专利名称：：一种防治糖尿病肾病的药物组合物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及中药制药领域。具体地说，涉及一种以毛蕊异黄酮及毛蕊异黄酮苷为活性成分的药物组合物及其在制备防治糖尿病肾病药物中的应用。
背景技术：
：糖尿病肾病(diabeticn印hropathy，DN)是糖尿病常见的并发症，是糖尿病全身性微血管病变表现之一，通常指由于糖尿病引起的肾小球基底膜增厚，系膜扩张以及胞外基质增生，导致肾小球的高滤过和蛋白尿。临床特征为蛋白尿，渐进性肾功能损害，高血压，水肿，晚期出现严重肾功能衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。据统计，约30-40%的糖尿病患者会出现肾脏损害。在美国，糖尿病肾病是导致终末期肾功能衰竭的首要原因，在欧洲居第二位。目前，我国糖尿病肾病在终末期肾功能衰竭患者中所占的比例也已上升至15%。随着糖尿病发生率的不断增高和社会人口老龄化，这个数字还将继续攀升。目前针对糖尿病肾病尚无很好的治疗药物，临床上的主要药物是降糖药，降压药等，如胰岛素、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI，如卡托普利)等。然而，这些药物长期应用均会产生较严重的毒副作用，如糖尿病患者长期使用有可能加重高血钾，另外部分患者服用后可因伴功能性或器质性肾动脉狭窄而诱发急性肾功能衰竭，等等。因此，研制开发高效低毒的防治糖尿病肾病的药物具有十分重要的意义。糖尿病肾病又可称为"糖尿病肾小球硬化症"。肾小球系膜细胞是肾小球的主要成分，约占肾小球细胞总数的30-40%。肾小球系膜细胞具有多种功能，如分泌细胞基质、产生细胞因子，并具有吞噬清除大分子物质以及类似平滑肌细胞的收縮功能，是肾小球中功能最活跃的一类细胞。系膜细胞是分泌产生细胞外基质(ECM)的主要细胞之一，而ECM聚集则是肾小球硬化的关键机制。因此，系膜细胞病变在糖尿病肾病的发生发展过程中起着极其重要的作用。黄芪为我国传统常用中药，具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌等功效，应用黄芪治疗糖尿病及其肾病并发症符合中医药学的理论与实践。近年来，大量动物实验和临床疗效证实，黄芪及其制剂对糖尿病肾病具有明确的治疗作用，然而其起治疗作用的有效成分尚不清楚。因此，有必要对其进行深入研究，以开发出有效成分明确，作用机理清楚，质量易于控制的防治糖尿病肾病的现代中药制剂。前期研究表明，黄酮类成分是黄芪中主要活性成分之一，具有清除自由基、调节免疫、抗病毒和抗肿瘤等多种药理活性。毛蕊异黄酮及其糖苷(毛蕊异黄酮苷)是黄芪中两种含量较高的黄酮类成分。专利CN01126608.2公开了毛蕊异黄酮及其糖苷具有抗心肌缺血作用，专利CN200510110641.3公开了毛蕊异黄酮苷具有抑制柯萨奇病毒及治疗病毒性心肌炎的作用。此外，文献还报道了毛蕊异黄酮或毛蕊异黄酮苷具有抗氧化(BiomedEnvironSci，2005，18(5):297-301)、保护血管内皮细胞(中国药学杂志，2008，43(8):594-597;中药药理与临床，2000，16(4):16-18)、阻滞f丐通道(ActaPharmacolSin，2006，27(8):1007-1012)、改善红细胞变形能力(天然产物研究与开发，1999，6(2):1_5)以及减缓骨关节炎病变(OsteoarthritisCartilage,2007，15(9):1086-1092)等作用。虽然文献报道它们具有多方面的药理活性，然而，毛蕊异黄酮及其糖苷对糖尿病肾病的防治效果如何，国内外尚无报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种防治糖尿病肾病的药物组合物及其制备方法，该药物组合物的活性成分是毛蕊异黄酮和/或毛蕊异黄酮苷。解决上述问题的技术方案如下—种防治糖尿病肾病的药物组合物，该药物组合物由毛蕊异黄酮或毛蕊异黄酮苷中的一种或两种作为活性成分，和常规的药物载体组成，所述活性成分的重量百分比含量为0.1-99.5%。优选地，所述活性成分的重量百分比含量为5-90%。优选地，该药物组合物由毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷中作为活性成分，和常规的药物载体组成，毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的重量比为1:5-5:1。本发明药物组合物所述常规的药用载体是指药学领域常规的药物载体，例如稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。