专利名称：Puma在肿瘤放化疗增敏中的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及PUMA基因的新用途，特别是外源PUMA基因或包含有PUMABH3结构域(LRRMADDLN)的cDNA及蛋白的导入在制备增加肿瘤对化疗药物和放射治疗的敏感性药物中的用途。
背景技术：
肿瘤化疗是恶性肿瘤综合治疗中不可缺少的重要手段，已成为某些肿瘤根治的主要方法，手术后(辅助性化疗)和手术前(新辅助化疗)化疗能使部分癌症的治愈率有所提高，可增加局部晚期多种实体瘤的手术切除机会。但是不同作用机制的各种化疗药物(烷化剂、抗代谢类药物、抗肿瘤抗生素类、抗肿瘤的植物类药物、铂类等)均有不同程度的毒副作用，如骨髓抑制、胃肠道反应、心、肺、肝、肾、膀胱、神经毒性等。放射治疗是除手术和化疗以外的最主要的治疗肿瘤的方法，但它对增殖较慢的或失去增殖能力的组织有较大的毒副作用，如肺放射性纤维化、脑和脊髓的放射性坏死。这些毒副作用严重影响了放、化疗在临床中的应用，寻找一种可以增强放、化疗疗效、减低其治疗剂量，从而减轻其毒副作用的物质是医务工作者孜孜以求的目标。
现在，人们已知放疗和大多数化疗药物主要都是通过诱导细胞凋亡来清除肿瘤细胞的。外源促凋亡相关基因的导入有可能起到增加放、化疗敏感性的作用，这在人们以往的对p53的研究中已得到证实。
PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)是2001年报道的新发现的Bcl-2蛋白家族一员，因其可被p53快速诱导并具有强大促凋亡作用而得名。它通过BH3结构域与其它Bcl-2家族蛋白相互作用，诱导细胞色素c释放，引起凋亡。PUMA蛋白定位于线粒体膜上，BH3结构域(141-149位氨基酸，LRRMADDLN)是诱导凋亡所必不可少的，而C端43个氨基酸残基(151-193位)是其在线粒体定位和诱导凋亡所必需的。仅含C端93个氨基酸残基的PUMA表达结构诱导凋亡的水平与全长PUMA蛋白的接近。PUMA诱导凋亡的能力是快速强大的，表达p53的人大肠癌DLD1细胞比表达PUMA的DLD1细胞凋亡形态学改变出现晚9小时(如染色质聚集，核片断化)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种PUMA基因或包含有PUMA BH3结构域的cDNA及蛋白在制备增加放、化疗敏感性药物中的新用途。换言之，本发明在于提供一种肿瘤放、化疗增敏剂。
本发明所述的化疗药物包括，但不限于铂类cDDP(cisplatin顺铂)、CBP(carboplatin卡铂)、L-OHP(Oxaliplatin奥沙利铂)、NDP(Nedaplatin奈达铂)等。
微管抑制剂PTX(Taxol紫杉醇)、TXT(Taxotere泰索帝)、VLB(Vinblastine长春碱)、VCR(Vincristione长春新碱)、VNR(Vinorelbine长春瑞宾)等。
抗代谢类5-Fu(5-Fluorouracil五氟尿嘧啶)、6-TG(Thioguanine硫鸟嘌呤)、AG337(Nolatrexed洛拉曲克)、FT-207(Tegafur替加氟)、HCFU(Carmofur卡莫氟)、5`-DFUR(Doxifluridine氟铁龙)、UFT(优福定)、Ara-C(Cytarabine阿糖胞苷)等。
拓扑异构酶II抑制剂VP16-213(etoposide鬼臼乙叉甙)、VM-26(teniposide鬼臼噻吩甙)等。
