一种制备rhCNB二聚体的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种制备rhCNB二聚体的方法。
【背景技术】
[0002] CNB是|丐调蛋白磷酸酶Calcineurin,CN)的调节亚基。CN是目前所知唯--种依 赖Ca2+/CaM的蛋白磷酸酶，它具有比较窄的底物专一性。于上世纪70年代末、80年代初由 加籍华人王学荆、美籍华人张槐耀及美国的ClaudeB.Klee分别发现并从牛脑中提纯。该 酶由A、B二亚基以1:1的比例组成。A亚基（CNA)是催化亚基，相对分子质量61X103;B亚 基（CNB)是调节亚基，相对分子质量19X103。
[0003] 魏群教授在对CNB长达约20年的研究中发现，CNB在动物及细胞水平上具有 良好的抑制肿瘤生长的效果，与其他抗癌药相比处于较高水平，而毒副作用极低，适用范 围广。并于1998年申请了专利"含有钙调神经磷酸酶B亚基的药物组合物"，专利号为 98117642. 9,该专利中公开了含有钙调神经磷酸酶B亚基的药物组合物的分离纯化方法， 具体描述为"破碎后菌体经l〇〇°C沸水浴30~40分钟，然后经12000rpm离心20分钟，取 上清，此为CaNB亚基的粗提液。按体积加3mmol/LCaCl2，lmmol/Lf3疏基乙醇和0. 5mol/ LNaCl后上预先经缓冲液（20mmol/LTris，pH7.4,0.5mmol/LCaCl2lmmol/LP疏基乙醇） 平衡的phenel-sepharoseCL-4B层析柱，再用同样的缓冲液洗尽杂蛋白，最后用缓冲液 20mmol/Ltris,pH7. 4,lmmol/LEGTA, 0· 5mmol/LDTT洗脱，每升菌液可得电泳纯CaNB亚 基~120mg，所得产物可冷冻干燥保存。
[0004] 专利号98117642. 9所述纯化工艺所得产品为CaNB的药物组合物，并且工艺中带 有β疏基乙醇、DTT、EGTA等物质未经下一步清除。
[0005] 因此，提供一种高纯度的rhCNB二聚体的方法具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供一种制备rhCNB二聚体的方法。本发明工艺终产品为rhCNB 二聚体，工艺具有创新性且重复性好，适用于中试及生产规模。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种制备rhCNB二聚体的方法，包括如下步骤：
[0009] 步骤1 :制备获得rhCNB溶液；
[0010] 步骤2 :在pH值为6. 0~7. 0, 2~15°C的反应条件下，取所述rhCNB溶液与氧化 剂混合，氧化12~24h，终止氧化后，纯化分离。
[0011] 在本发明中，粗纯液是菌体经过细胞破壁、分离，进行初步纯化得到的蛋白溶液， 尚待进一步纯化。
[0012] 在本发明的一些具体实施方案中，所述氧化剂的加入方式为每1~5h分段加入。
[0013] 在本发明的一些具体实施方案中，所述rhCNB溶液与所述氧化剂的质量比为20 : 1 ~30 :1〇
[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，所述氧化剂为过氧化氢、碘、氧化型谷肽甘肽、 谷胱甘肽氧化还原对或氧气中的一种或两者以上的混合物。
[0015] 在本发明的一些具体实施方案中，所述氧化剂的浓度为0. 05%~1% (w/w)。
[0016] 在本发明的一些具体实施方案中，所述终止氧化的试剂为氧化终止液，所述氧化 终止液为亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、0. 1%DTT或还原型谷胱甘肽中的一种或两者以上的混合 物。
[0017] 在本发明的一些具体实施方案中，所述氧化终止液的浓度为0. 05%~1% (w/w)。
[0018] 在本发明的一些具体实施方案中，所述rhCNB溶液与所述氧化终止液的质量比为 50 :1 ~100 :1〇
[0019] 在本发明的一些具体实施方案中，所述分离纯化采用分子排阻色谱层析，所述分 子排阻色谱层析采用10mM枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液在pH值为5. 8~7. 0的条件下洗脱， 收集rhCNB二聚体蛋白峰。
[0020] 在本发明的一些具体实施方案中，所述分子排阻色谱层析采用分离范围为 3000~70000Da的介质。
