专利名称：一种表面功能化壳聚糖角膜修复材料的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种角膜修复材料的制备方法，具体涉及一种表面功能化壳聚糖角膜修复 材料的制备方法。
背景技术：
角膜病是当今世界上最主要的可逆性、致盲性眼病之一。据世界卫生组织统计角膜 病是继白内障之后全球第二大致盲眼病，当今世界上眼睛失明的病人中有近1/3是由角膜
疾病引起。我国是角膜病的高发国家，据不完全统计，我国因角膜病致盲人数约有400多
万，占各类致盲性眼病第二位。但大部分角膜盲可通过手术治疗，其中角膜移植是角膜盲 复明的重要的治疗手段之一。但是角膜移植手术面临的主要问题是供体材料来源严重匮乏。 同种异体角膜供体的来源缺乏，限制该技术的临床应用，人工角膜技术的发展为该技术带 来了新的希望，而角膜材料的性能对角膜移植手术的成功与否具有非常重要的影响。
传统的人工角膜材料生物相容性差，细胞难以真正黏附、增殖，营养和代谢物质不能 及时交换，以及支架与光柱、支架与眼组织的结合部位界面问题复杂，炎症的发生率高。 目前用组织工程技术构建角膜已成为眼科学界研究的热点。先将角膜细胞在三维角膜支架 上体外培养，然后植入眼内，细胞分化成为新的角膜组织的同时，支架也刚好降解完全。 故其寻求的角膜材料不仅要有适宜的力学强度和良好的生物相容性，更要有较好的光学性 能和降解性，且降解产物对人体无毒，无刺激性，降解速率要与人角膜组织生长速率相匹 配，还要有适宜的吸水率、亲水性等性能。寻找适宜力学强度和亲水性、良好的光学性能 和生物相容性的角膜修复材料是待解决的重点问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种表面功能化壳聚糖角膜修复材料的 制备方法，弥补现有技术和材料的不足。
一种表面功能化壳聚糖角膜修复材料的制备方法，包括如下步骤
(1) 将壳聚糖溶于乙酸水溶液，壳聚糖与乙酸溶液的重量体积比为20mg/mL;
(2) 将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液注入模具室温下自然风干；
(3) 在步骤(2)的模具中加入碱溶液使其浸泡膜30分钟后揭膜，将膜放入去离子水 中浸泡2 4小时；
(4) 将步骤(3)所得的膜室温下自然风干；
(5) 将步骤(4)所得的膜分别浸泡于生物大分子溶液或生物活性短肽溶液中，加入 交联剂交联处理；交联反应温度为4 35°C，反应12 48h;
(6) 将步骤(5)所得的产品，用去离子水冲洗，室温下自然风干。
3步骤(1)所述的乙酸水溶液浓度为l% 3%Wt。
步骤(3)所述的碱溶液为浓度为2X 5Xwt的氢氧化钠溶液或氨水。
步骤(5)所述的生物大分子溶液为明胶溶液或者透明质酸溶液，所述的生物活性短肽 为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDs)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸或精氨酸-甘氨酸-天 冬氨酸-缬氨酸。
步骤(5)所述的明胶溶液的浓度为0. 5% 5%wt,透明质酸溶液浓度为0.1% 0. 5%wt, 生物活性短肽溶液的浓度为0. 01% 0. l%wt。
步骤(5)所述的交联剂为1-乙基_3- (3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基 琥珀酰亚胺(NHS)的混合溶液，混合溶液浓度为0. 5%wt。
步骤(5)所述的交联剂中EDC的用量与生物大分子或生物活性短肽质量比为1 : 6。 具体质量比为明胶EDC=6 : 1，透明质酸EDC=6 : 1， RGDs短肽EDC二6 : 1。
步骤(6)用去离子水冲洗3 5次。
本发明方法制备的表面功能化壳聚糖角膜修复材料的透光率高于95%，亲水性较壳聚 糖的有所改善，具有良好的细胞相容性和生物相容性。
以上所得的制品壳聚糖膜记为CS,经明胶溶液、透明质酸溶液或RGDs短肽处理的 壳聚糖膜分别标记为CS-GEL， CS-HYA， CS-RGDs。
本发明与现有技术相比，具有如下优点
(1) 本发明的角膜修复材料是通过表面功能化方法在壳聚糖表面固定生物大分子和生 物活性短肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDs)短肽，在保证壳聚糖较好的力学性能 和优异的光学性能的同时，改善其生物活性和生物相容性。