蒽环类抗肿瘤抗生素ADR(adriamycin阿霉素)、DAM(daunomycin柔红霉素)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、表阿霉素(epirubicin)、去甲柔红霉素(idarubicin)、米托蒽醌(mitoxatrone)等。
优选的是顺铂cDDP、紫杉醇taxol、五氟尿嘧啶5-Fu、奥沙利铂Oxaliplatin、鬼臼乙叉甙etoposide、阿霉素adriamycin。
本发明所述的放射治疗包括但不限于γ射线。
本发明所述的药物是PUMA基因导入载体或包含有PUMA BH3结构域的cDNA及蛋白形成的药物。
本发明可以采用本领域技术人员公知的各种基因导入载体，可以采用腺病毒介导将外源PUMA基因(Ad-PUMA)及缺失BH3结构域的PUMA基因(Ad-ΔBH3)导入的系统，经过体外细胞系、体内人癌裸鼠肿瘤模型，证实Ad-PUMA的协同化疗药物和放射治疗、增强抗肿瘤疗效的作用，而由缺失BH3结构域的PUMA基因构建的Ad-ΔBH3则不具备上述功能。所述的载体并不局限于复制缺陷型腺病毒载体，还可以包括其他各种外源基因导入的方法，如基因枪、脂质体法、受体介导的转导等，以及其它病毒载体系统，所述的其它病毒载体包括，增殖型腺病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、痘苗病毒等。成功导入包含有PUMA BH3结构域的cDNA及蛋白也可起到增加放、化疗敏感性的作用。
PUMA或其BH3结构域能增敏的化疗药物也不局限于下面实验中所列举的几种。
通常Ad-PUMA的使用包括对于小鼠的治疗实验可根据不同情况(肿瘤大小、治疗次数、间隔时间等)采用不等剂量一般5×108PFU～5×109PFU/次，可每天一次连续给药5次，也可每两天或三天给药一次共三次。
本领域技术人员熟知Ad-p53对于人体的治疗用药剂量，治疗组给药剂量、间隔时间不等，按其产品说明书描述为每周一次，每次1012VP(相当于3.3×1010PFU)，瘤组织局部多点注射。
本发明的Ad-PUMA可参考Ad-p53的使用剂量与用药方式。
本发明通过一系列体外、体内实验证实导入外源PUMA基因，在多种不同组织类型的包括乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和食管癌等实体肿瘤中，可增强多种不同作用机制的化疗药物和放射治疗的抗肿瘤作用，外源PUMA基因缺失BH3结构域后则不具备该功能，而且PUMA的导入与化疗药物的协同增效比p53基因的导入更显著。外源PUMA的导入并不改变各种化疗药物本身对肿瘤细胞的细胞周期的影响，这种协同作用是由于诱导凋亡的协同引起的。
图1A显示Ad-PUMA联合放化疗显著抑制A549细胞生长。
图1B显示不同剂量的化疗药单独或与Ad-PUMA联合处理A549细胞后的细胞生长率。
图2A显示Ad-PUMA显著增强阿霉素诱导的A549细胞凋亡。
图2B显示Ad-PUMA显著增强γ射线诱导的A549细胞凋亡。
图3显示不同病毒感染食管癌细胞72h后细胞存活率。
图4显示KYSE150细胞平板集落形成情况。
图5显示不同因素处理48h后KYSE-150细胞周期的变化。
图6A显示DAPI染色后的细胞核形态。
图6B显示50MOIAd-PUMA感染KYSE150不同时间点凋亡细胞百分比。
图6C显示200MOIAd-p53感染KYSE150不同时间点凋亡细胞百分比。
图6D显示Ad-PUMA与化疗药联合作用36hr各组凋亡细胞百分比。
图7表示采用PUMA的特异性引物(上游5’＞GTCCTCAGCCCTCGCTCT＜3’下游5’＞CTGCTGCTCCTCTTGTCTCC＜3’)检测PUMA在mRNA水平的改变电泳图。
图8显示KYSE150裸鼠移植瘤生长曲线图。
