专利名称：紫堇块茎碱在制备抗柔嫩艾美耳球虫药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及有机化学，具体涉及一种杂环化合物。
背景技术：
紫堇块茎碱[(+)-紫堇块茎碱]是一种从植物中提取的天然生物碱，微量存在于罂粟科等植物中。该化合物的分子式是C19H21NO4，分子量327.374，其化学结构如式(1)所示。
紫堇块茎碱作为一种植物的天然提取物，已经从罂粟壳、大花地不容等多种药用植物中提取得到，但尚未见有将其作为药用的报道。有文献报道紫堇块茎碱能够抑制幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)II型脂肪酸合成途径中的丙二酰单酰辅酶A∶ACP转酰基酶的活性，其IC50值为33.1±3.291M，作者进一步的研究证实紫堇块茎碱是通过非竞争抑制的方式抑制了幽门螺旋杆菌中丙二酰单酰辅酶A∶ACP转酰基酶的活性(Liu等2006年)。但是幽门螺旋杆菌是原核生物，而艾美耳球虫是原生生物(虽然原生生物是真核生物中最低等的生物，但也和原核生物有本质上的区别)，且目前对于艾美耳球虫中的丙二酰单酰辅酶A∶ACP转酰基酶的结构等信息无任何报道，因此，紫堇块茎碱是否能起到抗艾美耳球虫的作用以及效果如何均属未知。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供紫堇块茎碱[(+)-紫堇块茎碱]的新用途。
本发明提供的紫堇块茎碱的新用途是用于制备抗柔嫩艾美耳球虫的药物。
本发明人发现，紫堇块茎碱能有效地抑制氨基酸序列如SEQ NO.1所示的丙二酰单酰辅酶A∶ACP转酰基酶的活性。该酶为柔嫩艾美耳球虫II型脂肪酸合成途径中的关键酶，紫堇块茎碱通过抑制该酶的活性导致柔嫩艾美耳球虫脂肪酸代谢的紊乱，引起球虫死亡，但对其宿主的脂肪酸代谢没有影响，从而达到抑制柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞目的。本发明人同时也通过体外抗球虫实验证明了紫堇块茎碱确实能抑制柔嫩艾美耳球虫入侵鸡球虫细胞。
体现本发明上述用途的药物由紫堇块茎碱和医学上可接受的辅料组成，可以制成散剂或可溶性粉剂；其中，散剂的用法是将所述散剂拌入饲料，使每100公斤饲料中混有2克所述紫堇块茎碱，然后按日常饲料量喂食；可溶性粉剂的用法是将所述的粉剂溶于饮用水中，使紫堇块茎碱的浓度为1g/100Kg水，然后按日常饮水量饮水。
为了更好地理解本发明，下面将通过相关实验证明紫堇块茎碱的抗柔嫩艾美耳球虫作用。
一、紫堇块茎碱的体外抗鸡球虫实验 1、鸡球虫细胞培养 采用常规的细胞培养技术制备鸡肾原代细胞，参见1970年Do ran报道的方法。
试验球虫为柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella，广东株)，子孢子制备方法参照1994年Xie报道的方法。
将Corytuberine溶于0.1％的二甲基亚砜(DMSO)配制成1000ug/mL的母液。
取细胞培养液，分装为4瓶，先分别加入制备好10000个的柔嫩艾美耳球虫子孢子，然后加入Corytuberine母液使Corytuberine的最终浓度为1、10、20、50和100ug/mL，混匀后分别加入到已培养至覆盖培养板面积>70％的贴壁鸡肾细胞上。
同时，在制备的细胞培养板上，只加入数量梯度为100个、1000个、10000个和100000个的子孢子，为药物评价时制备标准曲线所用。
培养8小时后，用新鲜的细胞培养液洗去没有入侵的子孢子和加入的Corytuberine，继续培养16小时。
上述各样品均进行3次重复试验。
上述方法中所述的细胞培养液由以下方法制备得到每毫升完全培养基RPMI-1640中加青霉100IU、链霉素100μg和10％灭活胎牛血清，然后调pH值为7.4。
