专利名称：显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治肿瘤放化疗不良反应的药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明是涉及显齿蛇葡萄总黄酮医药新用途，特别是涉及显齿蛇葡萄总黄酮在制备 防治肿瘤放化疗不良反应的药物的应用，具体是作为防治肿瘤放化疗的不良反应和毒副作 用、预防肿瘤发生与肿瘤转移、防治肿瘤治疗中的并发性感染疾病等药物或保健食品。
背景技术：
显齿蛇葡萄".^r^se^/7&^)为葡萄科蛇葡萄属植物，其幼嫩的茎叶和芽经过 加工和干燥，即为白茶，也称为藤茶、田婆茶等。两广地区的白茶除显齿蛇葡萄，还包括 粤蛇葡萄"'ca/ to/ ie57'51)。
显齿蛇葡萄广泛分布于我国的广东、广西、云南、湖南、湖北、江西等省区，其幼 嫩茎叶THT干重中含量达20%以上，系天然植物中生理活性成分单体含量最高的植物之 一。据调査，显齿蛇葡萄即为"藤茶"、"白茶"，是广东省清远的特产，在两广民间食用 记载有1000多年历史。白茶具有清热解毒、祛风除湿、散瘀破结等功效。
显齿蛇葡萄(白茶)中的总黄酮具有多种药理药效作用，申请号01109641. l本发明 公开了一种具有治疗肝炎，保肝护肝，抗菌消炎和增强免疫系统免疫力作用的总黄酮组合 物；申请号200810071687. 2提供富含蛇葡萄素的总黄酮有效部位在制备防治前列腺癌药 物中的应用；申请号01106978. 3公开显齿蛇葡萄总黄酮作为冶疗口腔溃疡的药物及其制 备方法；申请号200410048628.5公开了蛇葡萄属植物及其提取物在制备防治睡眠障碍 药物和保健品中的应用。但上述专利申请未阐明显齿蛇葡萄总黄酮在抑制和清除自由基的 化学损伤而防治机体的化学毒害、预防突变和继发性肿瘤发生与肿瘤转移，也未阐述THT 防治肿瘤放化疗治疗的不良反应、预防肿瘤治疗并发性感染等疾病的药物及保健食品中的 应用。
国内外抗肿瘤的临床药物中，主要包括细胞毒类药物、激素类药物和生物耙向治疗药， 其中的细胞毒类化疗药物包括作用与DNA化学结构的药物(如丝裂霉素、环磷酰胺、顺铀 等)、影响核酸合成的药物(如阿糖胞苷、氟尿嘧啶、巯嘌呤等)、作用于核酸转运的药物 (如放线菌素D、平阳霉素等)、拓扑异构酶I抑制药(如羟喜树碱、拓扑替康等)、作用 于微管蛋白的药物(长春新碱、紫杉醇等)等，这些化疗药物往往对肿瘤患者产生诸多严 重不良反应，包括骨髓抑制、白细胞降低、心肌毒性、肝功能损伤、免疫力低下、抵抗力 降低易引发细菌和病毒性感染、细胞突变和继发性肿瘤、肿瘤转移等。在肿瘤的放疗治疗 中，由于辐射对机体产生显著伤害，也引发了肿瘤患者的多方面的不良反应。化疗药物和 放疗可以抗肿瘤，但本身都或多或少产生一些不良反应，也难以控制和消除不良反应，尤 其是机体突变和继发性肿瘤等。放化疗治疗中，化疗药物在体内引发自由基，或本身能转 化为自由基形式的化学结构，攻击细胞膜脂质、蛋白质和核酸分子，破坏这些大分子的构象和结构稳定性，致使大分子的功能被损害或逐渐失活；由于大分子蛋白的功能失活、核 酸(DNA和RNA)的线性结构断裂，导致基因突变发生，细胞修复功能严重下降，基因突 变的累积将引发新的继发性肿瘤；器官应急反应机能和细胞逆境修复能力降低、化学毒副 作用的累积将导致组织和器官伤害如骨髓抑制与白细胞低下导致免疫力下降而并发性感 染难以控制、毛囊和真皮层损伤而导致脱发或皮疹，消化道和消化器官往往更易受到细胞 毒类化疗药物的毒性作用，引发厌食、呕吐、恶心、体力严重下降等。
肿瘤患者一般免疫力低下，对外源化学物质的应急反应和毒性作用的修复的能力也很 低，因此肿瘤临床治疗中迫切需要既能预防肿瘤发生、控制肿瘤进展和肿瘤转移，又能控 制、减轻或防治肿瘤药物治疗的不良反应，本身却很少产生药物不良反应或毒副作用的新 型防治肿瘤药物。而本发明中提供的显齿蛇葡萄总黄酮作为防治肿瘤放化疗不良反应的药 物，又能抗肿瘤、预防细胞突变和继发性肿瘤与肿瘤转移、感染、或骨髓抑制。
发明内容
本发明的目的是提供显齿蛇葡萄总黄酮(简称THT)在制备防治肿瘤放化疗不良反应 的药物的应用。其化疗优选为细胞毒类药物化疗，所述细胞毒类化疗药物优选为作用于 DNA化学结构的药物、作用于核酸转运的药物、拓扑异构酶I抑制药或作用于微管蛋白的 药物。所述优选为作用于核酸合成的药物为氟尿嘧啶。所述作用于微管蛋白的药物优选为 长春新碱或紫杉醇。所述作用于DNA化学结构的药物优选为环磷酰胺、丝裂霉素或顺铂。
所述防治肿瘤放化疗不良反应为骨髓抑制、血细胞降低、细胞突变、脱发或继发性肿瘤。
所述肿瘤放化疗不良反应为乳腺癌、宫颈癌或肠癌放化疗不良反应，与化疗药物联合 用药提高肿瘤治疗疗效。
所述药物为用药学上可接受的辅料制备的口服固体制剂(包括片剂、胶囊剂、丸剂和 颗粒剂)、口服液体制剂、注射液、冻干粉针剂或大输液剂型。
所述药物用药学上可接受的辅料制备的贴剂、软膏剂、凝胶剂、搽剂、喷雾剂、软胶 囊剂或栓剂。
本发明的还提供THT的制备方法和含量测定的方法。
本发明创造性发现显齿蛇葡萄总黄酮清除自由基、抑制自由基反应链，从而预防、控 制或消除化学药物和辐射对组织细胞和器官的伤害或毒害，也发现THT抗突变和抑制肿瘤 基因表达和引发肿瘤细胞凋亡而防治肿瘤发生、防治继发性肿瘤及转移，还发现THT抑制 病毒转染而防治感染。因此，THT作为防治肿瘤放化疗不良反应的药物，抑制和减轻化学 伤害、防治致突变剂的损害而预防基因突变或继发性肿瘤，将与放化疗联合用药而实现防 治肿瘤放化疗不良反应和预防肿瘤发生。绝大多数肿瘤患者死亡的直接原因并非肿瘤本 身，而是肿瘤放化疗的不良反应及并发性感染等。因此，肿瘤临床治疗的目标是，结合切 除手术，通过药物治疗，有效控制和消除肿瘤，降低放化疗治疗中的不良反应，消除肿瘤 治疗中的并发症，提高患者的生存质量和远期疗效。THT集多种药理与药效作用于一身的 多功能的特点是目前肿瘤临床治疗中单一药物所不具备的，将使得它在肿瘤治疗中得到广
4泛应用。
图1 (a)为用DMPO捕集的光照核黄素/EDTA)体系产生的0—2自由基的ESR特征波谱。 图l (b)为体系中加入THT对该体系产生的C^自由基的ESR特征波谱。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明的实质，通过下面的实施例详细说明本发明，但是应该理解这 些实施例只是说明本发明，而不是在任何方面限制本发明的范围。 实施例1: THT的提取与分离制备
提取工艺方法将干燥的显齿蛇葡萄植物的幼嫩叶和嫩芽的混合物，按l: 8 10的 重量比(原料水)加入纯化水，加热至7(TC浸泡0.5-1小时后，加热至沸腾，保温提 取30 60分钟，趁热以陶瓷膜(30KD截留)切向流超滤，收集提取液；再次按l: 5 1:
8的重量比(干原料水)加入纯化水，加热至沸腾，保温提取20 40分钟，趁热以陶 瓷膜(30KD截留)切向流超滤，合并收集提取液；将提取液减压浓縮至体积为原体积的 20% 40% (或相对密度为1. 06-1. 10)时，加入食用酒精至乙醇终浓度为50% 75%，加热 至沸腾回流保温20 60分钟，压滤或离心去沉淀，回收乙醇后，将滤液冷却静置1 2 天，收集沉积物(将上清液倒出，中间的浑浊液压滤或离心收集沉淀)，此沉积物即为THT 粗提取物；在总黄酮粗提取物中加入适量的纯化水，搅拌混匀，静置1天，收集沉积物， 85'C以下(减压)干燥，获得的干燥物即为THT。粉碎后为浅灰色至黄白色粉末。
实施例2: THT的黄酮含量的比色法测定
1. 原理黄酮化合物中的酚羟基能与Al3+离子形成黄色络合物，特征吸收波长为 314nm。显色浓度与黄酮含量在一定范围内呈线性关系。
2. 仪器和试剂
分析天平，灵敏度0.0001g;紫外-可见分光光度计； 无水甲醇(AR); 5XA1C13溶液；二氢杨梅素(对照标准品)。
3. 检测方法
(1) 标准品溶液的配制将二氢杨梅素标准品置称量皿内，于105'C干燥至恒重， 取出置干燥器内自然冷却，立即精密称取0.0504g，甲醇溶解，定容至50ml。
(2) 标准浓度梯度样液配制分别吸取上述标准品溶液0 (作为空白对照)、2.0、 4.0、 6.0、 8.0、 10.0ml,置10ml容量瓶中，以无水甲醇定容至10ml，摇匀后室温放置 待用。
(3) 比色操作:将标准浓度梯度样液均准确取样0. 3ml，置10ml容量瓶中，移取3. Oml 5XAlCl3溶液混合，加甲醇定容至刻度，摇勾后转入10ml具塞试管内，室温放置。40min 后，以空白对照为参比、在波长314nm测定各样品吸光值，制定标准曲线。
(4) 样品测定精密称取THT约0. 0406g,甲醇溶解定容50ml。按照标准品比色过 程进行测定。
54.结果标准对照品二氢杨梅素的浓度梯度(mg/ml)与吸光值(0D314nm)有很好的 线性关系，其关系式为Y-2.0574x-0.0012[R2=0. 9999，其中x为浓度(mg/ml) ,y为吸光 值(0D314nm)]。测定的THT样品的0D314为1. 598，经计算，其总黄酮的浓度为0. 7761 mg/ml 总黄酮的含量为95. 58%。
实施例3: THT对过氧化特丁烷(T朋P)引起的高铁血红蛋白生成的抑制作用
1、 实验方法
将压积红细胞加入双蒸水，制成1%红细胞的完全溶血液，分别加入各样品组分37。C 温孵30min,加入TBHP使其终浓度达到250uM，继续温孵30min，测定OD咖检测高铁血红 蛋白含量的相对变化。高铁蛋白生成抑制率的计算
生成抑制率=(氧化损伤组0D63。-样品组0D63。)/(氧化损伤组OD咖-对照组0D63。)
2、 实验结果
TBHP在水相中逐渐释放出H202， HA被游离的或血红素中结合的铁催化，通过Fenton
反应产生超氧阴离子和羟基自由基。正常红细胞血红蛋白的ci 、 e肽链的最大光吸收值分
别在540、 577nm，当红细胞受到TBHP的氧化攻击后，部分氧合血红蛋白迅速转换成高铁 血红蛋白，在630nm附近有最高吸收峰。在TBHP的作用下，氧合血红蛋白(其最大吸收 峰在540rnn和575nm处)被破坏，部分被转化为高铁血红蛋白(其最大吸收峰在630ran 处)。如表1所示，THT的添加量与其对高铁血红蛋白生成的抑制作用呈正相关且量效关 系明显。说明THT加入到红细胞的完全溶血液中后，T朋P对氧合血红蛋白的破坏和高铁 血红蛋白的促进生成都受到了抑制作用，氧合血红蛋白的吸收峰升高，而高铁血红蛋白的 吸收峰降低。
表l、 THT对TBHP引起的高铁血红蛋白生成的影响
THT (ug/ml) 高铁血红蛋白生成抑制率(％)
10 9.3
20 17.6
40 31.5
80 37.2
实施例4: ESR技术检测THT对自由基的清除作用
ESR技术是研究自由基和抗氧化剂最直接最有效的方法。为了检测和辨认短寿命自由 基，需将一不饱和的抗磁性物质一自由基捕集剂，加入反应体系，捕捉瞬时自由基，从而 可以得到能用ESR波谱仪在常温下检测到的寿命较长的自由基。 1.材料和方法
材料DMPO(5, 5-imethyl-1-pyrroline-l-oxide)在使用前用活性炭提纯，提纯后无杂 质ESR信号。丙酮、乙酸乙酯、核黄素、二苯基苦基苯肼(DPPH)等试剂均为分析纯。THT 为分离纯化制备。
6ESR测试使用Brucker 200型ESR波谱仪，测试条件为X波段，微波功率20raW,调 制100kHz,调幅O. lmT，扫宽20mT，中心磁场324. 5mT，室温下检测。
利用Fenton反应产生 0H自由基，用DMP0捕集 0H自由基反应体系共50 u L， pH=7.4，其中含有0. 04M DMP0、 0. 01%H202、 0. 025mM FeS04、样品溶液或PBS (磷酸盐缓冲 液PH=7.4)5uL，迅速混匀，吸入石英毛细管中，记录一分钟时的ESR波谱。光照核黄素 产生02—自由基，DMP0捕集(V自由基。反应体系共30uL， pH=7.4，其中含有0. 08M DMPO、 0.3M核黄素、5mM EDTA钠盐、2mM DETAPAC、样品或PBS 5uL，迅速混匀，吸入石英毛 细管中，光照90秒后，进行测试。 2.结果
由Fenton反应产生的羟基自由基的ESR波谱是由4条谱线组成高度比为1: 2: 2: 1 的典型图谱(g-2. 0045， aN=aH=l. 49mT)。加入THT对波谱信号的超精细分裂常数和g值没 有影响，随着THT浓度的增加，其ESR信号强度递减。故用波谱信号第二峰的峰对峰高度 h(mm)表示ESR信号的相对强度。在Fenton反应体系中，加入不同浓度的THT对该体系产 生的羟基自由基进行了清除,清除后的ESR波谱如图l所示。加入不同浓度的THT后，ESR 信号强度明显减小，而且具有明显的剂量依赖效应。
如图la、图b所示，用DMP0捕集光照核黄素/EDTA体系产生的0—2自由基的ESR波谱 是由12条谱线组成的典型图谱(aN二1.42mT， aBH=l. 12mT， aCH=0. 13mT)。加或不加THT 对波谱信号的超精细分裂常数没有影响，仅信号强度不同。如表2所示，加入不同浓度的 THT后，其中(b) (c) (d)的波谱峰高显著降低，随着样品浓度的增加，清除0—2自由基的
在样品浓度为100li g/ml时，已将产生的0—2自由基100%清除。 表2 ESR法检测THT对自由基的清除能力
效果也越来越明显。
加入THT浓度(u g/ml) 20 40 100 200 对照为PBS
清除0H自由基(百分数y。 27.4 50.3 65.5 100 0
加入THT浓度(ng/ml) 3 15 30 100 对照为PBS