图9显示剥离的KYSE150裸鼠移植瘤组织。
图10A显示Ad-PUMA显著抑制肺癌细胞生长。
图10B显示PI染色法检测Ad-PUMA感染H1299肺癌细胞后细胞的形态改变。
图10C显示流式细胞仪检测Ad-PUMA感染H1299肺癌细胞后凋亡细胞百分比。
图11显示Ad-PUMA比Ad-p53抑制细胞生长更显著。
图12A显示A549裸鼠移植瘤生长曲线图。
图12B显示Ad-PUMA抑制A549裸鼠移植瘤生长。
图12C显示H1299裸鼠移植瘤生长曲线图。
图12D显示Ad-PUMA显著诱导H1299裸鼠移植瘤组织凋亡。
具体实施例方式
实施例一各种肿瘤细胞系中Ad-PUMA与化疗药物联合作用的研究方法采用本领域技术人员公知手段获得PUMA基因，并将其导入腺病毒，得到Ad-PUMA(腺病毒-PUMA)。然后将对数生长期的以下各种肿瘤(乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、胰腺癌)细胞系细胞接种于96孔板，根据不同细胞系间细胞体积的差异调整接种的细胞数，培养过夜。所述的Ad-PUMA(腺病毒-PUMA)感染细胞前，弃去原培养基，用PBS轻轻洗3遍，加入100μl含一定量Ad-PUMA的无血清RPMI1640培养基，使其达到一定感染复数(multiplicity of infection)，即平均每个细胞中有一定数目的有感染能力的Ad-PUMA病毒颗粒。由于每种细胞系对Ad-PUMA的敏感度存在差异，各细胞系间的感染复数有所不同。将96孔板放置于37℃、5％CO2孵箱培养90min，期间每隔15min十字型轻轻晃动培养皿一次，使病毒液分布均匀。然后不同孔中分别加入含一定浓度化疗药物的RPMI1640完全培养基(含10％FBS、100U/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素)。所加入化疗药物的浓度的确定原则是该化疗药物单独作用时对细胞的生长抑制率＜60％。其中HeLa、SiHa、MGC803、A549、P3细胞系中cDDP、taxol、5-Fu的浓度分别为5μM、5nM、10μM；BEL7402细胞系中5-Fu的浓度为20μM，余同前；MCF-7细胞系中cDDP、taxol、5-Fu的浓度分别为2μM、2nM、10μM.药物处理72hr后采用MTT法用酶标仪检测各孔细胞的吸光度，计算各处理组细胞生长的抑制率。每一处理组设3个平行孔，重复实验2-3次。
结果见表1。
在不同组织类型的肿瘤细胞系中(乳腺癌、宫颈癌、肝癌、肺癌和胰腺癌)，外源导入PUMA基因(Ad-PUMA)可增强多种不同作用机制的化疗药物(如顺铂cDDP、紫杉醇taxol、五氟尿嘧啶5-Fu等)的细胞毒作用。与低剂量的Ad-PUMA联用后，化疗药物对细胞的生长抑制率分别增长了10.39％～54.51％，其中宫颈癌细胞系SiHa对Ad-PUMA最为敏感，只要外源导入2MOI的Ad-PUMA，即平均每个SiHa细胞中有2个有感染能力的重组PUMA腺病毒颗粒，便可显著增强各种化疗药物的细胞毒作用。
表1不同处理组细胞生长抑制率(％)
实施例二肺癌细胞系中Ad-PUMA与化疗药物协同作用及其机制的研究1.Ad-PUMA显著降低A549肺癌细胞中不同化疗药的IC50Ad-PUMA10MOI感染A549细胞，24hr后用不同浓度的Taxol、Cisplatin、5-FU、Etoposide和Adriamycin处理细胞，继续培养48hr后采用MTS法检测各孔细胞的吸光度，同时检测各化疗药单独作用的吸光度值，以未处理细胞作为对照，计算各处理组细胞生长率，计算各化疗药单独及联合Ad-PUMA的IC50。每一处理组设3个平行孔，重复实验3次。