本发明药物组合物可以通过常规制剂方法制备成常规的剂型，常规剂型主要为口服制剂，如固体制剂片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、粒剂、胶囊等，液体制剂水或油悬浮剂或其它液体制剂如酏剂等。本发明所述药物组合物的使用剂量可随特定的给药方式、病症的严重程度等而相应调整。一般情况下，本发明药物的临床口服用量根据动物(大鼠)体内实验的治疗有效量2-10mg/kg体重/次，按照体表面积换算得到人体的用药剂量为20-100mg/60kg体重/次。本发明的另一目的是提供上述药物组合物的制备方法。采用了以下技术方案—种药物组合物的制备方法，将所述活性成分毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷中的一种或两种与所述常规的药物载体混合，即得。所述活性成分的提取包括以下步骤A.取黄芪粉碎，加80%乙醇回流提取后过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓縮至无醇味，得黄芪醇提液，置冰箱冷藏过夜；B.取步骤A的黄芪醇提液上清液用大孔树脂吸附，先用纯水洗脱至流出液澄清，再用50%乙醇洗脱至薄层色谱检测无毛蕊异黄酮苷斑点为止；C.收集50%乙醇洗脱液减压浓縮，经等体积的醋酸乙酯萃取，合并萃取液浓縮得黄芪总黄酮浸膏；D.浸膏以硅胶柱层析，氯仿_甲醇=50:1-1:l梯度洗脱，薄层跟踪检测，合并相同的流份，静置析晶，抽滤，经甲醇重结晶，得毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷。毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷可以按上述提取方法从其他中药材中提取。4本发明还提供了毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷在制备防治糖尿病肾病的药物中的应用，所述糖尿病肾病为I、II、III、IV期糖尿病肾病。本发明药物组合物具有以下有益效果1.本发明通过药理实验发现了毛蕊异黄酮及其糖苷具有防治糖尿病肾病的新医药用途，同时也为糖尿病肾病患者提供了新的治疗候选药物。2.本发明的药物组合物对糖尿病肾病的防治效果优于黄芪水提液，且活性成分结构明确，质量易于控制，克服了传统中药中有效成分不明确、质量控制难等的缺点。3.本发明的药物组合物具有显著治疗和预防糖尿病时肾小球损害的作用，由于可显著预防糖尿病时血肌酐的升高、显著降低糖尿病大鼠的尿量和尿蛋白，表明对糖尿病肾病有显著的防治作用。4.本发明的药物组合物可加工成口服剂型如滴丸、冲剂、片剂等，使用方便。图1是毛蕊异黄酮及其糖苷对高糖诱发的大鼠肾小球系膜细胞外基质增生的影响(PAS，200X);其中A:正常对照组；B:高糖组(25mM);C:黄芪水提液(50mg/ml);D:毛蕊异黄酮(100nM);E:毛蕊异黄酮(10nM);F:毛蕊异黄酮(lnM);G:毛蕊异黄酮苷(100nM);H:毛蕊异黄酮苷(10nM):I:毛蕊异黄酮苷(lnM);J:毛蕊异黄酮_毛蕊异黄酮苷(10Pg/ml:5iig/ml);K:毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷(5yg/ml:10yg/ml)。图2是毛蕊异黄酮及其糖苷对高糖诱发的大鼠肾小球系膜细胞外TGFP_1表达的影响(200X);其中A:正常对照组；B:高糖组(25fflM);C:阴性对照组(未加TGFP_1抗体)；D:毛蕊异黄酮(100nM);E:毛蕊异黄酮(10nM);E:毛蕊异黄酮(lnM);F:毛蕊异黄酮(lnM);G:毛蕊异黄酮苷(100nM);H:毛蕊异黄酮苷(10nM);1:毛蕊异黄酮苷(lnM);J:黄芪水提液(50mg/ml);K:毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷(10yg/ml:5yg/ml);L:毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷(5yg/ml:10iig/ml)。具体实施例方式以下通过具体实施例来说明本发明。实施例1:毛蕊异黄酮及毛蕊异黄酮苷的制备取干燥黄芪药材10kg，以8倍量80%乙醇回流提取3次(2小时，1小时，1小时)，过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓縮至无醇味，得黄芪醇提液，置4t:冰箱中冷藏过夜，上清液用DIOI型大孔树脂吸附，先用纯水洗脱至流出液澄清，再用50X乙醇洗脱至TLC检测无毛蕊异黄酮苷斑点为止。