2、药物作用效果的检测 (1)将上述培养物分别用0.05％ ED TA和0.25％胰酶洗脱，离心收集洗脱的肾细胞和入侵的子孢子，用高通量的RNA抽提试剂盒同时提取各样品的总RNA。
立即用Real-time专用的反转录试剂盒将提取的不同样品RNA进行反转录，得各样品的cDNA，4℃保存待用。
(2)根据已报道的鸡18SrRNA基因序列和鸡柔嫩艾美耳球虫的β-actin基因序列设计Real-time RT-PCR引物 用于扩增鸡18SrRNA基因长为170个核苷酸的序列片段的引物 上游C18FAGAAACGGCTACCACATCC(SEQ NO.2) 下游C18RGCACCAGACTTGCTC(SEQ NO.3) 用于扩增鸡柔嫩艾美耳球虫的β-actin基因长为305个核苷酸的序列片段的引物 上游PactinFCACACCGCCGAGAAGA(SEQ NO.4) 下游PactinRGAACAACATTGCCGTAGAGG(SEQ NO.5) 分别以步骤(1)所得的各样品的cDNA为模板在荧光定量PCR仪中进行检测。
(3)将利用引物对PactinF+PactinR检测的各样品CT值表示为CT[Pactin]，引物对C18F+C18R检测的相同样品CT值表示为CT[18S]。
将同一样品中二者的差值表示为△CT，如下 △CT＝CT[Pactin]-CT[C18s] 然后将各样品的△CT值(△CTn)与最低的△CT值(△CT1)相减得到△△CT值表示为△△CTn △△CTn＝△CTn-△CT1 将只加入100个、1000个、10000个和10000个的子孢子的样品和△△CTn值进行分析，发现子孢子数目和△△CTn成如线性关系，Log[子孢子剂量]＝-0.5630△△CTn+2.9787，如图1所述。
从而推导不同处理对于子孢子入侵细胞的抑制率如下
根据本发明的方法测定不同浓度Corytuberine处理所得到的△CT如表1所示，Corytuberine的助溶剂DMSO对照与不加药物和DMSO样品的△CT一致，可知DMSO对是试验的结果没有影响。以Corytuberine浓度值的对数作为X值用方程y＝min+(max-min)/[1+(x/EC50)^Hillslope]，进行标准曲线分析，结果图2所示，Corytuberine对抑制子孢子入侵细胞的效果随其浓度增大而提高，其半数抑制浓度为212.33ug/mL，证明Corytuberine具有抗球虫的作用，同时也验证了本发明柔嫩艾美耳球虫药物筛选方法的可靠性。
表1 此外，本发明还分析了Corytuberine对鸡细胞的影响。不同浓度药物处理的样品的CT[18S]表示样品中活细胞的水平，从表2可知，Corytuberine对鸡细胞没有影响。
表2 二、紫堇块茎碱抗柔嫩艾美耳球虫机理的探索 1、柔嫩艾美耳球虫丙二酰单酰辅酶A∶ACP转酰基酶(EtMCAT)的获得 (1)制备方法 A.根据序列表中的SEQ No.1的序列设计特异性引物，在引物的上游序列中引入BamH I酶切位点，在下游引物引入Sal I酶切位点；并分别加“CGC”3个碱基以保证内切酶发挥作用。
EtMCAT3F5′CGCGGATCCCCAATGAAGCGAGTGGCGCTGTTCT 3′(SEQ NO.6) EtMCAT3R5′CGCGTCGACTCACTCGACTCTGACGGTGCGGAC 3′(SEQ NO.7) 以步骤1所得总RNA为模板，通过RT-PCR扩增获得EtMCAT的功能片段； B.将扩增的片段和表达载体pET-32a(+)进行BamH I和Sal I双酶切后，进行连接，构建含有序列表中的SEQ ID No4所示基因的重组表达载体，利用CaCl2法转化表达菌E.coliRosseta(DE3)，30℃下用IPTG诱导表达，将表达产物经NTA Agarose纯化。