结果在A549肺癌细胞系中Ad-PUMA可显著降低各种化疗药的IC50，最少可将其降至原来的1/3(Adriamycin0.76μg/ml降至0.22μg/ml)，最高可使IC50低于原来的1/10(Taxol和5-FU)(表2)。这说明Ad-PUMA在各肺癌细胞系中均具有显著的化疗增敏作用。
表2A549细胞中化疗药单独及与Ad-PUMA联合作用的IC50
2.Ad-PUMA增强肺癌细胞系A549对化疗敏感性的研究采用与实施例一相同的方法获得Ad-PUMA，以10MOI的感染强度感染A549细胞，24hr后进行不同处理Taxol5nM；5-FU5-Fluorouracil，25μg/ml；OxaOxaliplatin，25μM；CisCisplatin，25μM；EtpEtoposide，2μM；AdrAdriamycin，0.2μg/ml。继续培养48hr后采用MTS法检测各孔细胞的吸光度，以各化疗药单独作用时对细胞生长的抑制率为参照，计算Ad-PUMA与各化疗药联用后相对的细胞生长抑制倍数。并将各化疗药单独及与Ad-PUMA联合作用的剂量效应趋势进行显著性检验。每一处理组设3个平行孔，重复实验3次。结果见附图1A、B，Ad-PUMA与各化疗药联用后细胞生长抑制率是单独给予化疗药的2-8倍不等。采用GraphPadPrism IV统计软件对剂量效应趋势图进行检验，可见Ad-PUMA与各化疗药合用对细胞的生长抑制显著强于各化疗药单独作用(P＜0.05)。这表明Ad-PUMA具有增强肺癌细胞系A549对化疗药物敏感性的作用。
3.肺癌细胞系中Ad-PUMA增强其化疗敏感性的机制的研究A549细胞经10MOI Ad-PUMA或Ad-ΔBH3感染24小时后，加Adriamycin 0.2μg/ml后在指定时间点收集悬浮和贴壁细胞，通过PI染色检测核片段化计数凋亡细胞百分比。每次计数至少300个细胞，重复试验3次，取均值。如图2A所示，单独用Ad-PUMA(10 MOI)或Adriamycin(0.2μg/ml)处理A549细胞72小时未诱导显著的凋亡，而二者联合处理A549细胞72小时则近90％的细胞发生凋亡。相同剂量的Ad-ΔBH3联合化疗药Adriamycin则未对后者诱导凋亡的能力产生影响。由此可见，BH3结构域是PUMA发挥其化疗增敏作用所必需的，细胞中成功表达BH3结构域便可显著增强化疗诱导凋亡的能力。
实施例三食管癌细胞系中Ad-PUMA与化疗药物协同作用及其机制的研究1.Ad-PUMA抑制不同食管癌细胞系生长增殖作用的研究采用与实施例一相同的方法获得Ad-PUMA，分别以不同感染强度(500MOI～5MOI)的Ad-PUMA、Ad-p53(商品名“今又生”，为重组人p53腺病毒注射液——深圳市赛百诺基因技术有限公司生产，阳性对照)、Ad-GFP(带绿色荧光蛋白基因GFP的腺病毒，阴性对照)感染各种食管癌细胞，72hr后采用MTT检测各孔细胞的吸光度，计算各处理组细胞生长率。每一处理组设3个平行孔，重复实验3～4次。
结果见附图3。可见，在食管癌细胞系KYSE150、KYSE410、YES2、KYSE510中感染强度相同，作用时间相同时，Ad-PUMA对细胞的生长抑制率显著高于Ad-p53，其中KYSE150细胞对Ad-PUMA最为敏感，50MOI的Ad-PUMA感染细胞72小时便可抑制63.73％的细胞生长，而在相同的感染时间200MOI的Ad-p53对细胞的生长抑制率只有51.37％。