收集50%乙醇洗脱液经减压浓縮后，用等体积的醋酸乙酯萃取7次，合并萃取液后回收溶剂，真空干燥，得到黄芪总黄酮。黄芪总黄酮再经200-300目硅胶柱层析，以氯仿-甲醇50:i-i:l梯度(50:1、25:1、12:1、6:1、3:i、i.5:1、1:1)洗脱，薄层跟踪检测，合并相同的流份，静置析晶，抽滤，甲醇重结晶，分别得到白色针状结晶(毛蕊异黄酮)和白色粉末状结晶(毛蕊异黄酮苷)，化学结构经质谱和核磁共振等波谱手段确证，纯度经HPLC检测大于98X。它们的结构式分别如下毛蕊异黄酮(calycosin)，分子量为284，分子式为QAA，化学名为3'_羟基_4'_甲氧基异黄酮HO、、OCH3毛蕊异黄酮苷为(^H2^。，化学名为3'(calycosin_7_0_P_D_glucopyranoside)，分子量为446，分子式4'-甲氧基异黄酮-7-0-13-D-吡喃葡萄糖苷。OCH3实施例2本发明药物组合物颗粒剂的制备(活性成分为毛蕊异黄酮苷)毛蕊异黄酮苷lmg淀粉500mg微晶纤维素500mg制备方法将毛蕊异黄酮苷与各种辅料混合均匀后，用适量水制软材，制粒、干燥、整粒、分装即得。实施例3本发明药物组合物片剂的制备(活性成分为毛蕊异黄酮苷)毛蕊异黄酮苷20mg乳糖127mg玉米淀粉50mg硬脂酸镁3mg制备方法将毛蕊异黄酮苷过80目筛，与乳糖和玉米淀粉混合均匀，加入适量的水并将粉末制粒，干燥后，将此颗粒过筛并与其余赋形剂混合，压片即得。实施例4本发明药物组合物胶囊的制备(活性成分为毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷)毛蕊异黄酮30mg毛蕊异黄酮苷70mg乳糖40mg糊精15mg淀粉45mg3%HPMC适量制备方法将毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷过80目筛，与糊精、淀粉、乳糖按等量倍增法混合均匀，加入预先配好的HMPC溶液制成软材，制粒，干燥，整粒，装胶囊即得。实施例5本发明药物组合物颗粒剂的制备(活性成分为毛蕊异黄酮)毛蕊异黄酮50mg淀粉400mg微晶纤维素550mg制备方法将毛蕊异黄酮过80目筛，再与各种辅料混合均匀后，用适量水制软材，制粒、干燥、整粒、分装即得。实施例6本发明药物组合物胶囊的制备(活性成分为毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷)毛蕊异黄酮120mg毛蕊异黄酮苷60mg糊精10mg淀粉10mg制备方法将毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷过80目筛，与糊精、淀粉、乳糖按等量倍增法混合均匀，加入预先配好的HMPC溶液制成软材，制粒，干燥，整粒，装胶囊即得。实施例7本发明药物组合物片剂的制备(活性成分为毛蕊异黄酮)毛蕊异黄酮200mgHPMC2mg制备方法毛蕊异黄酮过80目筛，加入预先配好的HMPC溶液制成软材，制粒，压片即得。实施例8本发明药物组合物片剂的制备(活性成分为毛蕊异黄酮苷)毛蕊异黄酮苷200mgHPMC2mg制备方法毛蕊异黄酮苷过80筛，加入预先配好的HMPC溶液制成软材，制粒，压片即得。实施例9本发明药物组合物胶囊的制备(活性成分为毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷)毛蕊异黄酮80mg毛蕊异黄酮苷20mg乳糖40mg糊精15mg淀粉45mg3%HPMC适量制备方法将毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷过80目筛，与糊精、淀粉、乳糖按等量倍增法混合均匀，加入预先配好的HMPC溶液制成软材，制粒，干燥，整粒，装胶囊即得。本发明对毛蕊异黄酮和/或毛蕊异黄酮苷用于药理实验，以证实其对糖尿病肾病的防治作用，同时与黄芪水提液的防治效果进行平行比较。实验例1:毛蕊异黄酮和/或毛蕊异黄酮苷对高糖及AGEs诱发的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响。肾小球系膜细胞是肾小球中最活跃的反应性细胞，其病理变化在糖尿病肾病的发生和发展中居于中心地位，是糖尿病肾病的靶细胞。因此采用体外高糖和AGEs培养大鼠肾7小球系膜细胞，观察毛蕊异黄酮和/或毛蕊异黄酮苷对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响。