[0021] 具体的，获得rhCNB蛋白溶液的制备方法包括：通过适宜的培养基培养含有目标 蛋白的发酵液，经管式离心机离心后收集含目标蛋白的湿菌体，加入5~20倍的重悬缓冲 液，其中重悬缓冲液包括还原性物质、酶抑制剂；搅拌均匀在适当的温度下使杂蛋白聚集沉 淀，离心后收集上清液。加入还原性物质是为了维持过程中较高含量的rhCNB单链结构， 相比不添加还原性物质而言，回收率提高。其中，适宜的培养基每lkg培养基含：Tryptone 20~50g、YeastExtract9~35g、氣化纳4~12g、甘油12~50g、憐酸二氛钟2~10g、 磷酸氢二钾三水合物2~10g、氢氧化钠2g。
[0022] 收集上清液，上样于经平衡液A平衡的疏水介质层析柱中，PhenylSepharose 6FastFlow(lowsub)填料，经平衡液A再平衡洗去未结合的蛋白，杂蛋白洗脱液B洗去疏 水性弱的蛋白，最后用目的蛋白洗脱液C洗脱目的蛋白，获得含CNB组合物的目的蛋白。其 中，每lkg平衡液A含：TRIS1. 5~3. 5g，氯化钠30~70g，氯化钙0. 2~1. 0g，盐酸1. 0~ 1. 5g。每lkg杂蛋白洗脱液B含：TRIS1. 5~3. 5g，氯化|丐0· 2~1. 0g，盐酸1. 0~1. 5g。 每lkg目的蛋白洗脱液C含：TRISL5~3.5g，EGTA0.1~0.5g，盐酸L0~L5g。
[0023] 本发明提供了一种制备rhCNB二聚体的方法，包括如下步骤：步骤1:制备获得 rhCNB溶液；步骤2 :在pH值为6. 0~7. 0, 2~15°C的反应条件下，取所述rhCNB溶液与氧 化剂混合，氧化12~24h，终止氧化后，分离纯化。
[0024] 本发明是在还原剂DTT的还原作用下，形成90%以上的单体，再采用特有的氧化 还原对使单体99%以上转化为二聚体，同时通过浓度、温度、时间有效控制多聚体的形成， 得到高含量二聚体的rhCNB。工艺路线为还原-氧化-还原终止氧化。
[0025] 1、初步纯化的rhCNB溶液，含有90%以上的单体，本步骤选择pH6. 0~7.0,温度 2~15°C反应条件，分段加入低浓度氧化剂（0. 05 %~1 %过氧化氢溶液），使rhCNB单体缓 慢的向二聚体转化，二聚体达到75%及以上、多聚体1%时，加入低浓度氧化终止液（0. 1% 亚硫酸氢钠）中和氧化剂，避免继续氧化使三聚体及以上聚体的形成。转化的原理是rhCNB 单体含有游离的巯基，在氧化环境下，两个游离的巯基形成一个二硫键，达到转化为二聚体 的目的，同时考虑了缓冲液pH值、温度对反应速度的影响。
[0026] 2、步骤2中含较高含量二聚体的CNB组合物，尚含有单体和少量三聚体，本步骤中 该CNB组合物上样于经平衡液平衡的分子排阻层析柱（含分子排阻填料），根据分子量大小 被缓冲液先后洗脱，获得二聚体纯度达98%以上，三聚体及以上聚体< 0. 5%。
[0027] 综合上述实验结果，本发明工艺终产品为rhCNB二聚体，工艺具有创新性且重复 性好，收集到的蛋白溶液经纯度检测，二聚体含量在98%以上，多聚体含量小于0. 5%。
【附图说明】
[0028] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0029] 图1示实施例2氧化后蛋白组分比例结果；
[0030] 图2示实施例2氧化后经分子排阻色谱分离后蛋白组分比例结果；
[0031] 图3示实施例3氧化后蛋白组分比例结果；
[0032] 图4示实施例3氧化后经分子排阻色谱分离后蛋白组分比例结果；
[0033] 图5示实施例4氧化后蛋白组分比例结果；
[0034] 图6示实施例4氧化后经分子排阻色谱分离后蛋白组分比例结果；
[0035] 图7示实施例5氧化后蛋白组分比例结果；
[0036] 图8示实施例5氧化后经分子排阻色谱分离后蛋白组分比例结果；
[0037] 图9示实施例6氧化后蛋白组分比例结果；
[0038] 图10示实施例6氧化后经分子排阻色谱分离后蛋白组分比例结果；
[0039] 图11示实施例7筛选试验1蛋白组分比例结果；
[0040] 图12示实施例7筛选试验2氧化Oh蛋白组分比例结果；
[0041] 图13示实施例7筛选试验2氧化5h蛋白组分比例结果；
[0042] 图14示实施例7筛选试验2氧化9h蛋白组分比例结果；
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