2.食管癌细胞系中Ad-PUMA与化疗药物抑制增殖的协同作用采用如前所述的MTT法检测各种化疗药单独作用各食管癌细胞系72hr的50％抑制剂量IC50(inhibitory concentration of 50％)。然后用固定剂量的Ad-PUMA与各化疗药联合作用，计算作用72hr后在各食管癌细胞系中达到50％生长抑制时的药物浓度。固定的Ad-PUMA剂量选取原则为该剂量Ad-PUMA单独作用72hr细胞生长抑制率＜10％。根据公式(combination index＝Ac/Ae+Bc/Be，Ae和Be分别为两因素各自单独作用达到50％生长抑制时的浓度，Ac和Bc则分别为两因素合用达到50％生长抑制时的各自浓度)计算合用指数，该指数＜1为协同，＝1为相加，＞1为拮抗。结果见下表3
表3食管癌细胞系中Ad-PUMA与化疗药抑制增殖的协同作用(IC50)
由此可见，较低感染复数的Ad-PUMA即可显著增强各种化疗药物的敏感性，在各细胞系中化疗药物与Ad-PUMA合用后，IC50均有不同程度的降低(KYSE-510中的taxol除外)。根据计算出的合用指数可以看出，Ad-PUMA与各种化疗药均存在一定的协同作用，并且其中50％的合用指数＜0.5，表明协同作用十分显著。
3.Ad-PUMA与化疗药物联合抑制KYSE-150细胞平板集落形成采用平板集落形成实验验证Ad-PUMA与各种化疗药的协同作用，结果见附图4。可见2MOI Ad-PUMA与小剂量化疗药(1μM cDDP、0.5nM taxol、2μM 5-Fu)联合作用便可显著降低KYSE-150细胞的集落形成。
4.外源导入PUMA对细胞周期的影响收集不同处理因素作用48hr后的KYSE150细胞，应用BD公司的FACSCalibur流式机，采用Cell Quest Mod Fit LT for Mac V3.0分析软件检测细胞周期，结果见附图5，5MOI Ad-PUMA感染细胞48小时细胞周期的分布与对照的相同，2nM taxol和10μM 5-Fu单独作用48小时细胞周期分别特异性的阻滞在G2/M期和S期，而5MOI的Ad-PUMA与上述化疗药物联合应用48小时，细胞周期的分布基本与各化疗药单独作用时一致。可见，外源PUMA的导入并不改变各种化疗药本身对肿瘤细胞细胞周期的影响。
5.DAPI染色法检测Ad-PUMA与化疗药物单独及联合作用的凋亡细胞百分比收集不同处理因素各相应时间点的细胞，采用DAPI(4′-6-Diamidino-2-phenylindole)染色法检测凋亡细胞百分比。如附图6A所示，荧光显微镜下观测DAPI染色后正常的细胞核核膜光滑，染色质分布均匀；而凋亡的细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状、出现凋亡小体。根据DAPI染色后计数的凋亡细胞率曲线来看50MOI Ad-PUMA感染KYSE150细胞18小时即有50.44％的细胞出现凋亡的细胞核的改变，而200MOI Ad-p53感染细胞48小时仅有47.98％的细胞呈现明显的凋亡的细胞核的改变(见附图6B、C)。5MOIAd-PUMA、4μMcDDP、2nM taxol、10μM 5-Fu单独作用细胞36小时分别有19.46％、9.62％、9.94％、13.71％的细胞出现凋亡，而当上述三种化疗药仍以相同的浓度与5MOI Ad-PUMA联合作用36小时，凋亡的细胞百分比则分别达到32.99％、34.72％、39.30％(见附图6D)。这表明低感染强度的Ad-PUMA与化疗药联合应用便可显著增强化疗药物诱导细胞凋亡的效果。
6.RT-PCR检测Ad-PUMA与小剂量化疗药物联合作用后PUMA的表达水平收集5MOI Ad-PUMA单独、及与小剂量化疗药(4μM cDDP、2nM taxol、10μM5-Fu)联合作用36hr后的KYSE-150细胞，提取总RNA，经逆转录后，采用PUMA的特异性引物(上游5’＞GTCCTCAGCCCTCGCTCT＜3’下游5’＞CTGCTGCTCCTCTTGTCTCC＜3’)检测PUMA在mRNA水平的改变，结果见附图7。可以看出，Ad-PUMA和小剂量各种化疗药均能使细胞PUMA mRNA表达，而联合作用后PUMA在mRNA水平表达增高得更加明显。