1材料与试剂大鼠肾小球系膜细胞株HBZY21(武汉细胞生物研究所提供)；DMEM培养基(GIBC0);新生牛血清(杭州四季青血清厂)；Thiazolyl噻唑蓝(Amresco分装)；二甲亚砜(AR级，上海久仡化学试剂有限公司)。0)2培养箱(NAPC05410，PERCISIONSCIENTIFIC);XSZ-D2倒置显微镜(重庆光学仪器厂)；超净工作台(苏州百神科技网络系统有限公司，苏州市洁净技术研究所)；MicroplateSpectrophotometer(SPECTRAmaxl90，美国AD公司);医用离心机(LDZ5-2，北京医用离心机厂)。2实验方法2.1模型的建立取对数生长期大鼠肾小球系膜细胞制成单细胞悬液，以100iU/孔接种于96孔板，细胞数5X104/孔，37。C5%(A培养箱培养24h后，加入100yl无新生牛血清的DMEM，再孵育24h使细胞生长同步进入休止期(同步化)。吸弃细胞上清液，分别加入100ii1含不同浓度的葡萄糖和AGEs的含血清DMEM，每个浓度设置6个重复，分别于培养箱中培养24h、48h、72h、96h，MTT法观察不同浓度葡萄糖或AGEs对鼠肾小球系膜细胞增殖的影响。结果表明，O.25mg/mlAGEs或25mM葡萄糖浓度，培养时间24h时肾小球系膜细胞效果最好，作为本实验造模条件。2.2高糖诱发的大鼠肾小球系膜细胞增殖实验取96孔板培养的同步化过的细胞(细胞培养方法同2.l)，每孔均加入葡萄糖终浓度为25mM的高糖DMEM培养基0.lml，再向孔内分别添加0.lml梯度稀释的毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷溶液(终浓度分别为10、100nM)、毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷(终浓度10iig/ml:5yg/ml)、毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷(终浓度5iig/ml:10yg/ml)，和黄芪水提液(50mg/ml)，每个稀释度6个复孔。以只加普通DEME培养基(葡萄糖终浓度5.5mM)为正常对照组，以加葡萄糖终浓度为25mM的高糖DMEM培养基为高糖组。于37°C5%C02培养箱培养24h后，MTT法测定细胞增殖情况。2.3AGEs诱发的大鼠肾小球系膜细胞增殖实验每孔均加入终浓度为0.25mg/mlAGEs的DMEM培养基0.lml，再向孔内分别添加0.lml梯度稀释的毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷溶液(终浓度分别为10、100nM)、毛蕊异黄酮_毛蕊异黄酮苷(终浓度10Pg/ml:5g/ml)、毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷(终浓度5iig/ml:10iig/ml)，和黄芪水提液(50mg/ml)，每个稀释度6个复孔。以只加DEME培养基为正常对照组，以加DMEM培养基和终浓度为0.25mg/mlAGEs为AGEs组。于37°C5%C02培养箱培养24h后，MTT法测定细胞增殖情况。3实验结果3.1毛蕊异黄酮及毛蕊异黄酮苷对高糖诱发的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响从表1可以看出，25mM葡萄糖能显著促进大鼠肾小球系膜细胞增殖，黄芪水提液、单用及合用不同浓度的毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷均能显著抑制高糖作用下的大鼠系膜细胞的增殖，且高浓度剂量组和毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷(1:2)组的效果明显优于黄芪水提液组，毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷(1:2)组的效果略优于毛蕊异黄酮组和毛蕊异黄酮苷组。这表明毛蕊异黄酮和/或毛蕊异黄酮苷可以在糖尿病肾病早期治疗中发挥一定作用。