链球菌m蛋白,免疫原性片段,核酸和应用方法

专利名称：链球菌m蛋白,免疫原性片段,核酸和应用方法
技术领域：
本发明涉及具体的蛋白和核酸。更具体地，本发明涉及海豚链球菌 (Streptococcus iniae)的分离的蛋白和核酸，以及它们在诊断和/或治疗动物尤其是鱼 中的海豚链球菌感染的用途。
背景技术：
最近十多年来，海豚链球菌已变成最严重的水生病原体，在较温暖地区给养殖的 海水和淡水水族(farmed marine and freshwater finfish)带来非常大的损失。海豚链 球菌首先是在1976年从一只被囚禁的亚马逊淡水海豚中发现的，并因此而以海豚命名该 菌，它遍及全球的暖水水族养殖场。迄今为止发现的易感于海豚链球菌感染的鱼类参见 Agnew&Barnes, 2007, Vet. Microbiol. 1221 白勺胃 $。海豚链球菌还具有人畜共患潜质，已在美国、加拿大和整个亚洲都发现了人类感 染。人类的感染明显是机会性的，迄今发现的所有病例都与制备已被污染的鱼期间穿刺伤 的直接感染有关，一般以老人或免疫力低下的个体好发(Agnew&Barnes，2007，同上)。已知抗体能有效治疗一些鱼的感染。还发现恩诺沙星(Enrofloxacin)、土霉素 (oxytetracycline)、呋喃唑酮(furazolidone)和阿莫西林(amoxicillin)能用于治疗鱼 的海豚链球菌感染，只是它们的效力在不同物种之间有差异。然而，养殖场使用抗微生物制 剂受到一些限制，也有一些担心。首先是密集群体间的耐药性选择。其次引起注意的是人 用养殖鱼中药物的残留。最近发展出的一种控制海豚链球菌的方法是疫苗接种。以色列在1995至1997年 已成功开始一项针对养殖的虹鳟的计划，用由全细胞福尔马林灭活的海豚链球菌组成的自 体疫苗进行腹腔注身寸(Bercovier et al. , 1996, Immunization with Bacterial Antigens infections with streptococci and relatedorganisms. Second International Symposium in Fish Vaccinology ppl53-60 ；Eldar et al. ,1997, Vet.Immunol. Immunpathol. 56 175)。鱼群受到4个月的保护，这覆盖了虹鳟在以色列的短短繁殖周期的 绝大部分时间段(Bercovier etal.，1996，同上)。上加利利(Upper Galilee)地区的大 规模接种项目使每年因海豚链球菌导致的死亡率从50%降低到5%以下(Eldar et al., 1997，同上)。有证据表明，保护作用的基本机制是由抗体介导的，可能是对基于热稳定蛋白 的抗原决定簇起反应而产生的(Bercovier et al.，1996，同上)。抗体在提供保护作用方面所起的作用的证据还得到以下支持有数据显示，用 抗海豚链球菌血清对罗非鱼(tilapia)进行被动免疫也有保护(Shelbyet al. ,2002, J. Fish. Dis. 251)。但是，该接种计划的成功是短暂的。1997年，由于这种细菌产生新的变 体，引起非常多次的新爆发流行。与之前的分离物不同，这种变体是精氨酸双水解酶和核 糖阴性，似乎改变了它的荚膜组成(Bachrach et al. ,2001, Appl. Environ. Microbiol. 67 3756 ；Zlotkin et al.，1998，Appl. Environ. Microbiol. 64 4065)。已显示，以色列的接种 计划使一些病原体残存在鱼体内或环境中，有足够的选择压力使得一种明显不同的血清型 占据了主导地位(Bachrach et al.，2001，同上)。