实施例四KYSE-150裸鼠移植瘤模型证实Ad-PUMA与化疗药物协同作用1.KYSE-150裸鼠移植瘤模型的建立将对数生长期的KYSE-150细胞消化后离心去除消化液，用含双抗的Hank’s液洗2次，离心、计数，调整细胞浓度为1×107/ml，取200μl细胞悬液接种于裸鼠右腋下。裸鼠共35只，4～5周鼠龄，体重14g～16g，雌性。
2.移植瘤生长曲线待肿瘤长径达5mm～7mm时，随机将裸鼠分为7组。调整Ad-PUMA、Ad-p53滴度，使其达2×1010PFU/ml，每3天瘤体内注射一次，每次50μl，共三次。cDDP采用腹腔注射，按3mg/kg体重给药，给药时间同腺病毒。从治疗前一天开始，每3天用游标卡尺测量皮下移植瘤的长径(a)和短径(b)，按公式计算瘤体积V＝a×b2/2，绘制移植瘤的生长曲线，见附图8。可见，Ad-PUMA单独给药即可显著抑制移植瘤的生长，联合cDDP后肿瘤生长更为缓慢，相同剂量的Ad-p53单独及联合cDDP给药抑瘤效果均不如Ad-PUMA明显。
3.移植瘤重量的测定在用药的第18天处死裸鼠，剥取肿瘤组织(见附图9)，称取瘤重，计算抑瘤率。详细资料见下表表4不同处理组的瘤重及抑瘤率
从各组移植瘤的重量仍可以看出，Ad-PUMA单独给药即可达到48.24％的抑瘤率，联合cDDP后抑瘤率可达56.24％，与对照组相比差异十分显著，P值分别为0.001和＜0.001。尽管相同剂量的Ad-p53与cDDP联合给药抑瘤效果也显著(P＝0.014)，但其抑瘤率只有32.68％。Ad-PUMA或Ad-p53与cDDP联合给药组与单独注射腺病毒组相比，瘤重差异均不显著(P值分别为0.223、0.606)，这可能是本研究采用的cDDP剂量低，导致联合作用后的效果不甚明显。
实施例五肺癌细胞系中Ad-PUMA与放射治疗协同作用及其机制的研究1.肺癌细胞系中Ad-PUMA增强其放疗敏感性的研究采用与实施例一相同的方法获得Ad-PUMA，以10MOI的感染强度感染A549细胞，24hr后接受8Gy的γ射线照射。继续培养48hr后采用MTS法检测各孔细胞的吸光度，以单独γ射线照射对细胞生长的抑制率为参照，计算Ad-PUMA与放射治疗合用后相对的细胞生长抑制倍数。每一处理组设3个平行孔，重复实验3次。结果见附图1A，Ad-PUMA与放疗联用后细胞生长抑制率是单独放疗处理8倍以上。这表明Ad-PUMA具有增强肺癌细胞系A549对放疗敏感性的作用。
2.肺癌细胞系中Ad-PUMA增强其放疗敏感性的机制的研究A549细胞经10MOI Ad-PUMA或Ad-ΔBH3感染24小时后，经8Gyγ射线照射后在指定时间点收集悬浮和贴壁细胞，通过PI染色检测核片段化计数凋亡细胞百分比。每次计数至少300个细胞，重复试验3次，取均值。如图2B所示，单独用Ad-PUMA(10MOI)或γ射线(8Gy)处理A549细胞48小时未诱导显著的凋亡，而二者联合处理A549细胞48小时则近70％的细胞发生凋亡。但相同剂量的Ad-ΔBH3联合γ射线则未对后者诱导凋亡的能力产生影响。由此可见，BH3结构域是PUMA发挥其放疗增敏作用所必需的，细胞中成功表达BH3结构域便可显著增强放疗诱导凋亡的能力。