清除02自由基(％) 27,2 60.9 79.4 100 0
加入THT浓度Ug/ml)
10
20
对照为无水乙
清除DPPH自由基(％)
40. 5 50. 7 85. 5
100
0
注清除率可以用某样品浓度的峰高除以对照的峰高计算。峰高的计算方法
由基取第二峰的高度，超氧自由基取第一峰，DPPH取第3峰。二苯基苦基苯肼(DPPH)自
由基是一种稳定的以氮为中心的自由基。
THT能够清除超氧自由基、羟基自由基和含氮自由基，是由于他本身的分子结构， 不仅可螯合消除金属离子作为自由基链反应的引发剂，阻止和抑制自由基的产生，而且可 以清除、捕集自由基使其反应链中断，在机体中的细胞及其生化代谢反应中发挥抗氧化作
7用，以此广泛地参与、介导和调节机体，发挥其药理与药效作用。自由基是许多化学物质 和辐射对机体细胞产生伤害或毒害的主要原因。自由基对细胞膜产生损伤、对脂质、蛋白 质和核酸的分子构象实施非特异性氢抽提和化学加成而形成高分子自由基，这些高分子自 由基将和其他的蛋白质高分子形成高分子聚合物或导致核酸线性分子断裂，从而破坏高分 子的结构及功能。
实施例5: THT对HA引起红细胞溶血及MDA生成的作用
1. 方法
取新鲜抗凝人静脉血，3000r/min离心10min，弃上清液，用磷酸盐缓冲溶液(PBS， pH二7.4)洗涤，3000r/min离心10min，重复2次，得到压积红细胞；以PH7. 4 PBS将压 积红细胞配成1%。各取lmliy。红细胞悬液分别加入THT至10、 20、 40、 80ug/ml， 37°C 温育30min，然后分别加入终浓度为300画1/L H202， 37"温孵3小时，3000r/min离心 lOmin，取上清液测定OD54。(A);以压积红细胞，用蒸馏水稀释成1%红细胞，作为完全溶 血的对照，同样处理，测定0D54。(B)。按公式(A/B)X100。/。计算溶血的变化。再取上述反应 混合液检测丙二醛(MDA)的含量(按MDA试剂盒的测定方法)。
2. 实验结果
THT对&02诱导的红细胞溶血以及MDA的生成都有显著的抑制作用。在氧化损伤组中， 红细胞溶血率高达65. 12±3. 13%， MDA生成量高达9. 35±0.20 nmol/ml;当THT浓度为 10ug/ml时，红细胞溶血率降到52. 60±2. 91%, MDA生成量降到7. 98±0.19 nmol/ral; THT 浓度升高到20ug/ml时红细胞溶血率降到36.75±1.43%， MDA生成量降到3.94土0. 14 nmol/ml，相邻THT浓度间，红细胞溶血率及MDA生成量均有极显著差异(P〈0. 01)，且THT 组与氧化损伤组均有极显著差异(P<0. 01)。
表3 THT对H202引起的红细胞溶血及MDA生成的影响
THT (ug/ml) MDA (nmol/ml)
(%)
065.129.35
1052. 617.98
2036. 753. 94
4033.803.36
8030. 963. 15
MDA的实际含量反映了脂质过氧化物的浓度，老年退行性疾病发展的重要原因。
红细胞的溶血率与MDA的生成量有着密切的联系，在THT浓度升高的过程中，它们的 降幅保持一致。红细胞膜在自由基的攻击下引发脂质过氧化反应，MDA是脂质过氧化过程 的中间产物，其生成量是脂质过氧化程度的重要指标；而随着膜脂质过氧化损伤的加剧， 红细胞膜的完整性遭到破坏，最终导致了溶血。由于红细胞溶血率和MDA生成量都是脂质
8过氧化损伤在不同层次上的反映，因此他们之间也表现出了相当的一致性。 实施例6: THT对HA诱导的细胞氧化损伤的抑制作用
Hela细胞以含10y。灭活的新生牛血清、lOOU/ml青霉素、100 mg/ml链霉素以及含 2 mmol/ml谷氨酸盐的DMEM培养基，在5%C02、 37°C、相对湿度95%条件下培养。培养 细胞单层生长、当瓶底细胞的覆盖度达90%时，以0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。每两 天换液一次，仅指数生长期的细胞用于实验研究。
指数生长期的细胞以0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，用含10%新生牛血清的 DMEM培养基稀释，调整细胞密度至2X107ml，以每孔100ul接种于96孔培养板，37°C、 5% C02条件培养24小时。加入THT使其终浓度分别为5ug/ral、 10ug/ml和15ug/ml。温 育30分钟后Hela细胞中加入不同剂量的&02作为氧化损伤剂；
在各个不同的仏02浓度下，HA都能显著降低Hela细胞的活力。当HA的浓度等于或 低于1. 2mM时，THT处理组相对于不加THT组，Hela细胞活力大多得到显著增高且增高程 度与THT的终浓度呈正相关(表4)。
_表4 THT对H2(U秀导的Hela细胞氧化损伤的影响_
不同浓度的THT(ug/ml)的细胞相对活力 H2o2 (mM) -
0 5 10 15
0100±1.32 101.35±4.37 99.29±1.30 97.74±3.66
0.2 81.84±2.67 94.42±4.79 95.21土1.57' 95.62±2. 15'
0.4 58.09±1.81 77. 32±2. 18' 83.47士1.39' 90.37±3. 14'
0.6 36.77±2.20 58.23士4.31' 60.44±4. 14' 71.38土1.63'
1.2 20.01±2.42 21.81±1.37 36.39±3. 19' 40.97±2.65'
2.4 17.81±1.05 18.03±4.91 18.35±2.84 18. 12±3.76
实施例7: THT对骨髓抑制小鼠模型的药效试验-
1、材料和方法
环磷酰胺；THT。昆明鼠，18 22g， 30只，8 12周龄。雌雄不拘，由中山大学实验 动物中心提供。
造模方法环磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠，0.2ml/次，每日一次，连续三次。 动物分组与处理10只/组，
① 造模组环磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠，每日一次，连续三次。
② 正常对照组在其它组注射环磷酰胺时注射生理盐水0.2ml/次。
③ THT组环磷酰胺175mg/kg腹腔注射小鼠，每日一次，连续三次。按照THT 125mg/kg每天灌胃一次，连续10天。观察体征变化。在最后一次THT后的次日处理动物进行观察。采用尾静脉采血，进行血细胞计数。 小鼠处死后，取出股骨，剔除肌肉和结缔组织，剪开股骨两头，用6号针头以RPMI1640 液冲出骨髓细胞，检测骨髓有核细胞数。 2、实验结果