最近，在亚洲部分地区出现了两种新疫苗能针对海豚链球菌感染提供保护。一种 是单价灭活疫苗(Norvaxl Strep Si)，可以以浸没制剂(immersion)或注射制剂的形式使 用。先灵葆雅(Schering-Plough)开发了 AquaVac^Garvetil ，它提供针对海豚链球菌和 格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)的联合保护作用，可以以浸没制剂的形式给予，或者 加在食物中口服。尽管已有海豚链球菌疫苗，这种病原体仍然是鱼类和其它动物中的主要问题。因 此，仍需要鉴定和分离海豚链球菌中能用于诊断和/或治疗动物的海豚链球菌感染的分子 成分。发明概述本发明涉及海豚链球菌的分离的M蛋白或M样蛋白，以及编码所述M蛋白或M 样蛋白的分离的核酸，所述蛋白在具体的非限制形式中，可表现出相对减少的血纤蛋白原 (fibrinogen)结合。本发明还涉及用于诊断和/或治疗动物的海豚链球菌感染的组合物和方法。一方面，本发明提供海豚链球菌的分离的M蛋白或M样蛋白。在一个实施方案中，所述分离的M蛋白或M样蛋白可包含选自下组的氨基酸序列 RLTLEEKMEALRKVVT(SEQ ID NO 1)和 KMAEIQEEANKKIAA(SEQ ID NO :2)。在具体实施方案中，所述海豚链球菌的分离的M蛋白或M样蛋白可包含氨基酸序 列 SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO :4。另一方面，本发明提供比含有氨基酸序列SEQ ID NO :3或SEQ IDNO :4的分离的 蛋白对血纤蛋白原的结合减少或降低的分离的蛋白，所述分离的蛋白包含海豚链球菌M 蛋白或M样蛋白的氨基酸序列，但不含有选自下组的氨基酸序列RLTLEEKMEALRKVVT (SEQ ID NO 1) ；KMAEIQEEANKKIAA (SEQ ID NO 2)；以及 SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO 4 的残基 190-220中的一或多个残基。所述与血纤蛋白原的结合减少的分离的蛋白可包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO 5 ；SEQ ID NO 6 禾口 SEQ ID NO :7。另一方面，本发明提供分离的蛋白，其包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO 1 ； SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO 3 ；SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO 5 ；SEQ ID NO 6 ；禾口 SEQ ID NO :7。另一方面，本发明提供上述任一方面的分离的蛋白的片段、变体或衍生物。另一方面，本发明提供编码上述任一方面的分离的蛋白、其片段、变体或衍生物的 分离的核酸。所述分离的核酸可包含SEQ ID NOS :8_11和39任一所示的核苷酸序列。另一方面，本发明提供遗传构建体，其包含上述任一方面的分离的核酸。另一方面，本发明提供宿主细胞，其包含上述方面的遗传构建体。另一方面，本发明提供与海豚链球菌的分离的M蛋白或M样蛋白、或其片段、变体 或衍生物结合的抗体。另一方面，本发明提供组合物，其包含上述任一方面所述的海豚链球菌的分离的M 蛋白或M样蛋白、或其片段、变体或衍生物、或其抗体，以及合适的载体，稀释剂或赋形剂。所述组合物可以是能激发抗海豚链球菌的免疫应答的免疫治疗性组合物。所述组合物可以是能激发抗海豚链球菌的保护性免疫应答的疫苗。
