成本低，检测准确率高的试剂盒；其技术方案是这样的：该用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，所述的试剂盒由下列鉴定材料组成：1)试剂A-无菌水；2)鉴定瓶1-无盐碱性蛋白胨水；3)鉴定瓶2-含氨苄西林的RS培养基；4)鉴定瓶3-胰蛋白胨大豆培养基；5)鉴定瓶4-阿拉伯糖培养基；6)鉴定瓶5-七叶苷培养基；7)鉴定瓶6-葡萄糖产气培养基；8)鉴定瓶7-氧化酶试纸；属于检测【技术领域】。
【专利说明】—种用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测试剂盒，更具体的说是一种用于分辨嗜水气单胞菌复合群、温和气单胞菌复合群、豚鼠气单胞菌复合群3种常见水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]气单胞菌属于气单胞菌科，广泛分布在水环境，也常在人体、水产动物和食物中检出。水产动物源气单胞菌分成3个复合群，包括嗜水气单胞菌复合群、温和气单胞菌复合群、豚鼠气单胞菌复合群，主要有嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌等，同时也是常见的人鱼共患病原菌，能引起人的食物中毒、腹泻、败血症等。气单胞菌具有广泛的致病性，在高温季节，容易单独或者混合感染包括鱼虾类、贝类、爬行两栖类等多种水产动物，是水产养殖中一种危害性较高的病原菌，容易引起水生动物多种细菌病的暴发，且危害程度高于其它细菌性疾病，成为我国淡水水产养殖业发展的主要威胁(唐江芳，气单胞菌及其在水产中的危害，2007)。而临床上的盲目用药，使病原菌在大范围药物选择压力下，渐渐保留了气单胞菌耐药菌株，甚至是多重耐药菌株，致使抗生素疗效下降(蔡丽娟，等，水产致病性嗜水气单胞菌耐药性比较与分析，水产科学，2011)。这不仅导致药物对水生动物疾病的防控能力大大减弱，同时也严重影响水产动物源食品的质量安全，还存在将耐药性传播给人类致病菌的潜在风险。因此，监测养殖动物和养殖水体中不同气单胞菌复合群的存在及其耐药性是防治相关水产动物疾病和保证食品安全的重要措施，而如何高效简便的分辨出水产源气单胞菌复合群是目前最需解决的问题。
[0003]目前分辨出水产源气单胞菌复合群的技术有:1、通过普通培养基培养纯化单菌落后利用细菌快速自动鉴定系统进行鉴定分辨，该法需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员；2、通过普通培养基培养纯化单菌落后利用核酸的检测技术，包括DNA和PCR技术(聚合酶链式反应技术)，虽然具有快速、简洁和灵敏的特点，但该法需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员；3、经典的生理生化鉴定方法，该法不仅繁琐、耗时、且要求操作人员有良好的专业素质；4、目前也有些商品化的气单胞菌培养基，如RS培养基、AHM培养基和APM培养基等，但分离率和准确率不高(凌红丽，等，嗜水气单胞菌选择性培养基鉴别效果的比较，1998)。
【发明内容】
[0004]针对上述不足，本发明的目的是提供了一种同时筛选嗜水气单胞菌复合群、温和气单胞菌复合群、豚鼠气单胞菌复合群3种常见水产源气单胞菌复合群且成本低，准确率高的试剂盒。
[0005]为此，本发明提供的技术方案是这样的:该用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，所述的试剂盒由下述鉴定瓶和试剂组成:1)试剂A-无菌水；2)鉴定瓶1-无盐碱性蛋白胨水；3)鉴定瓶2-含氨苄西林的RS培养基；4)鉴定瓶3-胰蛋白胨大豆培养基；5)鉴定瓶4-阿拉伯糖培养基；6)鉴定瓶5-七叶苷培养基；7)鉴定瓶6-葡萄糖产气培养基；8)鉴定瓶7-氧化酶试纸。
[0006]上述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，所述的水产源气单胞菌复合群为嗜水气单胞菌复合群、温和气单胞菌复合群和豚鼠气单胞菌复合群。
[0007]进一步的，上述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，所述的无盐碱性蛋白胨水由下述质量百分比的组分构成:蛋白胨1.9-2.1 %，硝酸钾0.0095-0.015%，结晶碳酸钠 0.015-0.025%，余量为水；pH8.2-8.5。