表1毛蕊异黄酮及其糖苷对高糖诱发的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响(5土S,n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷组10ng/ml:5|ig/ml0.35±0.05*(2:1)毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷组5吗/ml:10叫/ml0.33±0.04*#(1:2)和高糖组比较*p<0.05;和黄芪水提液组比较#p<0.053.2毛蕊异黄酮及毛蕊异黄酮苷对AGEs诱发的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响从表2可以看出，O.25mg/mlAGEs能显著促进大鼠肾小球系膜细胞增殖，黄芪水提液、毛蕊异黄酮(100nM)和毛蕊异黄酮苷(10nM、100nM)均能显著抑制AGEs诱发的大鼠系膜细胞的增殖，单用及合用毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷效果均优于黄芪水提液组，合用毛蕊异黄酮_毛蕊异黄酮苷组的效果均优于毛蕊异黄酮组。这表明毛蕊异黄酮和/或毛蕊异黄酮苷可以在糖尿病肾病早期治疗中发挥一定作用。表2毛蕊异黄酮及毛蕊异黄酮苷对AGEs诱发的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响(x±S,n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷组和AGEs组比较*p<0.05实验例2:毛蕊异黄酮和/或毛蕊异黄酮苷对高糖诱发的大鼠肾小球系膜细胞外基质增生的影响。肾小球系膜细胞细胞外基质增生，是糖尿病肾病等慢性肾病主要病理特征，是治疗糖尿病肾病等慢性肾病的重要靶点。l材料与试剂TGFP-l抗体(CantaCruz产品)；二抗(晶美生物工程有限公司)；即用型SABC免疫组化染色试剂盒(博士德公司产品)；DAB显色系统(GeneTechBiotechnologyCompanyLimited);免疫组化湿盒(福州迈新生物技术开发公司)。2实验方法高糖模型的建立同实验例1，正常对照组、黄芪水提物组、毛蕊异黄酮组、毛蕊异黄酮苷组及毛蕊异黄酮_毛蕊异黄酮苷组同实验例1中2.1项，基质增生的评价通过测定培养液中羟脯氨酸含量，系膜细胞TGFI3-1的表达来实现。培养细胞时预先在24孔板孔内放置盖玻片，让细胞贴附，经同步化后给予相应药物。细胞铺满玻片后，吸出细胞上清，作羟脯氨酸含量检测；取出细胞爬片，固定，留作TGFI3-1细胞免疫组化染色、PAS染色。TGFP_1免疫组化染色中，以未加TGFI3-1抗体为阴性对照组。3实验结果3.1毛蕊异黄酮和/或毛蕊异黄酮苷对高糖诱发的大鼠肾小球系膜细胞培养液中羟脯氨酸的影响从表3可以看出，25mM的葡萄糖能显著提高大鼠肾小球系膜细胞培养液中羟脯氨酸的含量，黄芪水提液、单用及合用毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷均能对抗高糖诱发的系膜细胞培养液中羟脯氨酸的含量增高，且高剂量组(100nM)的效果明显优于黄芪水提液组，毛蕊异黄酮_毛蕊异黄酮苷组(1:2)组的效果明显优于(2:1)组。表3毛蕊异黄酮及毛蕊异黄酮苷对高糖诱发的肾小球系膜细胞培养上清液中羟脯氨酸的影响("S,n=3)组別浓度羟脯氨酸(吗/ml)正常对照组—4.18±0.37***高糖组—10.06±1.20黄芪水提液组50mg/ml7.58±1.95*毛蕊异黄酮组lOnM7.15±1.19*lOOnM6.65±1,74**#毛蕊异黄酮糖苷组10nM6.25±1.20**#lOOnM6.00±1.53**##毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮普组(2:1)10jjg/ml:5/ig/m7.05士1.04115毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苦組6.10±1,13*##(1:2)5)ug/ml:10fig/ml和高糖组比较*p<0.05，**p<0.01;和黄芪水提液组比较#p<0.05，##p<0.013.2对高糖诱发的大鼠肾小球系膜细胞外基质增生的影响由图1、2可以看出，黄芪水提物、单用及合用毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷均能对抗由高糖引起的肾小球系膜细胞细胞外基质增生以及TGFI3-1的表达，毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷中高剂量组(10、100nM)的效果优于黄芪水提液，合用的效果略优于单用。由实验例1、实验例2可以看出本发明药物组合物的活性成分毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷可以明显对抗由高浓度葡萄糖引起的肾小球系膜细胞的增殖、细胞外基质增生与TGFI3-1的表达，上述作用支持本发明的药物组合物具有治疗糖尿病肾病的药理基础。实验例3:毛蕊异黄酮和/或毛蕊异黄酮苷对链脲佐菌素(STZ)诱发的糖尿病肾病模型大鼠的影响。