(2) 本发明的角膜修复材料的透光率高于95% (人眼角膜为95% 98%)，人角膜上 皮细胞能在上面的生长增殖情况良好。
(3) 本发明采用的原材料取材广泛，价格低廉，成型工艺简单，成本低，有利于大规 模生产。
图1为实施例1， 4制备的表面功能化壳聚糖角膜修复材料的表面X射线光电子能谱图2为实施例1制备的表面功能化壳聚糖角膜修复材料的接触角随时间变化曲线； 图3为实施例4制备的表面功能化壳聚糖角膜修复材料的接触角随时间变化曲线； 图4为实施例1， 4表面功能化壳聚糖角膜修复材料的透光率；
图5为人角膜缘上皮细胞在纯壳聚糖膜表面生长72小时的光镜照片； 图6为人角膜缘上皮细胞在实施例1表面生长72小时的光镜照片； 图7为人角膜缘上皮细胞在实施例2表面生长72小时的光镜照片； 图8为人角膜缘上皮细胞在实施例3表面生长72小时的光镜照片； 图9为人角膜缘上皮细胞在实施例4表面生长72小时的光镜照片； 图10为人角膜缘上皮细胞在实施例5表面生长72小时的光镜照片； 图11为人角膜缘上皮细胞在实施例6表面生长72小时的光镜照片；图12为人角膜缘上皮细胞在实施例7表面生长72小时的光镜照片； 图13为人角膜缘上皮细胞在实施例8表面生长72小时的光镜照片； 图14为人角膜缘上皮细胞在实施例9表面生长72小时的光镜照片。
具体实施方式
-
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但需指出的是以下实施例不能理解为对本发
明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容对本发明作出的一些非本质
的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例l
表面功能化壳聚糖角膜修复材料的制备方法，包括如下步骤
(1) 将0. 4g壳聚糖溶于20ml 1Xwt的乙酸水溶液中；
(2) 将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液除去气泡，注入模具中室温下风干成膜；
(3) 在步骤(2)的模具中加入2^wt的氢氧化钠溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30 分钟后揭膜，去离子水冲洗浸泡2小时；
(4) 将步骤(3)得到的膜完全浸泡在l%wt的明胶溶液中，加入0.5Xwt的交联剂交 联处理，使明胶与EDC的质量比=6: 1。搅拌，使交联剂均匀分散，反应温度为35°C， 反应时间为24小时；
(5) 将步骤(4)的制品，用去离子水冲洗，室温下自然风干。 本实施例制备的表面功能化壳聚糖膜的XPS分析表面元素及其元素含量见表1。
表l
MaterialsC (%)N (%)0 (%)0/CN/C
CS70. 576. 5322. 900. 320. 09
CS-GEL72.7513.0614. 190.200.18
CS-HYA70. 544.9124. 550. 350.07
CS-RGDs64. 529. 6725.810. 400. 15
图1是本实施例制备的表面功能化壳聚糖膜的XPS谱图；从图1和表1可以看出实施 例l制备的表面功能化壳聚糖膜的表面的氮元素含量增加，氧元素含量降低。图2是本实
施例的表面功能化壳聚糖膜的接触角。图4是透光率曲线，图6是人角膜缘上皮细胞在本 实施例材料表面生长72小时的光镜照片。
采用英国Kratos公司的X射线光电子能谱仪测试角膜修复材料表面元素含量。
采用德国Dataphysics公司的0CA15型表面接触角测定仪测试未含水角膜修复材料在 滴水100s时的接触角大小。
采用UNICO上海仪器有限公司的UV-3802型紫外可见分光光度计，测试了吸水平衡后 的表面功能化壳聚糖角膜修复材料在不同波长的可见光条件下的透光率情况。
采用德国Leica公司的LEICA DM IRB相差显微镜观察细胞在膜上的生长情况。 实施例2
5表面功能化壳聚糖角膜修复材料的制备方法，包括如下步骤
(1) 将0. 4g壳聚糖溶于20ml 3%wt的乙酸水溶液中；
(2) 将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液除去气泡，注入模具中室温下风干成膜；
(3) 在步骤(2)的模具中加入5Xwt的氨水溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30分钟
后揭膜，去离子水冲洗浸泡3小时；
(4) 将步骤(3)得到的膜完全浸泡在5。/。wt的明胶溶液中，加入0.5^wt的交联剂交 联处理，使明胶与EDC的质量比=6: 1。搅拌，使交联剂均匀分散，反应温度为25°C， 反应时间为24小时；