[0008]进一步的，上述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，所述的含氨苄西林的RS培养基由下述质量百分比的组分制成:L-盐酸鸟氨酸0.60-0.70%，L-盐酸赖氨酸0.4-0.6%, L-盐酸半胱氨酸0.02-0.04%，麦芽糖0.30-0.40%，硫代硫酸钠
0.60-0.75 %，枸橼酸铁胺 0.07-0.09 %，脱氧胆酸钠 0.09-0.11%,酵母膏 0.25-0.35 %，氯化钠0.4-0.6%,溴麝香草酚蓝0.002-0.004 %,新生霉素0.0004-0.0006 %,琼脂
1.2-1.8%，氨苄西林 0.0001%，余量为水；pH6.8-7.2。
[0009]进一步的，上述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，所述的胰蛋白胨大豆培养基由下述质量百分比的组分构成:胰蛋白胨1.3-1.7%，大豆蛋白胨0.4-0.6%，氯化钠 0.4-0.6%，琼脂 1.2-1.7%，余量为水；pH7.2-7.6。
[0010]进一步的，上述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，所述的阿拉伯糖培养基由下述质量百分比的组分构成:牛肉膏粉0.4-0.6 %，蛋白胨0.8-1.2 %，氯化钠0.2-0.4 %，磷酸氢二钾0.15-0.25 %，阿拉伯糖0.8-1.2 %，溴百里酚蓝0.002-0.004%，余量为水；pH7.2-7.6。
[0011]进一步的，上述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，所述的七叶苷培养基由下述质量百分比的组分构成:蛋白胨0.4-0.6%，牛肉浸膏0.2-0.4%，七叶苷 0.09-0.11%，枸橼酸铁 0.04-0.06%，琼脂 1.2-1.8%，余量为水；pH7.2-7.6。
[0012]进一步的，上述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，所述的葡萄糖产气培养基由下述质量百分比的组分构成:多价胨1.5-2.5%，酵母膏0.4-0.6%，氯化钠0.4-0.6 %，葡萄糖2.5-3.5 %，吐温-804-6 %，溴百里酚蓝0.002-0.004 %，余量为水；pH6.8-7.2ο
[0013]与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点:
[0014]本发明提供的技术方案是在研究分析现有选择性培养基特性和气单胞菌不同生理生化特性的基础上建立的。通过用3种培养基筛选分离和4个生化反应结果进行归纳判断，能简便分离嗜水气单胞菌复合群、温和气单胞菌复合群、豚鼠气单胞菌复合群3种常见水产源气单胞菌复合群。
[0015]本发明的试剂盒试剂构成、配制方法、使用方法简单，成本低，与细菌自动或半自动快速鉴定系统和基于核酸的检测技术相比，不需要昂贵的仪器设备和技术熟练的操作人员，为筛选分离水产源气单胞菌复合群提供了极大的方便。
【具体实施方式】
[0016]为了更好的理解、实施本发明的权利要求，下面结合具体实施例对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但本发明并不限于下述实施例，而是以权利要求为限。
[0017]实施例1
[0018]本发明提供的一种用于分辨嗜水气单胞菌复合群、温和气单胞菌复合群、豚鼠气单胞菌复合群3种常见水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，具体由下列鉴定瓶和试剂组成:
[0019]I)用于稀释池塘底泥试剂A-无菌水；
[0020]2)用于除去需盐并在酸性和中性环境中均能生长的细菌，特别是弧菌科细菌的鉴定瓶1-无盐碱性蛋白胨水，该鉴定瓶所含组分按质量分数100%计为:蛋白胨2%，硝酸钾0.01%,结晶碳酸钠0.02%,余量为水，ρΗ8.4 ；
[0021]3)用于筛选对氨苄西林不敏感的疑似气单胞菌的鉴定瓶2-含氨苄西林RS培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100 %计为:L-盐酸鸟氨酸0.65 %，L-盐酸赖氨酸0.5%,L-盐酸半胱氨酸0.03%，麦芽糖0.35%，硫代硫酸钠0.68%，枸橼酸铁胺0.08%，脱氧胆酸钠0.1%，酵母膏0.3%，氯化钠0.5%，溴麝香草酚蓝0.003 %，新生霉素0.0005 %，琼脂1.5%，氨苄西林0.0001%,余量为水，pH7.0 ；
[0022]需要说明的是，本培养基现配现用，首先把RS培养基煮沸溶解1-2分钟，待培养基冷却至40-50°C后把氨苄西林加入培养基摇均匀，然后倒制琼脂平板。