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另一方面，本发明提供了治疗动物的海豚链球菌感染的方法，所述方法包括对感 染了海豚链球菌的动物施用组合物、从而治疗所述感染的步骤，所述组合物包含海豚链球 菌的分离的M蛋白或M样蛋白、或其片段、变体或衍生物、或其抗体，以及合适的载体，稀释 剂或赋形剂。另一方面，本发明提供了免疫动物以抵抗海豚链球菌的方法，所述方法包括对感 染了海豚链球菌的动物施用组合物、从而免疫所述动物的步骤，所述组合物包含海豚链球 菌的分离的M蛋白或M样蛋白、或其片段、变体或衍生物、或其抗体，以及合适的载体，稀释 剂或赋形剂。另一方面，本发明提供了确定动物是否正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其成 分的方法，所述方法包括，确定从所述动物获得的生物学样品是否包含分离的蛋白或其片 段、变体或衍生物的步骤，它们的存在表示所述动物正在或已经暴露于海豚链球菌或其成 分。另一方面，本发明提供确定动物是否正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其成分 的方法，所述方法包括，确定从所述动物获得的生物学样品是否包含上述任一方面所述的 分离的核酸的步骤，所述分离的核酸的存在表示所述动物正在或已经暴露于海豚链球菌或 其成分。另一方面，本发明提供确定动物是否正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其成分 的方法，所述方法包括，确定从所述动物获得的生物学样品是否包含与海豚链球菌的分离 的M蛋白或M样蛋白结合的抗体或抗体片段的步骤，所述抗体或抗体片段的存在表明所述 动物正在或已经暴露于海豚链球菌或其成分。另一方面，本发明提供诊断试剂盒和/或诊断组合物，其包含一或多种用于检测 海豚链球菌、其分子成分或其抗体的检测试剂。诊断试剂盒和/或组合物可包含一或多种适合基于核酸或基于蛋白的检测的检 测试剂，并包含一或多种抗体、探针和/或引物以便于检测海豚链球菌M蛋白或M样蛋白， 其编码核酸和/或片段。在本说明书全文中，除非另外指明，“包含”和“含有”表示包含而非排除，因此所提 到的一个或一组整数可包括一或多个未提及的整数或整数组。


图1.海豚链球菌QMA72菌株编码M蛋白的核苷酸序列(SEQ IDNO 8)。图2.海豚链球菌QMA76菌株编码M蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO 9)。图3.海豚链球菌QMA141菌株编码M蛋白的核苷酸序列(SEQ IDNO 10)。图4A.海豚链球菌QMA136菌株编码M蛋白的核苷酸序列(SEQ IDNO 11)。该核苷 酸序列包括分别编码QMA136的M蛋白N-端氨基酸序列(SEQ ID NO 6)和QMA136的M蛋 白C-端氨基酸序列(SEQ ID NO 7)的分隔开的开放读框(残基1-609和残基677-1606)。图4B.海豚链球菌QMA136菌株的M蛋白N-端氨基酸序列(SEQ IDNO 6)。图4C.海豚链球菌QMA136菌株的M蛋白C-端氨基酸序列(SEQ IDNO 7)。图5.海豚链球菌M蛋白氨基酸序列SEQ ID NOS :3_7)的氨基酸比对。图 6 来自分离物 QMA0072(SEQ ID NO 3), QMA0076 (SEQ ID NO :4)禾口 QMAO141 (SEQ
6ID NO 5)的M蛋白与停乳链球菌(S. dysgalactiae)demA基因产物(CAB65411 ；SEQ ID NO 12)的氨基酸序列比对。图7.海豚链球菌simA基因(SEQ ID NO 39)和M蛋白(SEQ ID NO 4)的核苷酸 序列和氨基酸序列。推定的Mgx蛋白结合位点用粗体表示，推定的启动子序列(-10和-35 序列盒和核糖体结合位点-RBS-序列)用框表示，反向重复序列用三角重点标示，膜锚 (membrane anchor)为斜体，终止子为粗体并带星号。图8. M蛋白的表达和Western印迹。图A 来自大肠杆菌表达裂解物的蛋白考马 斯亮蓝染色。泳道1-分子量标志，泳道2-对照裂解物，泳道3-QMA0072，泳道4-QMA0076， 泳道5-QMA0141。