l材料与试剂链脲佐菌素(STZ)制作的糖尿病肾病模型的Wistar大鼠(由南方医科大学实验动物中心提供)；BIOBASE-PEARL分立式全自动生化分析仪(山东BIOBASE公司)。2实验方法将确认为糖尿病肾病模型的Wistar大鼠，随机分为11组，每组10只，即模型组；毛蕊异黄酮高中低剂量组(6、2、0.7mg/kg);毛蕊异黄酮苷高中低剂量组(9、3、lmg/kg);毛蕊异黄酮_毛蕊异黄酮苷(2:1，3mg/kg);毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷(1:2，3mg/kg);11黄芪水提液组(5g/kg);阳性对照组(氨基胍，100mg/kg)。另取正常Wistar大鼠IO只为正常对照组。每天各组同体积不同浓度灌胃给予相应药物或生理盐水1次，连续给药14周。给药结束后，代谢笼收集24小时尿液，计算尿量，并测定尿液中总蛋白、微白蛋白、肌酐含量；眼眶取血，全自动生化仪测定各生化指标；取肾，10%甲醛固定，留作病理组织学检查。所有测定结果用^士S，表示，采用组间t检验进行统计学分析。3实验结果3.1对STZ糖尿病肾病模型大鼠尿量、尿蛋白及肌酐的影响从表4可以看出，中高剂量毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷均能显著减少STZ糖尿病肾病模型大鼠的尿量、尿蛋白、微量白蛋白以及尿肌酐，同时毛蕊异黄酮及其糖苷在降低尿蛋白、尿肌酐含量等肾病重要指标方面明显优于黄芪水提液组，合用效果优于单用或相当。表4毛蕊异黄酮及毛蕊异黄酮苷对STZ糖尿病肾病模型大鼠尿蛋白、尿肌酐等的影响(三士s,n=10)剂量组別尿量(ml)尿蛋白(mg)微白蛋白(mg)尿肌酐(mM)(mg/kg)正常对照组—9.2±1.5**18.5±7.7**0.29士0.07"12.4±2.2"模型组—65.6±25.379.4±29.21.63±0.851.0±0.3氨基胍组画36.2±21.8*43.2±29.9*1患0.27*4.0±2.3**黄芪水提液组500045.3±20.4*54.1±24.5*1.05士0.52*2.1±1.0*0.759.9±21.869.1±20.41.57±0.561.4±0.6毛蕊异黄酮組241.3±16.8*54.0±17.4*0.93士0.55^2.9±1.2沐*635.9±22.2*46.2±21.3*#0.92±0.42*4.3±2.0**糾毛蕊异黄酮苷组39毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷组3(2:1)_毛蕊异黄酮-毛,藍-异黄酮普组330.7±24.7*#43.5±15.8**0.88±0.26*2.8±0.7(1:2)58.9±20.542.3±12.8*33.处20.2*#35.3±13.0*#67.1±18.455.0±13.4*44.2±20.6**50.9±23.7*1.52±0.560.90±0.45*0.93±0.22*0.89±0.35*1.3±0.62.7土1.1"4.2±1.6**#2.7±0.6**12和模型组比较:*p<0.05，**p<0.01;和黄芪水提液组比较Sp<0.05，##p<0.013.2对STZ糖尿病肾病模型大鼠血清生化指标的影响从表5可以看出，黄芪水提液、中高剂量毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、合用毛蔬异黄酮_毛蕊异黄酮苷均能显著降低糖尿病肾病模型动物血清中甘油三酯、MDA、Scr、BUN、AGEs、LDL水平，显著提高血清中SOD的活性，且中高剂量毛森异黄酮和毛森异黄酮苷、合用毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷效果优于黄芪水提液或相当，合用毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷(1:2)较单用效果好。。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>和模型组比较*p<0.05，**p<0.01;SOD:超氧化物歧化酶；MDA:丙二醛；Scr:血肌酐；BUN:血尿素氮；AGEs:终末糖基化产物；LDL:低密度脂蛋白。[OH9]3.3对STZ糖尿病肾病模型大鼠病理组织学的影响从表6可以看出，毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷均能显著减少由STZ诱发的糖尿病肾病模型大鼠中细胞外基质增生和TGFP-1的表达，降低损伤病理学评分，其中毛潔异黄酮苷高剂量组和毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷(1:2)组在减少TGFP-l表达方面优于黄芪水提液组，毛蕊异黄酮-毛蕊异黄酮苷(1:2)组效果略优于单用。