(5) 将步骤(4)的制品，用去离子水冲洗，室温下自然风干。
图7是人角膜缘上皮细胞在本实施例材料表面生长72小时的光镜照片。 实施例3
表面功能化壳聚糖角膜修复材料的制备方法，包括如下步骤-
(1) 将0. 4g壳聚糖溶于20ral 2%wt的乙酸水溶液中；
(2) 将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液除去气泡，注入模具中室温下风干成膜；
(3) 在步骤(2)的模具中加入5Xwt的氢氧化钠溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30 分钟后揭膜，去离子水冲洗浸泡4小时；
(4) 将步骤(3)得到的膜完全浸泡在0. 5%wt的明胶溶液中，加入0. 5%wt的交联剂 交联处理，使明胶与EDC的质量比^6: 1。搅拌，使交联剂均匀分散，反应温度为25。C， 反应时间为48小时；
(5) 将步骤(4)的制品，用去离子水冲洗，室温下自然风干。
图8是人角膜缘上皮细胞在本实施例材料表面生长72小时的光镜照片。 实施例4
表面功能化壳聚糖角膜修复材料的制备方法，包括如下步骤
(1) 将0. 4g壳聚糖溶于20ml 1Xwt的乙酸水溶液中；
(2) 将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液除去气泡，注入模具中室温下风干成膜；
(3) 在步骤(2)的模具中加入3Xwt的氢氧化钠溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30 分钟后揭膜，去离子水冲洗浸泡2小时；
(4) 将步骤(3)得到的膜完全浸泡在0.5%的透明质酸溶液中，加入0.5^wt的交联 剂交联处理，使透明质酸与EDC的质量比-6 : 1。搅拌，使交联剂均匀分散，反应温度为 4。C，反应时间为48小时；
(5) 将步骤(4)的制品，用去离子水冲洗，室温下自然风干。 本实施例制备的表面功能化壳聚糖膜的XPS分析表面元素及其元素含量见表1。图1
是本实施例制备的表面功能化壳聚糖膜的XPS谱图；从图1和表1可以看出实施例2制备 的表面功能化壳聚糖膜的表面的氮元素含量降低，氧元素含量增加。图3是本实施例的表 面功能化壳聚糖膜的接触角。图4是透光率曲线，图9是人角膜缘上皮细胞在本实施例材 料表面生长72小时的光镜照片，如图9所示人角膜缘上皮细胞的粘附和增殖实验结果表明了该表面功能化壳聚糖角膜修复材料具有良好的生物活性和生物相容性。 实施例5
表面功能化壳聚糖角膜修复材料的制备方法，包括如下步骤
(1) 将0. 4g壳聚糖溶于20ml 1Xwt的乙酸水溶液中；
(2) 将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液除去气泡，注入模具中室温下风干成膜；
(3) 在步骤(2)的模具中加入2^wt的氨水溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30分钟
后揭膜，去离子水冲洗浸泡4小时；
(4) 将步骤(3)得到的膜完全浸泡在O. 1%的透明质酸溶液中，加入0.5。/^vt的交联 剂交联处理，使透明质酸与EDC的质量比6: 1。搅拌，使交联剂均匀分散，反应温度为 25°C，反应时间为48小时；
(5) 将步骤(4)的制品，用去离子水冲洗，室温下自然风干。
图10是人角膜缘上皮细胞在本实施例材料表面生长72小时的光镜照片。 实施例6 -
表面功能化壳聚糖角膜修复材料的制备方法，包括如下步骤
(1) 将0. 4g壳聚糖溶于20ml 2Xwt的乙酸水溶液中；
(2) 将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液除去气泡，注入模具中室温下风干成膜；
(3) 在步骤(2)的模具中加入5Xwt的氢氧化钠溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30 分钟后揭膜，去离子水冲洗浸泡2小时；
(4) 将步骤(3)得到的膜完全浸泡在0.3%的透明质酸溶液中，加入0.5。/。wt的交联 剂交联处理，使透明质酸与EDC的质量比^6: 1。搅拌，使交联剂均匀分散，反应温度为 4'C，反应时间为12小时；
(5) 将步骤(4)的制品，用去离子水冲洗，室温下自然风干。
图11是人角膜缘上皮细胞在本实施例材料表面生长72小时的光镜照片。 实施例7 .