THT对环磷酰胺的骨髓抑制有显著的保护作用(表5)，环磷酰胺组的骨髓有核细胞数 目与对照组相比明显减少，而THT加速损伤骨髓造血功能的恢复。
表5各组外周血象与体征变化
RBC PLT 有核细胞数体重抑皮毛脱
(xio'7l) (xio7l) (xioVl) 制(％) 落
WBC (X10VL)
组别
正常对照組5.4±0.9
4.6±0.7
7.35±0.113
2.08±0.14
极少
造丰莫纟且 2.7±0.6 3.0±0.6 2.45±0.101 1.2±0.3
7.2 多，易
脱落
THT组 4.3±0.5* 4.0±0.5*4.78±0.118* 1.89±0.16* l.f
极少
实施例8: THT的抗突变作用
1、 实验方法
环磷酞胺(CyCloPhosphamide简称CP)、丝裂霉素C(Mitomyein简称MMC) ， N-甲基-N ' -硝基-N-亚硝基胍(N-methyl-N' -nltro-N-nitrosogua-nidine简称MNNG),秋水仙碱。
(1)小白鼠骨髓PCE微核试验将NIH小白鼠随机分成5组，即一个阴性对照组， 3个THT试验组和1个阳性对照组。阴性对照组小鼠每日每只ig 0. 3ml生理盐水，3个 THT给药组分别以20、 40和60mg/kg的THT剂量ig小鼠给药，给药至第7天的同时腹腔 注射100mg/kg剂量的CP， 24h后再以相同剂量的CP腹腔注射小鼠，6h后处死小鼠。阳 性对照组小鼠仅ig生理盐水，腹腔注射CP的时间、剂量既处理与给药组一致。制备小鼠 骨髓细胞微核玻片标本，在光学显微镜下计数嗜多染红细胞(PCE)总数和含微核的PCE数， 当1个PCE中出现2个以上微核均按1个细胞计，并按下列公式计算各组微核细胞率 (丽CF):
MNCF^含微核的PCE数/观察到的PCE总数)X 1000%。 (2)小鼠骨髓细胞染色体崎变(CA)试验动物分组及THT剂量均与"小鼠骨髓细胞 PCE微核试验"相同，所不同的是在给药第7天的同时给药组和阳性对照组小鼠均腹腔注 射1次2mg/kg剂量的MMC，在处死小鼠前3h再腹腔注射4mg/kg剂量的秋水仙碱溶液进 行预处理，按常规法制备骨髓细胞染色体玻片标本。每一实验组镜检观察500-1000个中 期细胞分裂相，记录染色体畸变细胞数和畸变类型，主要观察染色单体断裂，无着丝粒染 色体断片和环状染色体等，然后计算各组的畸变细胞率-含CA的细胞数/观察的分裂中
期细胞数。
2、 实验结果
10(1) THT对由CP诱发小鼠骨髓细胞微核的抑制作用
THT对由CP诱发的小鼠骨髓PCE微核的抑制效应实验表明，高、中和低3个剂量的 THT抗突变试验组CP诱发的小鼠骨髓细胞MNCF显著低于阳性对照组，THT试验组对由CP 诱发的MNCF的抑制率分别为69. 5%， 60. 1%和41. 5%(抑制率=[(阳性对照组的腦CT 一试 验组的顧CF)/阳性对照组的MNCF] X 100%)，在所测的剂量范围内表现出一定的量效关系。
(2) THT对由MMc诱发的小鼠骨髓细胞cA的抑制作用
THT试验组的CA细胞率(CAF)与MMC阳性对照组的CAF比较，均达显著性差异(P〈0. 05)， 低、中和高3个剂量的THT抗突变试验组对由MMC诱发的CAF的抑制率分别为64. 6%，57. 3% 和48. 5%，低剂量THT试验组对CA的抑制效应略高于高剂量组，剂量与效应关系呈负相 关性。
THT的抗突变作用表明其具有抑制致癌物的作用，即具有抗致癌和抗致突变作用，从 而预防机体细胞发生突变和癌变。目前肿瘤的发生大多为致突变化学物质造成机体损伤、 或诱导细胞突变和癌变，因此，THT具有预防肿瘤发生、预防癌症患者在长期化疗中的继 发性肿瘤、控制和减少高致癌条件下的癌变形成等药效作用。
实施例9: THT对荷瘤小鼠辐射损伤的保护作用 1、实验方法
NIH小白鼠;THT。
(1) THT对NIH小白鼠辐照的影响
NIH小白鼠6-7周龄，每组10只，，雌雄兼用，分组包括
① 正常对照组饮服生理盐水；
② 照射组60COY射线照射；
③ 照前饮服O. 1% THT生理盐水溶液，照后不服THT; 照后灌胃(ig) 100mg/kg;
照后ig 200 mg/(bw d)生血宝。照射前7 d均自由饮服。
照射前7d均自由饮服，照射后7 d每天ig. 100 mg/kg，第10天股动脉取血，计数 WBC和RBC，再将各组鼠处死后计数胸腺和脾脏指数。照射:60Co源由华南农大辐照中心 提供，Y射线一次性照射，总吸收剂量为4. 5 Gy,吸收剂量率为0. 97Gy/min。
(2) THT对荷瘤小鼠辐照的影响
18周龄的小鼠，体重22 24g，随机分成6组，每组10只，A组:CK; B组:荷瘤；C
组荷瘤+THT+照射；D组荷瘤+照射+THT; E组荷瘤+照射；F组荷瘤+THT。饲养7d
后，除A组外其余按移植性肿瘤研究法接种。5ml—次性注射器抽取S180腹水癌小鼠腹 水，生理盐水稀释5倍后，每只小鼠注射0.3ml(A组除外)。第2天开始，C组和F组小 鼠每天ig.THT，剂量为100/kg。 15 d后，C、 D和E组进行60CoY射线照射，吸收剂量 为100 cGy。照射后对D组小鼠ig THT(剂量同上)，C组则停止ig. THT。再经15 d后， 脱颈处死，解剖，按前述方法检测红细胞、白细胞、免疫器官指数。2、实验结果
(1) THT对免疫器官辐射损伤影响
Y射线照射后，小鼠胸腺和脾脏严重损伤。小鼠在受照前或后THT ig胸腺指数和脾脏指 数均显著高于对照组。
(2) THT对小鼠造血功能的影响
辐照前ig. THT组和辐照后ig. THT组小鼠的红细胞、白细胞均明显高于照射组(表6)。 表明THT对辐照所致的血象损伤具有明显的防护效应。
表6 THT对辐照小鼠血象的作用
处理组红细胞(xio7l)白细胞(xio7l)
①9. 53±0, 857. 35±0. 59
②4. 45±0. 75tt1. 89±0. 53 #
③5. 47±0. 46*4. 31 ±0. 42*
7.61±0. 53**5. 25±0. 65**
⑤8. 15±0. 53**6. 27±0. 53**
注与照射组比较* p<0.05，** p<0. 01;与对照组比较弁p〈0. 01
(3) THT对荷瘤小鼠照射的影响
小鼠血象和体重增重的实验结果见表7。与A组比较,荷瘤小鼠的3种生理指标均低 于生理盐水对照组,受照射各组的指标达到显著性水平，说明小鼠荷瘤后，体质下降，受照 后下降更明显。F组3种生理指标均高于B组，说明THT对荷瘤小鼠的生活质量具有一定 的保障。C、 D、 F组的白细胞水平都高于E组，且达到显著水平，说明THT对小鼠白细胞的 照射损伤具有显著的保护作用。
表7 THT对辐照小鼠血象的作用 处理组 红细胞(X107L)白细胞(X107L) 体重平均增重(g)
A 5.53土0.40众 5.45±1.25* 5.90士0.82众并A