图B :M蛋白用生物素化血纤蛋白原进行Western印迹检测。泳道1_5对 应于考马斯亮蓝染色的凝胶。图9.血纤蛋白原结合对海豚链球菌对尖吻鲈(barramundi)巨噬细胞活化作用的 影响。海豚链球菌分离物QMA0072在指数期收获，与血纤蛋白原、BSA或HBSS —起保温，呼吸 爆发(respiratory burst)通过鲁米诺(luminal)增强型化学发光(chemiluminescence) 检测。图10.海豚链球菌疫苗试验的Kaplan-Meyer存活曲线。图11.两种疫苗基于2个平行试验(BL21simA)或单个试验(pUK21simA)的相对 百分比存活。RPS参照合适的对照(E.coli BL21或空的pUK21载体)进行计算。优选实施方式详述本发明涉及分离和鉴定海豚链球菌M蛋白同工型(isoform)，其可用于诊断和/或 治疗动物的海豚链球菌感染，所述动物包括但不限于鱼和哺乳动物，后者如人类和海豚。
一方面，本发明提供海豚链球菌的分离的M蛋白或M样蛋白。为了本发明的目的，“分离的”是指物质脱离其天然状态或经历了人为操作。分 离的物质可以实质上或基本上不含在其天然状态中正常与其相伴的成分，或者可以经过操 作，与在其天然状态中正常与其相伴的成分一起成为人工状态。分离的物质可以是天然的、 化学合成的或重组形成的。本文中，“海豚链球菌M蛋白”或“海豚链球菌M样蛋白”是可从海豚链球菌获得的 蛋白，和/或包含可从海豚链球菌获得的蛋白的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白当为M样蛋白 时在结构和功能上与另一种A族链球菌的M蛋白为直系同源(orthologous)或至少是相关 的。“M蛋白”是A族链球菌的蛋白，常见于外延至外周荚膜的细菌细胞壁上。M蛋白可 以在不同血清型之间有差异。M蛋白也可以通过保护细菌细胞免受胞吞作用而给链球菌提 {共母力O“蛋白”是指氨基酸聚合物。所述氨基酸可以是本领域众所周知的天然或非天然的 氨基酸，D-或L-氨基酸。“肽”是少于50个氨基酸的蛋白。“多肽”是有50个以上的氨基酸的蛋白。本发明各个方面提供了海豚链球菌的分离的M蛋白，包括所述M蛋白的片段、变体 或衍生物。在具体方面，所述海豚链球菌的分离的M蛋白包含氨基酸序列SEQ IDNO 3或SEQID NO :4。本发明还提供了海豚链球菌M蛋白的同工型，推定其在M蛋白的基因中插入40个 核苷酸，其不包含氨基酸序列 RLTLEEKMEALRKVVT(SEQID NO 1)和 KMAEIQEEANKKIAA(SEQ ID NO 2)中的至少一个序列。这些蛋白的实例在本文中见SEQ ID N0S:6和7。后文提供的数据表明，这些M蛋 白显示出对血纤蛋白原的结合减少。而且，含氨基酸序列SEQ ID NO :5的M蛋白不包含氨基酸序列 RLTLEEKMEALRKVVT(SEQ ID NO :1)和KMAEIQEEANKKIAA(SEQ IDNO :2)，但显示与血纤蛋白原 的结合减少。此外，或备选地，缺少SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4的残基190-220中的一或多个
残基的M蛋白可结合减少量或降低水平的血纤蛋白原。虽然缺乏RLTLEEKMEALRKVVT (SEQ ID NO 1), KMAEIQEEANKKIAA (SEQ ID NO 2)和 /或缺乏SEQ ID NO :3或SEQ IDNO 4的残基190-220中的一或多个残基是结合减少量或 降低水平的血纤蛋白原的M蛋白或M样蛋白的特征，但并不是说，这些氨基酸序列构成了血 纤蛋白原结合位点，或对血纤蛋白原结合作出贡献。合适地，血纤蛋白原结合比含有选自SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的氨基酸序列 的分离的M蛋白减少。