表面功能化壳聚糖角膜修复材料的制备方法，包括如下步骤
(1) 将0. 4g壳聚糖溶于20ml l%wt的乙酸水溶液中；
(2) 将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液除去气泡，注入模具中室温下风干成膜；
(3) 在步骤(2)的模具中加入5^wt的氢氧化钠溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30 分钟后揭膜，去离子水冲洗浸泡2小时；
(4) 将步骤(3)得到的膜完全浸泡在0. 1%的RGDs短肽溶液中，加入0.5%wt的交 联剂交联处理，使RGDs与EDC质量比^6: 1。搅拌，使交联剂均匀分散，反应温度为4 °C，反应时间为24小时；
(5) 将步骤(4)的制品，用去离子水冲洗，室温下自然风干。 本实施例制备的表面功能化壳聚糖膜的XPS分析表面元素及其元素含量见表1。从表1
可以看出实施例3制备的表面功能化壳聚糖膜的表面的氮元素含量和氧元素含量都增加。 图12是人角膜缘上皮细胞在本实施例材料表面生长72小时的光镜照片，如图12所示人角
7膜缘上皮细胞的粘附和增殖实验结果表明了该表面功能化壳聚糖角膜修复材料具有良好的
生物活性和生物相容性。
实施例8
表面功能化壳聚糖角膜修复材料的制备方法，包括如下步骤
(1) 将0. 4g壳聚糖溶于20ml 2Xwt的乙酸水溶液中；
(2) 将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液除去气泡，注入模具中室温下风干成膜；
(3) 在步骤(2)的模具中加入5^wt的氢氧化钠溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30 分钟后揭膜，去离子水冲洗浸泡2小时；
(4) 将步骤(3)得到的膜完全浸泡在0.05y。的RGDs短肽溶液中，加入0.5^wt的交 联剂交联处理，使RGDs与EDC的质量比二6: 1。搅拌，使交联剂均匀分散，反应温度为 25°C，反应时间为48小时；
(5) 将步骤(4)的制品，用去离子水冲洗，室温下自然风干。
图13是人角膜缘上皮细胞在本实施例材料表面生长72小时的光镜照片。 实施例9
表面功能化壳聚糖角膜修复材料的制备方法，包括如下步骤
(1) 将0. 4g壳聚糖溶于20ml 1Xwt的乙酸水溶液中；
(2) 将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液除去气泡，注入模具中室温下风干成膜；
(3) 在步骤(2)的模具中加入5^wt的氨水溶液，使膜完全浸泡在溶液中，30分钟 后揭膜，去离子水冲洗浸泡4小时；
(4) 将步骤(3)得到的膜完全浸泡在O.OP/。的RGDs短肽溶液中，加入0.5Xwt的交 联剂交联处理，使RGDs:EDC二6: 1。搅拌，使交联剂均匀分散，反应温度为4。C，反应 时间为48小时； '
(5) 将步骤(4)的制品，用去离子水冲洗，室温下自然风干。
图14是人角膜缘上皮细胞在本实施例材料表面生长72小时的光镜照片。
权利要求
1、一种表面功能化壳聚糖角膜修复材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)将壳聚糖溶于乙酸水溶液，壳聚糖与乙酸溶液的重量体积比为20mg/mL；(2)将步骤(1)的壳聚糖乙酸水溶液注入模具室温下自然风干；(3)在步骤(2)的模具中加入碱溶液使其浸泡膜30分钟后揭膜，将膜放入去离子水中浸泡2～4小时；(4)将步骤(3)所得的膜室温下自然风干；(5)将步骤(4)所得的膜分别浸泡于生物大分子溶液或生物活性短肽溶液中，加入交联剂交联处理；交联反应温度为4～35℃，反应12～48h；(6)将步骤(5)所得的产品，用去离子水冲洗，室温下自然风干。
2、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)所述的乙酸水溶液浓度为 l% 3%wt。
3、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述的碱溶液为氢氧化钠 溶液或氨水，浓度为2X 5Xwt。
4、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(5)所述的生物大分子溶液为 明胶溶液或者透明质酸溶液，所述的生物活性短肽包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氮酸、 甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸或精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸。所述的明胶溶液的浓度为0.5%~5%^，透明质酸溶液浓度为0.1% 0.5°/柳1:，生物活性 短肽溶液的浓度为0. 01% 0. l%wt。
5、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(6)所述去离子水冲洗的次数 为3 5次。
6、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(5)所述的交联剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液，混合溶液浓度为0. 5%wt。
7、 根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的交联剂中l-乙基-3- (3-二甲 基氨丙基)碳二亚胺的用量与生物大分子或生物活性短肽质量比为1 : 6。
全文摘要
本发明公开了一种表面功能化壳聚糖角膜修复材料及其制备方法。该方法包括如下步骤壳聚糖溶于酸溶液，将壳聚糖溶液注入模具中风干，用碱溶液处理后干燥得到壳聚糖膜。壳聚糖膜表面采用化学交联法固定生物大分子及短肽。这种表面功能化壳聚糖膜的接触角明显下降，亲水性改善；制备的表面功能化壳聚糖角膜修复材料的透光率高于95％，具有良好的细胞相容性和生物相容性，可用于医疗领域中作为角膜损伤的修复，其制备工艺简单，设备简易，原料价廉易得，具有良好的应用前景和科学价值。
文档编号A61L27/00GK101480505SQ200910036949
公开日2009年7月15日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月23日
发明者力 任, 王迎军, 丽 郭 申请人:华南理工大学