B 2.45±1.25*tt 2.89±1.13*# 1.51±0.95众#血
C 3.78±1. 10众* 4.55±0.52*# 3.57士0.85众并A
D 3.21±0.65* 4. 19±0.75众# 2.32±0.81**
E 3.55±0.55众 3.46±0.85#A 2.45±1.32*A
F 4. 18±0.50众 4. 75±0.50众 2.85±1.51*众
注与对照组比较* p<0.05,与B组比较众p<0. 01;与E组比较并p〈0. 01;与C组比较Ap〈0. 01 荷瘤小鼠免疫器官实验结果(表8)表明，B组小鼠荷瘤后每克脾脏、胸腺的细胞数 和脾脏指数、胸腺指数显著低于A组空白对照。C、 D禾n F组荷瘤小鼠的4种指标均高于B 组荷瘤小鼠，且差异显著。说明THT能够维持荷瘤小鼠的免疫细胞的增殖生长,并且接近正 常水平。C、 D的4种指标均高于E组,除D的每克胸腺细胞数外，其他都达到显著水平,表 明THT在肿瘤的辐射治疗中保持机体免疫功能具有显著药效作用。
12表8 THT对辐照小鼠血象的作用 处理组 器官指数(mg/10g体重) 免疫器官细胞数(Xl(f个/g)
脾 胸腺 脾 胸腺
A B C D E F
4. 53±0. 40众 2. 41±0. 75 * 4, 28±0. 51众* 4. 59±0. 88众* 2.65±0. 55*A
2. 65±0. 20众1.73±0. 20众#
1. 72±0. 53* 0, 73±0. 35*
2. 85±0. 45众 1.57±0. 32众# 2. 30±0. 53众 1.45±0. 49众# 2. 57±0. 75众 0.93±0.
4. 35±0. 65众# 3. 60±0. 55众 1. 76±0. 15众# 注与对照组比较* p〈0.05，与B组比较众p<0.01;与E组比较并p〈0.01;与C组比较Ap〈0. 01 本试验研究表明THT具有抑制辐射对免疫细胞和免疫器官的损伤与毒害作用，这对于 肿瘤放疗治疗的机体保护、减轻和控制化疗中的不良反应与骨髓抑制、提高机体免疫力的 药效作用。
1. 71±0. 19众
0. 80±0. 41* 2. 05±0. 582众# 1, 49±0. 53*众 1.29土0. 75众A 2.08土0. 52众#
实施例10: THT对人宫颈癌HeLa细胞及移植瘤的抑制和凋亡作用 1、实验方法
人宫颈癌HeLa细胞；BALB/c-nu裸鼠。
RPMI-1640培养基和胰酶(EDTA)美国Gibco公司产品。新生小牛血清购自杭州四季青 生物工程材料有限公司，噻唑蓝(MTT)染液为北京中山公司产品。Annexin V-FITC/PI凋亡 检测试剂盒为Bender Medsystem公司产品。
(1) THT对宫颈癌HeLa细胞的抑制与凋亡作用
宫颈癌HeLa细胞培养于含10%新生小牛血清和双抗的RPMI-1640培养基中，置于 5%C02、 37°C、 95%饱和湿度的恒温密闭孵箱中进行常规培养，每日观察细胞的生长情况。 3d传代l次。在0—80ug/mlTHT浓度递增时，多孔板培养HeLa细胞，3个复孔，MTT 法检测细胞活力，流式细胞仪观察细胞凋亡作用。
(2) THT对宫颈癌HeLa细胞移植瘤的抑制作用
BALB/c-nu裸鼠，4-6周龄，18-22g，雌性，取对数生长期的人宫颈癌Hela细胞(1 X107ml)，在无菌条件下于裸鼠背侧近右后肢处皮下接种，0.2ml/只。接种后第14天可 见肿瘤生长，肿瘤呈菜花状，色红，质硬，可活动，肿瘤长至约50-80mm3，时开始抑瘤实 验。
裸鼠皮下接种肿瘤6 d后，32只小鼠皮下移植处均成瘤，将小鼠随机分成4组。对照 组，生理盐水0.5ml/只；THT组，60mg/kg， 1次/天，ip0.5ml;氟尿嘧啶(5-Fu)组， 30mg/kg， ip， 1次/4d，共6次；THT-5-Fu组，30mg/kg， 1次/天，ipO. 5ml， 5-Fu， 30 mg/kg， ip， l次/4d，共6次。腹腔注射给药，连续用药24d，每只小鼠注射液体量相等， 均为0. 4 mL，第26天处死全部小鼠进行指标检测。
抑瘤率测定:按体质量变化调整给药;接种后每2天测量1次小鼠皮下肿瘤最长径(a)
13和最短径(b)，计算肿瘤体积[V二 (aXb2) /2]，绘制肿瘤生长曲线。接种后第26天脱颈 椎处死小鼠，完整剥离肿瘤称重，计算抑瘤率，抑瘤率=(1-干预组平均瘤质量/对照组平 均瘤质量)X100。/。。 2、实验结果
(1) THT对宫颈癌HeLa细胞的抑制与凋亡作用
THT对人宫颈癌HeLa细胞的增殖具有极显著的抑制作用(表9)。 表9 THT对宫颈癌HeLa细胞活性的抑制作用
细胞活力的抑制率
THT ( ug/ml)
0
10
20
40
60
(%)
0 9.80 15.7 40.6 79.1 89.5
以AnnexinV-PI双标染色流式细胞仪分析THT对宫颈癌HeLa细胞凋亡表明，不同浓 度的THT作用宫颈癌HeLa细胞24、 48、 72h后，细胞凋亡发生率明显增高，随THT浓度 加大和作用时间延长，凋亡率明显增高，与对照组相比具有极显著差异性。THT诱导人宫 颈癌HeLa细胞具有明显的药物浓度依赖性，在同一时间段，随药物浓度的增加细胞凋亡 率增加，两者呈正相关(P〈0.01)。同一浓度不同时间段(24， 48, 72 h)细胞的凋亡率逐渐 增加，80 P g/ml浓度THT作用72 h后的凋亡率最高，己经超过70%。 (2) THT对宫颈癌HeLa细胞移植瘤的抑制作用
接种宫颈癌HeLa瘤细胞后，成瘤率为100%。各组皮下移植瘤的体积逐渐增大，肿瘤 成局部结节状生长，接种后的第l一6天，移植瘤生长速度基本相同，但随后对照组移植瘤 生长明显快于其他给药组。26 d后，THT处理组肿瘤体积及肿瘤质量均低于对照组(P〈0. 01)，而与治疗对照组比较无显著性差异(P〉0. 05)，表明THT对宫颈癌具有显著抗肿瘤作 用(表IO)。
表IO THT对宫颈癌增殖的抑制作用
动物数 瘤体重(g) 抑制率(％) 8 1.351±0.373 /
8 0.406±0.117* 69.9*
8 0.417±0.121* 69.1*
8 0.365±0.101* 72.9*
*P<0.01,相对于阴性对照组。 实施例ll: THT对人乳腺癌裸鼠移植瘤细胞增殖和凋亡作用
1、实验方法
材料健康雌性纯种裸鼠BALB/c(nu/nu)， 4-6周龄，重13-20 g，购自中山大学实 验动物中心。5-氟尿嘧啶(5-Fu); Ki67、 Bcl-2抗体及相关试剂盒购自福州迈新生物技术 有限公司。原位凋亡检测试剂In Situ Cell Death Detection (Pod kit),购自Roche公
处理组 阴性对照 THT 5-Fu
THT-5-Fu组