实施例六体内、外实验证实BH3结构域是PUMA发挥其功能所必需的1.Ad-PUMA通过诱导凋亡显著抑制各种肺癌细胞生长，而Ad-ΔBH3无效采用与实施例一相同的方法获得Ad-PUMA，Ad-ΔBH3(缺少氨基酸序列为LRRMADDLN的BH3结构域，余与PUMA相同)，分别以100MOI的感染强度感染A549、Calu 1、128.88T、H1299、H1752、DMS53肺癌细胞。感染后48小时，采用MTS方法检测细胞生长。以未处理的细胞为对照，视其生长率为100％。为阐明Ad-PUMA、Ad-ΔBH3对细胞生长抑制效果的差异的机制，我们在病毒感染H1299细胞后48小时用PI(碘化丙锭)对其进行核染，在相差显微镜和荧光显微镜下进行观察。并且于Ad-PUMA、Ad-ΔBH3(100MOI)感染H1299细胞24小时后，进行PI和Annexin V/DAPI染色，利用流式细胞仪检测亚G1期细胞百分比和早期凋亡细胞百分比(R4，右下区)。
结果在所检测的6种肺癌细胞系中，与未处理的细胞相比Ad-PUMA均可引起显著的生长抑制(60％--100％)，而Ad-ΔBH3对细胞生长均无显著影响(附图10A)。Ad-PUMA感染的细胞呈现出明显的细胞膜发泡，染色质凝集，核片断化等凋亡特征(附图10B)，而Ad-ΔBH3感染的细胞则不出现上述特征。细胞周期分析和Annexin V染色均证实Ad-PUMA诱导的凋亡显著，分别为43％和56％，相同情况下Ad-ΔBH3感染的细胞则分别只有2.4％和8％的细胞出现凋亡(附图10C)。这说明外源导入PUMA通过诱导凋亡可显著抑制肺癌细胞的生长，位于PUMA(全长193个氨基酸)氨基酸序列141至149位的BH3结构域具有强大的促凋亡作用，是PUMA发挥其促凋亡作用所必需的。
2.Ad-PUMA、Ad-p53对H1299和A549细胞生长抑制的比较H1299和A549细胞被指定感染复数的Ad-PUMA，Ad-p53或感染(H1299细胞0、2、5、10MOI；A549细胞0、20、50、100MOI)48hrs，以未处理细胞作为对照，采用MTS方法进行检测，计算Ad-PUMA、Ad-p53、Ad-ΔBH3在不同感染复数下的相对生长率。由附图11可见，10MOI Ad-PUMA感染H1299后48小时，约15％的细胞存活；100MOIAd-PUMA感染A549细胞后48小时，约40％的细胞存活。各相应剂量的Ad-p53对细胞生长均无显著影响，Ad-ΔBH3则对细胞生长基本无影响。这表明相同剂量的Ad-PUMA比Ad-p53的疗效更显著，而缺失BH3结构域则使其功能丧失。
3.体内实验证实BH3结构域是PUMA发挥其功能所必需的为检验外源导入的PUMA(Ad-PUMA)及缺失BH3的PUMA(Ad-ΔBH3)在体内是否有抗肿瘤活性，我们将4×106个A549或H1299肺癌细胞注射入5-6周龄胸腺缺失的雌性裸鼠两侧部皮下，当肿瘤长至50-100mm3时开始治疗实验，每次瘤内注射含有5×108pfuAd-PUMA或Ad-ΔBH3的100μl PBS溶液，每隔一天治疗一次，共三次。为避免不同动物间潜在的个体差异对病毒疗效的影响，Ad-PUMA和Ad-ΔBH3被分别注射至同一只裸鼠不同侧部的肿瘤。将第一次治疗时记为0天，每2天用游标卡尺测量皮下移植瘤的长径(a)和短径(b)，按公式计算瘤体积V＝a×b2/2，绘制移植瘤的生长曲线，见附图12A。与单独注射PBS相比Ad-ΔBH3对肿瘤生长无显著影响，在治疗后的22天肿瘤体积达到初始体积的8倍。给予Ad-PUMA治疗的肿瘤生长缓慢，与Ad-ΔBH3相比Ad-PUMA抑制肿瘤生长至少达到80％(P＜0.01)。在用药的第22天处死裸鼠，剥取肿瘤组织(见附图12B)，图12B上半部分显示A549荷瘤小鼠Ad-PUMA及Ad-ΔBH3治疗前和治疗后22天的状况。