“减少或降低”在上下文中是指，被具有氨基酸序列SEQ ID NO :3或SEQID NO 4 的M蛋白结合的血纤蛋白原的量少于99 %，在一个方面少于95 %，在一个方面少于90 %，在 一个方面少于75%，在另一方面少于50%或少于40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、 3%、2%或1%，“分子比分子”。不希望受任何具体理论束缚，我们认为，血纤蛋白原可能掩盖对海豚链球菌M蛋 白的免疫应答，在这种情况下，与血纤蛋白原的结合减少的分离的蛋白可能是对动物给药 的特别有用的免疫原。本文中，“动物”包括且涵盖易感于海豚链球菌感染的动物，包括但不限于鱼和哺 乳动物，如人类和海豚。“鱼”在本文中的范围包括无颂鱼(Agnatha)，没有颂的鱼如粘盲鳗(hagfish) 和七鳃鳗(lampreys)；软骨鱼(Chrondrichthyes)，骨骼由软骨构成的鱼；以及，硬骨鱼 (Osteichthyes)，骨骼大都由硬骨构成的鱼。硬骨鱼主要包含两大类线鳍鱼(ray-firmed fish)和叶鳍鱼(lobe-finned fish)。本发明一个方面，所述鱼是线鳍鱼。易感于海豚链球菌感染、可应用本发明的鱼的非限制性实例包括市场上很重要的 鱼，如大马哈鱼(salmon)，尖吻鲈，花鲈(seabass)，鲆鲽(flounder)，鳟鱼(trout)，鲷鱼 (bream)，啮鱼(snapper)，尼罗河巨鲈(Nile perch)，罗非鱼，鲻鱼(mullet)，鳕鱼(cod)和 有黄尾的鱼(yellowtail)。更多易感于海豚链球菌感染的鱼见Agnew&Barnes，2007，同上。另一方面，本发明提供海豚链球菌的分离的M蛋白的片段、变体或衍生物，包括具 有减少的血纤蛋白原结合的分离的蛋白。“蛋白片段”是蛋白的少于100%氨基酸序列的节段、域、部分或区。例如，蛋白片段可包含最多该蛋白的99%，95%，90%，85%，80%，75%，70%，
865%,60%,55%,50%,45%,40%,35%,30%,25%,20%, 15%, 10%,5%,3%,2%^ 1% 在具体方面，所述蛋白片段可包含例如海豚链球菌M蛋白的至少5，10，20，30，40， 50 60，70，80，90，100，120，140，150，200，250，300，350，400，450 或 500 个连续氨基酸。肽可以是蛋白片段，例如，包含至少6，10，12，15，20，30，40个，最多50个连续氨基酸。蛋白片段，包括肽片段，可通过标准的重组核酸技术获得，或用常规液相或固相 合成技术合成得到。例如，溶液合成或固相合成可参见CURRENT PROTOCOLS INPROTEIN SCIENCE，第 18 章，Coligan 等编(JohnWiley&Sons，1995-2000)。或者，肽可通过用蛋白酶 如endoLys-C，endoArg-C, endoGlu-C和V8-蛋白酶消化本发明的多肽来产生。被消化的片 段可通过层析纯化，就像本领域众所周知的那样。在本发明各个方面，蛋白片段可以是“生物活性蛋白片段”，其展示全长海豚链球 菌M蛋白的生物活性的至少25 %，更优选至少50 %，还更优选至少70 %，75 %，80 %，85 %， 90%，95%或 最多100%。生物活性可以是免疫原性，抗原性和/或血纤蛋白原结合，但不限 于这些。所述蛋白片段的非限制性实例包括，不含氨基酸序列RLTLEEKMEALRKVVT(SEQ ID NO 1)和KMAEIQEEANKKIAA(SEQ IDNO 2)、或者缺乏这两个序列中的一个或另一个的分离 的M蛋白。所述片段的具体实例分别包含氨基酸序列SEQ ID NOS 6和7，其展示相对减少的