[0023]4)用于细菌的培养的鉴定瓶3-胰蛋白胨大豆培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100%计为:胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%，琼脂1.5%，余量为水，ρΗ7.4 ；
[0024]5)用于检查细菌对阿拉伯糖类发酵的特性，观察被检细菌的产酸能力的鉴定瓶4-阿拉伯糖培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100 %计为:牛肉膏粉0.5 %，蛋白胨1%，氯化钠0.3%，磷酸氢二钾0.2%，阿拉伯糖1%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，ρΗ7.4 ；
[0025]6)用于检测细菌对七叶苷的水解能力的鉴定瓶5-七叶苷培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100%计为:含蛋白胨0.5%，牛肉浸膏0.3%，七叶苷0.1%，枸橼酸铁
0.05%,琼脂1.5%,余量为水，ρΗ7.4 ；
[0026]7)用于检测细菌产酸产气的能力的鉴定瓶6-葡萄糖产气培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100 %计为:多价胨2 %，酵母膏0.5 %，氯化钠0.5 %，葡萄糖3 %，吐温-805%，溴百里酚蓝0.003%，余量为水，将所有组分倒置放入直径2-3毫米发酵小管；ρΗ7.0。
[0027]8)用于检查细菌中是否含有细胞色素氧化酶鉴定瓶7-氧化酶试纸。
[0028]上述各个鉴定瓶中的培养基以及试剂A中试剂组份都可以从现有产品中购买到，并可按照公知常规的方法进行配制。
[0029]实施例2
[0030]本发明提供的一种用于分辨嗜水气单胞菌复合群、温和气单胞菌复合群、豚鼠气单胞菌复合群3种常见水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，具体由下列鉴定瓶和试剂组成:
[0031]I)用于稀释池塘底泥试剂A-无菌水；
[0032]2)用于除去需盐并在酸性和中性环境中均能生长的细菌，特别是弧菌科细菌的鉴定瓶1-无盐碱性蛋白胨水，该鉴定瓶所含组分按质量分数100%计为:蛋白胨2.1%，硝酸钾0.015%，结晶碳酸钠0.015%，余量为水；pH8.2 ;
[0033]3)用于筛选对氨苄西林不敏感的疑似气单胞菌的鉴定瓶2-含氨苄西林RS培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100 %计为:L-盐酸鸟氨酸0.60 %，L-盐酸赖氨酸0.6%, L-盐酸半胱氨酸0.02%，麦芽糖0.40%，硫代硫酸钠0.60%，枸橼酸铁胺0.09%，脱氧胆酸钠0.09%，酵母膏0.35%,氯化钠0.4%，溴麝香草酚蓝0.004%，新生霉素
0.0004%，琼脂1.8%，氨苄西林0.0001%，余量为水；pH7.2。
[0034]需要说明的是:本培养基现配现用，首先把RS培养基煮沸溶解1-2分钟，待培养基冷却至40-50°C后把氨苄西林加入培养基摇均匀，然后倒制琼脂平板。
[0035]4)用于细菌的培养的鉴定瓶3-胰蛋白胨大豆培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100%计为:胰蛋白胨1.3%，大豆蛋白胨0.6%，氯化钠0.4%，琼脂1.7%，余量为水；ρΗ7.2。
[0036]5)用于检查细菌对阿拉伯糖类发酵的特性，观察被检细菌的产酸能力的鉴定瓶4-阿拉伯糖培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100%计为:牛肉膏粉0.4%，蛋白胨
1.2%,氯化钠0.2%，磷酸氢二钾0.25%，阿拉伯糖0.8%，溴百里酚蓝0.004%，余量为水；ρΗ7.2。
[0037]6)用于检测细菌对七叶苷的水解能力的鉴定瓶5-七叶苷培养基:按质量分数100%计，蛋白胨0.6%，牛肉浸膏0.4%，七叶苷0.09%，枸橼酸铁0.06%，琼脂1.2%，余量为水；ρΗ7.6。
[0038]7)用于检测细菌产酸产气的能力的鉴定瓶6-葡萄糖产气培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100%计为:多价胨2.5%，酵母膏0.4%，氯化钠0.6%，葡萄糖2.5%，吐温-806 %，溴百里酚蓝0.002 %，余量为水；ρΗ7.2。