我们也对H1299细胞建立的裸鼠移植瘤进行治疗实验，每隔2天注射一次含有5×108pfu Ad-PUMA或Ad-ΔBH3的100μl PBS溶液，共三次。每3天测量瘤子大小，绘制移植瘤生长曲线，可见Ad-PUMA抑制肿瘤生长达80％以上(附图12C)。在第二次注射后的48小时剖取肿瘤，在荧光显微镜下观察肿瘤的冰冻切片以确定腺病毒感染效率(GFP，200×)。可见治疗后的肿瘤组织中GFP高表达，提示腺病毒转导的目的基因高效表达(附图12D)。但高效表达PUMA的细胞会快速凋亡，致使Ad-PUMA治疗后的肿瘤组织经H&E染色(400×)显示有大量的细胞缺失，而在Ad-ΔBH3或PBS处理的组织中则细胞完好(附图14D)。TUNEL染色(TUNEL，红色，200×；DAPI复染，蓝色)表明给予Ad-PUMA治疗的肿瘤大量细胞发生凋亡，而用Ad-ΔBH3或PBS处理的肿瘤组织中几乎不存在凋亡细胞(附图12D)。这表明PUMA能通过诱导凋亡有效抑制肿瘤的生长，而缺失BH3后PUMA的抑瘤作用不复存在。
权利要求
1.含有BH3结构域的cDNA的PUMA基因及其表达的蛋白在制备增加肿瘤细胞对化疗药物和放射治疗的敏感性药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物包括铂类顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂；微管抑制剂紫杉醇、泰索帝、长春碱、长春新碱、长春瑞宾；抗代谢类氟尿嘧啶、硫鸟嘌呤、洛拉曲克、替加氟、卡莫氟、氟铁龙、优福定、阿糖胞苷。拓扑异构酶II抑制剂鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩甙。蒽环类抗肿瘤抗生素阿霉素、柔红霉素、阿克拉霉素、表阿霉素、去甲柔红霉素、米托蒽醌。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物包括顺铂、紫杉醇、五氟尿嘧啶、奥沙利铂、鬼臼乙叉甙、阿霉素及放射治疗γ射线。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的肿瘤为实体肿瘤，其包括乳腺癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、胰腺癌和食管癌。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物是PUMA基因导入载体形成的药物或包含有PUMABH3结构域(LRRMADDLN)的cDNA及蛋白形成的药物。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述的载体包括可有效转导基因的表达质粒、增殖型及复制缺陷型腺病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒、腺相关病毒、痘苗病毒载体。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述的药物是Ad-PUMA。
全文摘要
本发明涉及PUMA基因的新用途，特别是外源PUMA基因或包含有PUMA BH3结构域的cDNA及蛋白的导入在制备增加肿瘤细胞对化疗药物和放射治疗的敏感性药物中的用途。
文档编号A61K31/7068GK1981872SQ20051013027
公开日2007年6月20日 申请日期2005年12月12日 优先权日2005年12月12日
发明者林晨, 詹启敏, 王海娟, 张 林, 余健 申请人:中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所