表6毛蕊异黄酮及其糖苷对STZ糖尿病肾病模型大鼠病理组织学的影响(5士s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>和模型组比较:*p<0.05，**p<0.01;和黄芪水提液组比较:#p<0.05实验例3结果表明本发明药物组合物的活性成分对抗糖尿病肾病发生、发展细胞病理环节，对STZ糖尿病肾病模型大鼠有保护作用；还有降低肾脏氧化应激程度、减少终末糖基化产物引起纤维化，且防治效果明显优于黄甚水提液。权利要求一种防治糖尿病肾病的药物组合物，其特征在于该药物组合物由毛蕊异黄酮或毛蕊异黄酮苷中的一种或两种作为活性成分，和常规的药物载体组成，所述活性成分的重量百分比含量为0.1-99.5％。2.根据权利要求1所述的防治糖尿病肾病的药物组合物，其特征在于该药物组合物由毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷作为活性成分，和常规的药物载体组成，所述毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷的重量比为i:5-5:i。3.根据权利要求1或2所述的防治糖尿病肾病的药物组合物，其特征在于所述的常规的药物载体为稀释齐U、赋形齐U、填充齐U、粘合齐U、湿润剂、崩解齐iJ、吸收促进齐iJ、表面活性齐u、吸附载体、润滑齐u、香味剂或甜味剂中的至少一种，其中赋形剂为水，填充剂选自淀粉、蔗糖或乳糖；粘合剂选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂为甘油；崩解剂选自琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠；吸收促进剂为季铵化合物；表面活性剂为十六烷醇；吸附载体为高岭土或皂粘土；润滑剂选自滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇。4.根据权利要求3所述的防治糖尿病肾病的药物组合物，其特征在于所述药物组合物为片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、粒剂、胶囊或液体制剂。5.—种制备权利要求1所述的防治糖尿病肾病的药物组合物的方法，其特征在于将所述活性成分毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷中的一种或两种与所述常规的药物载体混合，即得。6.根据权利要求6所述的药物组合物的制备方法，其特征在于所述活性成分的毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷提取包括以下步骤a.取黄芪粉碎，加乙醇回流提取后过滤，合并滤液，减压回收溶剂，浓縮至无醇味，得黄芪醇提液，置冰箱冷藏过夜；b.取步骤a的黄芪醇提液上清液用大孔树脂吸附，先用纯水洗脱至流出液澄清，再用50%乙醇洗脱至薄层色谱检测无毛蕊异黄酮苷斑点为止；c.收集50%乙醇洗脱液减压浓縮，经等体积的醋酸乙酯萃取，合并萃取液浓縮得黄芪总黄酮浸膏；d.浸膏以硅胶柱层析，氯仿-甲醇=50:i-i:i梯度洗脱，薄层跟踪检测，合并相同的流份，静置析晶，抽滤，经甲醇重结晶，得毛蕊异黄酮和毛蕊异黄酮苷。7.毛蕊异黄酮和/或毛蕊异黄酮苷在制备防治糖尿病肾病的药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种药物组合物及其在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用，该药物组合物由活性成分毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷的一种或两种，以及药学上可接受的载体组成，所述活性成分的含量为0.1-99.5wt％。该药物组合物主要应用于制备治疗糖尿病肾病药物中。本发明的药物组合物对糖尿病肾病有显著的防治作用，使用方便，质量可控，为患者提供了新的治疗候选药物。文档编号A61K31/352GK101780069SQ20091003671公开日2010年7月21日申请日期2009年1月16日优先权日2009年1月16日发明者何宝,朱荃,段婷婷,汤丹,王汝上,石兴华,程慧荃,郑兆广,顾斐,黄晓玲,黄艳霞申请人:广州康臣药物研究有限公司