[0039]8)用于检查细菌中是否含有细胞色素氧化酶鉴定瓶7-氧化酶试纸。
[0040]上述各个鉴定瓶中的培养基以及试剂A中试剂组份都可以从现有产品中购买到，并可按照公知常规的方法进行配制。
[0041]实施例3
[0042]本发明提供的一种用于分辨嗜水气单胞菌复合群、温和气单胞菌复合群、豚鼠气单胞菌复合群3种常见水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，具体由下列鉴定瓶和试剂组成:
[0043]I)用于稀释池塘底泥试剂A-无菌水；
[0044]2)用于除去需盐并在酸性和中性环境中均能生长的细菌，特别是弧菌科细菌的鉴定瓶1-无盐碱性蛋白胨水，该鉴定瓶所含组分按质量分数100%计为:蛋白胨1.9%，硝酸钾0.015%，结晶碳酸钠0.015%，余量为水；ρΗ8.5 ;
[0045]3)用于筛选对氨苄西林不敏感的疑似气单胞菌的鉴定瓶2-含氨苄西林RS培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100 %计为:L-盐酸鸟氨酸0.70 %，L-盐酸赖氨酸0.4%, L-盐酸半胱氨酸0.04%，麦芽糖0.30%，硫代硫酸钠0.75%，枸橼酸铁胺0.07%，脱氧胆酸钠0.11 %，酵母膏0.25%，氯化钠0.6%，溴麝香草酚蓝0.002 %，新生霉素
0.0006%，琼脂1.2%，氨苄西林0.0001%，余量为水;pH6.8。
[0046]需要说明的是，本培养基现配现用，首先把RS培养基煮沸溶解1-2分钟，待培养基冷却至40_50°C后把氨苄西林加入培养基摇均匀，然后倒制琼脂平板。
[0047]4)用于细菌的培养的鉴定瓶3-胰蛋白胨大豆培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100%计为:胰蛋白胨1.7%，大豆蛋白胨0.4%，氯化钠0.6%，琼脂1.2%，余量为水；ρΗ7.6 ；
[0048]5)用于检查细菌对阿拉伯糖类发酵的特性，观察被检细菌的产酸能力的鉴定瓶4-阿拉伯糖培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100%计为:牛肉膏粉0.6%，蛋白胨
0.8%,氯化钠0.4%,磷酸氢二钾0.15 %，阿拉伯糖1.2 %，溴百里酚蓝0.002 %，余量为水；ρΗ7.6 ；
[0049]6)用于检测细菌对七叶苷的水解能力的鉴定瓶5-七叶苷培养基:按质量分数100%计，蛋白胨0.4%，牛肉浸膏0.4%，七叶苷0.09%，枸橼酸铁0.06%，琼脂1.2%，余量为水；ρΗ7.6。
[0050]7)用于检测细菌产酸产气的能力的鉴定瓶6-葡萄糖产气培养基，该鉴定瓶所含组分按质量分数100%计为:多价胨1.5%，酵母膏0.6%，氯化钠0.4%，葡萄糖3.5%，吐温-804 %，溴百里酚蓝0.004 %，余量为水；ρΗ6.8。
[0051]8)用于检查细菌中是否含有细胞色素氧化酶鉴定瓶7-氧化酶试纸。
[0052]上述各个鉴定瓶中的培养基以及试剂A中试剂组份都可以从现有产品中购买到，并可按照公知常规的方法进行配制。
[0053]具体检测方法为:
[0054](I)样品采集
[0055]①样品要求:
[0056]A:底泥取约3g加入2mL无菌水混匀并静止1min后取100 μ L上层液体；
[0057]B:环境水样(池塘表面下20_30cm) 100 μ L ；
[0058]C:用镊子或剪子取绿豆大小的动物组织样品(鳃、肝脏、病灶);
[0059]②样品处理:
[0060]将以上三类样品分别接种于3ml无盐碱性蛋白胨水中增菌，28°C振荡培养18-20h。剩余样品置4°C保存备用。
[0061]③样品编号。
[0062](2) 3种常见水产源气单胞菌复合群分离与鉴定(在无菌条件下进行操作)
[0063]①筛选培养:
[0064]用接种环蘸取各个样品增菌液，分别接种于含氨苄西林RS平板，28°C静置培养18-20h。若菌落在含氨苄西林RS平板上呈黄色且光滑，则初步判断为气单胞菌疑似菌；
[0065]②分离纯化:
[0066]每个平板挑取同I个优势黄色单菌落，分别接种于含氨苄西林RS平板和胰蛋白胨大豆培养基平板进行纯化，28°C静置培养18_20h ；
[0067]③用接种环取在胰蛋白胨大豆培养基平板上纯化培养的疑似菌，划于氧化酶试纸条，Imin内观察，若划线处呈紫色或者紫红色，为氧化酶阳性；同时挑取适量氧化酶阳性的菌落分别接种于阿拉伯糖培养基、七叶苷培养基、葡萄糖产气培养基，35°C静置培养18-24h，观察培养基颜色的变化和葡萄糖产气培养基小管气体的产生。