体征变化 皮毛脱落少 皮毛脱落少 皮毛脱落较多 皮毛脱落少
14司。人乳腺癌细胞株MDA-MB-231; THT。
人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的建立人乳腺癌细胞株MDA-MB-231在含10%胎牛血清的 RPMI1640培养液中培养，传代扩增，收集对数生长期细胞制备悬液，活细胞浓度为IX 107ml。SPF环境下进行实验操作，在每只裸鼠右胸乳腺脂垫内接种细胞悬液0. 2 ml/只(含 细胞数2X106个)，4周左右形成明显可见的移植瘤，32只荷瘤鼠随机分组用药。
动物分组及用药
① 对照组8只，丙二醇O. 1 ml/只，ip，共15 d; 0.9% NS， 0.1 ml/只，ip，共5 d。
② THT组8只，THT60 mg/(kg d)，溶于0. 1 ml丙二醇中，ip，共15 d; 0. 9% NS 0. lml/ 只，ip，共5 d。
③ 5-Fu组:8只，5-Fu30mg/(kg *d)，溶于0. 9% NS 0. 1 ml ， ip，共5 d;丙二醇0. lml/ 只，ip，共15 d。
THT+5-Fu组8只，THT60 mg/(kg d)，溶于0. 1 ml丙二醇中，ip，共15 d; 5-Fu 30 mg/(kg d)溶于0. 9% NS 0.1 ml中，ip，共5 d。
抑瘤率观察每隔2d用游标卡尺测量肿瘤最大长径(a)、横径(b)，计算肿瘤体积， 平均瘤体积-(aXb2)/2，并绘制移植瘤生长曲线；实验结束后，完整剥取肿瘤，称量瘤重。 按以下公式计算药物的抑瘤率抑瘤率=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)X100%。观 察体征变化。
Ki67、 Bel-2表达的检测Ki67抗原采用SP法免疫组化染色，阳性细胞胞核染成棕 黄色。按，下述计算Ki67指数(Ki67-LI):低倍下(X 100倍)确定有代表性的Ki67染色 阳性5个视野，高倍下(X400倍)每个视野数200个肿瘤细胞，其中阳性细胞所占百分比 即为Ki67-LI。 Bel-2采用SP法免疫组化染色，阳性细胞胞浆染成棕黄色。按下述进行结 果判定:观测100个肿瘤细胞中阳性细胞的百分比，其阳性率<10%为(-)，阳性率10%~25% 为(+)，阳性率25%~50%为(++)，阳性率>50%为(+++)。阴性对照均用PBS代替第一抗体。 2、实验结果
MDA-MB-231乳腺癌细胞接种于裸鼠乳腺脂垫，4周左右形成明显可见移植瘤，呈分叶 状或结节状生长。用药期间，裸鼠无死亡。THT组、5-Fu组、THT+5-Fu组抑瘤率分别为 41.5%、 44.6%、 50.3%，以联合用药组肿瘤生长受抑制最明显(表11)。
表ll THT对人乳腺瘤的抑制作用
处理组动物数 瘤体均重(g) ，l自( f
阴性对照 8 0.5221 ±0.131
THT 8 0.3105±0.0703* 40.5
5-Fu 8 0.2890±0.1711* 44.6
THT+5-Fu 8 0.2410±0.1003* 53.8
THT对移植瘤细胞增殖的影响
在光镜下观察肿瘤组织，对照组移植瘤细胞仍保持培养状态下癌细胞原有的异型性，形状不规则，核大深染，核异型，可见异常核分裂相。THT用药组肿瘤细胞呈现不同程度 退行性变，部分肿瘤组织出现明显坏死。Ki67免疫组化显示Ki67抗原表达于乳腺癌细 胞核内，阳性细胞呈棕褐色染色。对照组Ki67-LI高于THT组、5-Fu组、THT+5-Fu组， 有显著性差异(P〈0. 01)(表12)，表明THT用药组肿瘤细胞增殖受到明显抑制，结合光镜分 析，THT对肿瘤细胞也有一定直接细胞毒性作用。
表12药物对肿瘤细胞增殖、凋亡的影响 处理组 动物数 Ki67-LI(%) AI (%)
阴性对照 8 65. 15±3.69.5±2. 1
THT 8 42.93±3.11* 27.5±2. 1*
5—Fu 8 45.07±2.88* 25.4±1.3*
THT +5—Fu 8 40. 10±2.95* 37.8土2.6*A
*P<0.01，相对于阴性对照组；AP〈0.05, 5-Fu和THT处理组间。 THT对移植瘤细胞凋亡的影响
Tunel法检测，在荧光显微镜下见凋亡细胞呈黄绿色荧光细胞，细胞体积缩小铍缩，治 疗组较对照组凋亡细胞明显增多。光镜下见凋亡细胞核染成棕黄色。结果表明THT组、 5-Fu组、THT+5-Fu组凋亡指数明显高于对照组(P<0. 01) ， THT+5-Fu组明显高于THT组、 5-Fu组(P〈0.05) 。 THT可诱导乳腺癌细胞发生凋亡，而联合用药，诱导肿瘤细胞凋亡作 用增强。
乳腺癌组织中Bcl-2免疫组化检测结果
Bel-2蛋白表达于乳腺癌细胞浆，THT组、5-Fu组、THT+5-Fu组明显低于对照组 (P〈0.05)'表明THT可抑制bcl-2基因的蛋白表达(表13)。
表13各组乳腺癌组织Bc卜2蛋白表达 Bel-2表达阴性对照 THT 5-Fu THT +5-Fu
一 1
+ 3 76 7
+ + 4 1 2
+ + + 1
实施例12: THT对亲骨转移乳腺癌细胞肿瘤转移基因骨涎蛋白表达的抑制作用 1、实验材料与方法
MDA-MB-231-BO细胞
DMEM培养液干粉，Gibco公司，胎牛血清。
设置对照组和THT处理组;对照组为含10%胎牛血清培养液培养MDA-MB-231-BO细胞， THT处理组是在对照组的基础上加入20mg/L的THT。其余操作相同。 免疫组化法检测乳腺癌肿瘤细胞骨涎蛋白(BSP虔白的表达。制备MDA-MB-231-B0细胞爬片，采用常规免疫组化SP法检测BSP的表达。待细胞在 载玻片上的融合度达到75 90%，用0. 01 mol/L的PBS冲洗玻片3次，10%甲醛固定30min。 0. 01 mol/L的PBS洗涤，3%的H202甲醇溶液室温下孵育10 min， 0. 01 mol/L的PBS洗 涤，在蜡笔所画的范围内滴一滴试剂B(正常非免疫动物血清)，室温孵育10min，加经1 : 200稀释的50iil—抗(鼠抗hBSP)，室温放置60 90min，对照组仅加抗体稀释液，0.01 mol/L的PBS洗涤，滴加生物素标记的第二抗体(羊抗鼠IgG)，室温孵育10 min， 0. 01 mol/L 的PBS洗涤，滴加1滴试剂D (链霉菌抗生素-过氧化物酶溶液)，室温孵育10 min， 0. 01mol/L 的PBS洗涤，DAB显色，自来水冲洗，苏木精复染，自来水冲洗，乙醇梯度脱水，透明剂 处理2X10min，树胶封片。显微镜下观察，细胞胞质中出现棕黄色颗粒为BSP表达阳性。 2、实验结果与讨论
通过免疫组化法检测BSP蛋白的表达，亲骨转移乳腺癌细胞MDA-MB-231-B0 胞质内有棕色颗粒，表明MDA-MB-231-B0细胞表达BSP。而THT处理的细胞胞质中均无棕 色颗粒，提示细胞BSP表达呈阴性。