将表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图3所示，表达产物的分子量为52.5kDa，为载体TrxA蛋白+His标签(共20kDa)和EtMCAT(32.5kDa)的融合蛋白，和设计相符。
(2)所得融合蛋白的功能检测 利用酮戊二酸脱氢酶(KDH)偶连系统测定表达产物酶活性。在这个测定系统中，所述表达产物催化底物丙二酰单酰辅酶A(Malonyl-CoA)和酰基载体蛋白(holo-ACP)生成产物辅酶A(coASH)和酰基载体蛋白，如反应式①，而生成的辅酶A又可作为酮戊二酸脱氢酶(KDH)的底物，在酮戊二酸脱氢酶的催化下，与底物NAD和α酮戊二酸生成终产物NADH，酰基辅酶A和CO2，如反应式②；NADH可在340nm激发波长和465nm发射波长的条件下，发射荧光，通过检测荧光值的变化，参照此条件下NADH的标准曲线来测定EtMAT的酶活性。本试验用PerkinElmer公司VictorTM3 1420-524型多功能读板仪动态检测荧光数值。
①
② 具体测定方法如下 ①配制以下3种反应液 A液将待测酶活的样品加到含50mM PB buffer(pH6.8)，1mM EDTA，1mM DTT和0.1mg/ml BSA的溶液中。
B液将Malonyl-CoA溶于含50mM PB buffer(pH6.8)，1mM EDTA和1mM DTT的溶液中。
C液将ACP和KDH共溶于含8mM a-ketoglutaric acid，1mM NAD和0.8mM TPP的溶液中。
②将上述3种反应液及圆底黑色96孔板放入已设定为28℃的读板仪中预加热5分钟。
③依次将A液、C液和B液加入到圆底黑色96孔板中，并在同一板上设定无EtMCAT而用Tag、无KDH、无malonyl-CoA、无E.coli holo-ACP的对照。
④混匀后立即开始用VictorTM3 1420-524型多功能读板仪在激发波长340nm和发射波长465nm在28℃测定相对荧光值(RFU)，设定仪器30秒一个循环动态读取荧光值共15分钟，每一反应进行3次重复。
酶活检测结果显示，所得融合蛋白具有将催化底物Malonyl-CoA和holo-ACP生成产物coASH和酰基载体蛋白的活性，其酶活为73.25±4.86nmol/mg/min，说明该融合蛋白确实为载体TrxA蛋白+His标签与EtMCAT的融合蛋白，且载体TrxA蛋白+His标签对EtMCAT的催化活性没有影响。
2、紫堇块茎碱对EtMCAT酶活的抑制作用 (1)方法 将紫堇块茎碱(紫堇块茎碱)溶于1％的二甲基亚砜(DMSO)配制成以下浓度的溶液1、10、50和250uM。
将不同浓度的紫堇块茎碱与EtMCAT在28℃预孵育1小时，同时设DMSO对照(即用等体积不含紫堇块茎碱的DMSO同方法处理EtMCAT)。按照本实验第1节第(2)小节测定酶活的方法测定不同浓度紫堇块茎碱处理后的EtMCAT的RFU动态值，建立RFU/时间的动态曲线。
另外在按下述方法检测紫堇块茎碱对KDH酶活的影响 首先配制以下反应液 A反应液的配制CoA加到含50mM PB buffer(pH6.8)，1mM EDTA，1mM DTT配制成60uM的存储液； B反应液的配制KDH加入到75μL含有50mM PB buffer(pH6.8)，1mM EDTA，1mMDTT，2.67mM a-ketoglutaric acid，0.33mM NAD，0.267mM TPP； 然后按反应方程
建立反应体系反应体系为100μL，其中所含各物质终浓度分别为PB buffer(pH6.8)50mM，EDTA 1mM，DTT 1mM，a-ketoglutaric acid 2mM，NAD 0.25mM，TPP 0.2mM，CoA 15uM，KDH 3.75mU/100μL； 最后设4个反应体系，按顺序加入A反应液21.5μL、B溶液75μL和经不同浓度的紫堇块茎碱处理过的EtMCAT 3.5μL，混匀后立即开始用VictorTM3 1420-524型多功能读板仪在激发波长340nm和发射波长465nm在28℃测定NADH的相对荧光值(RFU)，设定仪器30秒一个循环动态读取荧光值共15分钟，每一反应进行3次重复；另外，同一板上设定无KDH、无CoA、无NAD、无α-ketoglutarate以及DMSO的对照。