[0068](3)结果判定
[0069]若菌株在无盐碱性蛋白胨水生长良好，记为“ + ”，不生长记为菌落在含氨苄西林RS平板上呈黄色且光滑记为“+”，不生长或菌落为绿色或绿黄色记为菌落在胰蛋白胨大豆培养基上生长良好、呈米白色且光滑记为“+”，不生长或菌落为其他颜色记为阿拉伯糖培养基呈黄色记为“+”，紫色记为;七叶苷培养基呈黄色记为“+”，紫色记为；葡萄糖产气培养基中的发酵管有气泡记为“+”，无气泡记为氧化酶实验结果阳性记为“+”，阴性记为。把待检菌各反应结果与细菌鉴定表(表1)对照，如果与鉴定表中的细菌结果一致，则可判断待测菌为相应的复合群菌，因此可确定待检菌的分类位置。
[0070]表1细菌鉴定表
[0071]
【权利要求】
1.一种用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒由下述鉴定瓶和试剂组成:1)试剂A-无菌水；2)鉴定瓶1-无盐碱性蛋白胨水；3)鉴定瓶2-含氨苄西林的RS培养基；4)鉴定瓶3-胰蛋白胨大豆培养基；5)鉴定瓶4-阿拉伯糖培养基；6)鉴定瓶5-七叶苷培养基；7)鉴定瓶6-葡萄糖产气培养基；8)鉴定瓶7-氧化酶试纸。
2.根据权利要求1所述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，其特征在于，所述的水产源气单胞菌复合群为嗜水气单胞菌复合群、温和气单胞菌复合群和豚鼠气单胞菌复合群。
3.根据权利要求1所述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，其特征在于，所述的无盐碱性蛋白胨水由下述质量百分比的组分构成:蛋白胨1.9-2.1%，硝酸钾.0.0095-0.015%，结晶碳酸钠 0.015-0.025%，余量为水；pH8.2-8.5。
4.根据权利要求1所述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，其特征在于，所述的含氨苄西林的RS培养基由下述质量百分比的组分制成:L-盐酸鸟氨酸0.60-0.70 %，L-盐酸赖氨酸0.4-0.6 %，L-盐酸半胱氨酸0.02-0.04 %，麦芽糖0.30-0.40 %，硫代硫酸钠0.60-0.75 %，枸橼酸铁胺0.07-0.09 %，脱氧胆酸钠.0.09-0.11%,酵母膏 0.25-0.35%，氯化钠 0.4-0.6%，溴麝香草酚蓝 0.002-0.004%，新生霉素 0.0004-0.0006%，琼脂 1.2-1.8%，氨苄西林 0.0001%，余量为水；pH6.8-7.2。
5.根据权利要求1所述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，其特征在于，所述的胰蛋 白胨大豆培养基由下述质量百分比的组分构成:胰蛋白胨1.3-1.7%，大豆蛋白胨0.4-0.6%，氯化钠0.4-0.6%，琼脂1.2-1.7%,余量为水；pH7.2-7.6。
6.根据权利要求1所述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，其特征在于，所述的阿拉伯糖培养基由下述质量百分比的组分构成:牛肉膏粉0.4-0.6%，蛋白胨.0.8-1.2%，氯化钠0.2-0.4%，磷酸氢二钾0.15-0.25%，阿拉伯糖0.8-1.2%，溴百里酚蓝.0.002-0.004%，余量为水；pH7.2-7.6。
7.根据权利要求1所述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，其特征在于，所述的七叶苷培养基由下述质量百分比的组分构成:蛋白胨0.4-0.6%，牛肉浸膏0.2-0.4 %，七叶苷0.09-0.11%，枸橼酸铁0.04-0.06%，琼脂1.2-1.8 %，余量为水；ρΗ7.2-7.6。
8.根据权利要求1所述的用于分辨3种水产源气单胞菌复合群的检测试剂盒，其特征在于，所述的葡萄糖产气培养基由下述质量百分比的组分构成:多价胨1.5-2.5%,酵母膏0.4-0.6 %，氯化钠0.4-0.6%,葡萄糖2.5-3.5%,吐温-804-6 %，溴百里酚蓝.0.002-0.004%，余量为水；ρΗ6.8-7.2。
【文档编号】C12R1/01GK104178416SQ201410436513
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】谭爱萍, 吴雅丽, 姜兰, 邓玉婷, 罗理, 王伟利, 梁爱玲 申请人:中国水产科学研究院珠江水产研究所