骨涎蛋白(bonesialoprotein， BSP)是细胞外基质中的一种酸性糖蛋白，主要分布在 矿质化的组织中，由成骨细胞、破骨细胞以及软骨细胞表达和分泌。已有研究报道乳腺癌 细胞中增加BSP的表达促进乳腺癌细胞骨转移的发生。BSP阳性癌细胞脱离血循环进入骨 髓腔，黏附定位于骨矿质化基质的表面，BSP的RGD序列与aVP3结合，导致乳腺癌细 胞和骨小梁的黏附，活化破骨细胞产生溶骨性骨吸收，促进乳腺癌细胞的骨转移进程。实 验结果提示THT可抑制乳腺癌肿瘤的转移。 实施例13: THT对人肠癌细胞及裸鼠移植瘤增殖抑制作用 1 、实验方法
人结肠腺癌细胞系lovo细胞；THT。
细胞培养1ovo细胞以含10。/。灭活的新生牛血清、双抗的1640培养基，在5%C02、 37°C、相对湿度95%条件下培养。培养细胞单层生长、当瓶底细胞的覆盖度达90%时，以 0.25%胰蛋白酶消化，传代培养。以指数生长期的细胞用于实验研究。
在0—120yg/mlTHT浓度递增时，多孔板培养lovo细胞，3个复孔，MTT法检测细 胞活力，观察THT对肿瘤细胞增殖抑制作用。
人结肠腺癌细胞裸鼠移植瘤的建立人结肠腺癌细胞株lovo在含10%新生牛血清的 RPMI1640培养液中培养，传代扩增，收集对数生长期细胞制备悬液。SPF环境下进行实验 操作，腹背侧部皮下注射含5X106癌细胞的悬液0.5ml，成瘤后用组织块套管针法皮下移 植为实体瘤。将人结肠癌皮下移植的裸鼠随机分为4组，每组8只，雌雄各半。(l)模型 组(阴性对照)，生理盐水0.5ml/只灌胃；(2)THT组，以80mg/kg灌胃；(3)5-Fu组(阳 性对照)，以5-Fu30mg/kg腹腔注射；(4)THT-5-Fu组，以40mg/kg灌胃、并以5-Fu30mg/kg 腹腔注射；在移植后第6天开始给药，5-Fu组给药l次/d,共用6天后停药，THT组给药 l次/d，共6周，对照组给予生理盐水。停药后24h处死，剥离肿瘤块称重，观察抗肿瘤 作用。2、实验结果 (1) THT对肠癌细胞的抑制和凋亡作用
lovo细胞在THT终浓度为20、 40、 60、 80ug/ml时，细胞活力明显下降且各浓度下 细胞活力与阴性对照组比较差异极显著(p〈0. 01)(表14)。
AnnexinV-PI双标染色流式细胞仪分析THT对lovo细胞凋亡的影响不同浓度的THT 作用1ovo细胞72h后，细胞凋亡发生率明显增高，随THT浓度加大和作用时间延长，凋 亡率明显增高，与对照组相比具有显著差异性。
表14 THT对肠癌lovo细胞凋亡的影响(-x土s)
THT(iig/ml) 细胞抑制率(％) 细胞凋亡率(％)
10 1.7±0.3 1.0±0. 1
20 4.2±0.4 1.9±0.3
40 18.0±1.1 8. 1±0.4
80 46.5±0.5 29.9±0.7
89.5±1.1 50.3±0.8
THT诱导人肠癌lovo细胞具有明显的药物浓度依赖性,在同一时间段，随药物浓度的 增加细胞凋亡率增加，两者呈正相关(P〈0. 01)。同一浓度不同时间段细胞的凋亡率逐渐增 加。120" g/m浓度THT作用72 h后的凋亡率达到了 48. 7%。 (2) THT对肠癌细胞裸鼠移植瘤增殖抑制作用
在光镜下观察肿瘤组织，对照组移植瘤细胞仍保持培养状态下癌细胞原有的异型性， 形状不规则，可见异常核分裂相。THT给药组肿瘤细胞呈现不同程度退行性变，部分肿瘤 组织出现明显坏死，表明THT对肠癌肿瘤细胞增殖显著的抑制作用(表15)，联合用药提 高疗效。
表15 THT对肠癌肿瘤增殖的抑制作用
处理组 动物数 瘤体重(g) 抑制率(％)
阴性对照 8 0.951 ±0.473 /
THT 8 0.293±0. 151* 69.1*
5-Fu 8 0.277 ±0.142* 70.8*
THT-5-Fu组 8 0.210±0. 122* 77.8
*P〈0.01，相对于阴性对照组。 实施例14: THT的抑菌作用观察 1、材料 供试细菌
枯草芽孢杆菌(5aciWi;s s"Mj7j'5) 金黄色葡萄球菌(5"帥力y7ococc〃s ai/re"s) 沙门氏菌(5"aJy77cweJJs OoaW)
18月市炎双球菌(尸/ e"/Bococc"50 大肠杆菌(￡scAer_r'c/L 'a ccJ/) 绿脓杆菌 (/^e〃ob/ o朋51 aer收i/305a)
普通培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，自来水(或蒸馏水)1000ml，调 Ph7.2-7.4 (固体培养基另加2%的琼脂)。用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、 沙门氏菌的培养。
加富培养基在普通培养基的无菌液体培养基中加5%的无菌小牛血清。用于培养肺 炎双球菌。
2、 对几种细菌最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定
取20ml三角瓶分别编组编号，除第1瓶外，每一瓶加入3ml培养液；第1瓶内加入 含有THT培养液6ml，吸取3ml加到第2瓶内，充分混匀后，吸出3ml到第3管，依次递 增稀释到第6瓶，第6管充分混匀后吸出3ml混合液弃去。每一瓶内分别加入菌悬液50 Ul (菌液浓度为106-10'个/ml)，摇匀后置37。C摇床培养24h，取出观察结果。阳性对照 和阴性对照设置一瓶培养。从细菌生长少(培养不浑浊)各瓶，继续培养一天后，取培养 菌液涂布琼脂平板培养基，经37'C培养后观察有无生长加以判断。以能抑制细菌生长的 THT最高稀释度为最低抑菌浓度(MIC),以仍没有菌生长的THT最大稀释度为最低杀菌浓 度(MBC)
3、 测定结果
THT对几种细菌均有抗菌作用(表16),最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定结果表 明THT对这些细菌均有杀菌能力。
表16 THT对几种细菌均有抗菌作用
细菌MIC (mg/ml)MBC(mg/ml)
枯草芽孢杆菌1.01. 0
金黄色葡萄球菌0. 500. 50
沙门氏菌1.02.0
大肠杆菌0. 501.0
绿脓杆菌0. 500. 50
肺炎双球菌0.501.0
实施例15: THT对小鼠CC14慢性损伤肝炎的治疗作用 1、材料和方法
动物18-22g雌性BALB/C小鼠，随机分组。禁食6小时后，按0. 5ml/kg体重腹腔 注射CCl4 (10%石蜡油溶液)，每周二次，共八次。
实验分为三组，THT组按120mg/kg体重每日灌胃，正常对照组及损伤对照组给与相 应的生理盐水。最后一次给药第三天杀鼠，取血测定丙氨酸转氨酶(ALT)和血清白蛋白 (g/L)。同时取肝大叶相同部位的一小块肝组织，用10%福尔马林固定后，做病理切片