(2)结果 Corytuberine对EtMCAT酶活的影响如表3所示，DMSO对照对EtMCAT的酶活性没有影响，各阴性对照均不能催化反应。反应体系的速率随着Corytuberine浓度的增加而降低，可见Corytuberine可有效地抑制EtMCAT的酶活。
表3 Corytuberine对KDH酶活的影响如表4所示，Corytuberine对KDH酶活无影响。
表4 以紫堇块茎碱浓度值的对数作为X值用方程y＝min+(max-min)/[1+(x/EC50)^Hillslope]进行标准曲线分析；结果图4所示，紫堇块茎碱对EtMCAT的IC50为16.47+2.38uM，进一步说明紫堇块茎碱能够有效的抑制EtMCAT活性。由此可以推测，紫堇块茎碱是以EtMCAT为作用靶标，通过抑制EtMCAT的酶活，造成球虫脂肪酸代谢紊乱，进而抑制球虫入侵宿主细胞。
图1是子孢子数目与△△CTn值的标准曲线图。
图2是紫堇块茎碱的浓度与子孢子入侵鸡细胞抑制率的曲线图。
图3是融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为标准蛋白，kDa一栏表示的是标准蛋白的分子量，泳道2是融合蛋白。
图4是紫堇块茎碱的浓度与酶活抑制率的关系曲线图。
具体实施例方式 例1 散剂的制备取2.5g紫堇块茎碱(含量不低于99％)和97.5g淀粉混匀，即可。
用法用量将上述100克散剂拌入125公斤饲料中，按日常食量喂食。
例2 可溶性粉剂的制备取2.5g紫堇块茎碱(含量不低于99％)和97.5g葡萄糖混匀，即可。
用法用量将上述100g粉剂溶于250升水中。在用药前给病鸡断水2小时，然后按正常饮水量喂食。
序列表
<110>广东省农科院兽医研究所
<120>紫堇块茎碱在制备抗柔嫩艾美耳球虫药物中的应用
<160>7
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>311
<212>PRT
<213>Eimeria tenella
<400>1
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
<210>3
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
<210>4
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
<210>6
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>权利要求
1、紫堇块茎碱在制备抗柔嫩艾美耳球虫的药物中的应用。
2、一种抗球虫药物，该药物由紫堇块茎碱和医学上可接受的辅料组成。
3、如权利要求2所述的药物，其特征是所述的药物为水溶性粉剂。
全文摘要
本发明提供了紫堇块茎碱的新用途，该用途是用于制备抗柔嫩艾美耳球虫药物。紫堇块茎碱能有效地抑制氨基酸序列如SEQ NO.1所示的丙二酰单酰辅酶A∶ACP转酰基酶的活性。该酶为柔嫩艾美耳球虫II型脂肪酸合成途径中的关键酶，抑制该酶的活性可导致柔嫩艾美耳球虫脂肪酸代谢的紊乱，但对柔嫩艾美耳球虫宿主的脂肪酸代谢没有影响，从而达到抑制柔嫩艾美耳球虫入侵鸡肠上皮细胞目的。
文档编号A61K31/473GK101474181SQ200910037240
公开日2009年7月8日 申请日期2009年2月18日 优先权日2009年2月18日
发明者蔡建平, 孙铭飞, 覃宗华, 袁建丰, 吕敏娜, 余劲术, 吴彩艳 申请人:广东省农业科学院兽医研究所