19检查。
2、实验结果
CC14染毒组，肝小叶周围炎性细胞浸润明显，可见纤维组织增生，小叶中心大部肝 细胞坏死明显，部分肝细胞脂肪变，空泡样变明显THT治疗组的肝组织学改变与CC14
染毒组有明显不同，多数视野未见肝纤维组织增生和明显肝细胞坏死，炎性细胞浸润及脂
肪样变性较轻。血清酶学及血清白蛋白检査结果(表17)，表明THT对CCV漫性损伤小 鼠有显著的保护作用。
表17 THT对CCV漫性损伤小鼠血清转氨酶和血清白蛋白的影响(x±s，n=10)
处理 ALT (U/100ml) 血清白蛋白(g/L)
正常对照组 29. 7土2. 03 48. 53土6. 33
CCl4组 105.95土8.36 33.22土4.31
CC14 +THT 37. 54土5. 16** 42. 85土5. 78林
**P〈0.01与CCU组比较。
CCl4进入体内后，经肝脏细胞色素P450激活，声称三氯甲基自由基(CC1")，通 过氢的吸附而攻击内质网膜上的磷脂分子，引起膜的脂质过氧化，CClr继而与膜脂质和 蛋白质大分子进行共价结合，引起膜结构和功能完整性的破坏，CC13 还可抑制细胞膜和 微粒体膜上钙离子泵的活性，使钙离子内流增加，从而引起细胞中毒死亡。THT可以改善 慢性肝损害肝组织空泡样变性、肝脂肪化和纤维化的形态学改变，明显降低血清中肝转氨 酶和提升血清中白蛋白的含量，保护肝功能。 实施例16: THT片剂的制备
片剂配方THT30-80%，药用淀粉2 —10%，乳糖10%—60%，阿斯巴甜0.2-1%、 硬脂酸镁0.5-1%
将100目过筛的THT1000g和乳糖1000g干粉混合，过80目筛2-3次；加适量的蒸馏 水，将药用淀粉60g加热糊化后、喷洒入混合干粉中，并不断搅拌均匀，制粒，过16目 筛后烘干；按照干粒重量加入IOO目过筛的阿斯巴甜0.5%和硬脂酸镁0.5%，混匀，压 片。片硬度为0. 9-1. 2kg，片重为0.5-1.0g/片。 实施例17: THT胶囊的制备
胶囊剂配方THT30-80%，药用淀粉5 — 30%，乳糖0%—60%，硬脂酸镁0.5-1% 将THT1000g、药用淀粉100g、乳糖200g的干粉混合，过80目筛2-3次；加适量的 蒸馏水，将适量药用淀粉加热糊化后、喷洒入混合干粉中，搅拌均匀，制粒，过16-24 目筛后烘干；按照干粒重量加入硬脂酸镁0.5%，混匀。填充胶囊，粒重0.25-0.75g/粒。 实施例18: THT贴剂的制备
将生橡胶100g切成条状，用压胶机压成网状胶片，去静电、放冷，浸入汽油中约24 小时，使其充分溶胀，再移入配料锅内搅拌约3小时，依次加入松香80g、氧化锌80g、 羊毛脂15g、凡士林15g、液体石蜡10g，混匀，加入THT100g，搅匀，经80目铜丝筛网 滤过，进行涂膏，切段，盖衬，切块，制成1000贴，即得THT贴剂。
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权利要求
1、显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治肿瘤放化疗不良反应的药物的应用。
2、 根据权利要求1所述的显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治放化疗药物不良反应药物的 应用，其特征在于所述化疗为细胞毒类药物化疗。
3、 根据权利要求2所述的显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治放化疗药物不良反应药物的 应用，其特征在于所述细胞毒类化疗药物为作用于DNA化学结构的药物、作用于核酸转运 的药物、拓扑异构酶I抑制药或作用于微管蛋白的药物。
4、 根据权利要求2所述的显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治放化疗药物不良反应药物的 应用，其特征在于所述作用于核酸合成的药物为氟尿嘧啶。
5、 根据权利要求2所述的显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治放化疗药物不良反应药物的 应用，其特征在于所述作用于微管蛋白的药物为长春新碱或紫杉醇。
6、 根据权利要求2所述的显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治放化疗药物不良反应药物的 应用，其特征在于所述作用于DNA化学结构的药物为环磷酰胺、丝裂霉素或顺铂。
7、 根据权利要求1所述的显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治放化疗药物不良反应药物的 应用，其特征在于所述防治肿瘤放化疗不良反应为骨髓抑制、血细胞降低、细胞突变、脱 发或继发性肿瘤。
8、 根据权利要求1所述的显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治放化疗药物不良反应药物的 应用，其特征在于所述肿瘤放化疗不良反应为乳腺癌、宫颈癌或肠癌放化疗不良反应，显 齿蛇葡萄总黄酮与化疗药物联合用药，提高肿瘤治疗疗效。
9、 根据权利要求8所述的显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治放化疗药物不良反应药物的 应用，其特征在于所述显齿蛇葡萄总黄酮与化疗药物联合用药是指用药学上可接受的辅料 制备的贴剂、软膏剂、凝胶剂、软胶囊剂或栓剂。
10、 根据权利要求1所述的显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治放化疗药物不良反应药物的 应用，其特征在于所述药物为用药学上可接受的辅料制备的口服固体制剂、口服液体制剂、 注射液、冻干粉针剂或大输液剂型。
全文摘要
本发明公开了显齿蛇葡萄总黄酮在制备防治肿瘤放化疗不良反应的药物的应用。具体用于制备防治肿瘤放疗与化疗中的不良反应、防治骨髓抑制、脱发、抗突变与防治继发性肿瘤的发生和防治肿瘤转移，作为防治乳腺癌、宫颈癌和肠癌等药物。该应用是基于本发明创造性发现显齿蛇葡萄总黄酮清除自由基、抑制自由基反应链、THT抗突变和抑制肿瘤基因表达和引发肿瘤细胞凋亡而防治肿瘤发生、防治继发性肿瘤及转移以及THT抑制病毒转染而防治感染，实现预防、控制或消除化学药物和辐射对组织细胞和器官的伤害或毒害。
文档编号A61K36/185GK101485791SQ20091003715
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月12日 优先权日2009年2月12日
发明者张晓元, 勇 郭 申请人:华南理工大学