血纤蛋白原结合。备选地，生物活性蛋白片段可展示比全长海豚链球菌M蛋白增强的活性。分别含有氨基酸序列SEQ ID NOS :6和7的蛋白片段可展示比全长海豚链球菌M 蛋白增加的或增强的免疫原性。在其它实施方案中，生物活性片段可包括本发明M蛋白的成熟加工形式。例如，生物活性片段可缺乏N-端信号序列。非限制性实例包括，缺乏氨基酸1-41 的N-端加工的M蛋白。本发明还提供本发明分离的蛋白的变体。“变体”在其范围内包括，天然变体如等位基因变体，直系同源物(ortholog)和同 系物和人工创建的突变体，等等。术语"突变"用在本文中一般涵盖在分离的蛋白或其片段中的保守或非保守的 氨基酸取代、缺失和/或插入。一般地，蛋白变体具有与本发明分离的蛋白，例如SEQ ID NOS 1_7任一所示的蛋 白，至少80%的氨基酸序列同一性。在本发明一些方面，蛋白变体具有与本发明分离的蛋 白，例如 SEQ ID NOS :1-7 任一所示的蛋白，至少 85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%， 96 %，97 %，98 %或99 %的氨基酸序列同一性。本文用于描述核酸或蛋白的序列关系的术语包括，“对比窗口(comparison window) ”，“序列同一性”，“序列同一性百分比”和“实质同一性(substantial identity)，，。 由于核苷酸或氨基酸序列各自可能包含(1)完整序列上为这些核酸或蛋白共有的仅一个 或多个部分，和(2)在这些核酸或蛋白上有差异的一或多个部分，序列比较通常是在“比对 窗口 ”中比较序列、以便鉴定和比较局部区域的序列相似性。“比对窗口 ”是指与参考序列相比较的通常至少6，10，12，20或更多个连续残基的概念性节段。比对窗口可包含与参考序 列相比而言的约20%或更少(例如5，10或15%)的插入或缺失(即空隙)，以便于各个序 列的最佳比对。在比对窗口中进行序列最佳比对可用计算机中运行的算法(如ECLUSTALW 和BESTFIT，由WebAngis GCG，2D Angis,GCG and GeneDoc项目提供，将其引入本文作参考) 来进行，或通过目测进行，最佳比对(即，导致在该比对窗口中出现最高百分比同源性)通 过多种方法中所选的任一种方法产生。本文中，“蛋白衍生物”是指在海豚链球菌的天然M蛋白的氨基酸序列中含有一或 多个化学和/或结构修饰或改变。仅为举例的目的，蛋白衍生物可包含一或多个修饰，包括氨基酸侧链修饰，非天然 氨基酸，糖基化氨基酸残基，交联的氨基酸残基，和/或其它氨基酸残基。本发明范围内的氨基酸侧链修饰的例子包括，用乙酸酐酰化；用琥珀酸酐和 四氢苯二甲酸酐(tetrahydrophthalic anhydride)使氨基酰化；用乙酰亚氨酸甲酯 (methylacetimidate)进行脒基化(amidination)；用氰酸根(cyanate)对氨基进行甲氨酰 化(carbamoylation)；用吡哆醛_5_磷酸使赖氨酸发生吡哆醛化(pyridoxylation)，再用 NaBH4还原；通过与醛反应而发生还原性烷基化，再用NaBH4还原；和用2，4，6-三硝基苯磺 酸(TNBS)使氨基发生三硝基苯甲基化。羧基的修饰可以是，经过0-酰基异脲(Ο-acylisourea)形成，进行碳二亚胺活化 作用，随后对例如相应酰胺进行衍生化。精氨酸的胍基可通过与诸如2，3- 丁二酮(butanedione)，苯甲酰甲醛 (phenylglyoxal)和乙二醛(glyoxal)等试剂形成杂环缩合物而修饰。巯基的修饰方法例如，对半胱磺酸(cysteic acid)进行过甲酸(performicacid) 氧化；用4-氯汞苯磺酸，4-氯汞苯甲酸酯(盐)，2_氯汞(Chl0r0merCuri)-4-硝基苯 酚(nitrophenol)，苯基汞氯化物，和其它汞剂形成汞(mercurial)衍生物；与其它硫 代化合物形成混合型二硫键；与马来酰亚胺，马来酸酐或其它取代的马来酰亚胺反应； 与碘乙酸或碘乙酰胺发生羧甲基化；以及与氰酸酯(盐)在碱性pH发生氨基甲酰化 (carbamoylation)0色氨酸残基的修饰方法例如，将吲哚环用2-羟基-5-硝基苯溴化物或磺酰卤化物 进行烷基化，或用N-溴琥珀酰亚胺进行氧化。酪氨酸残基的修饰可以是，用四硝基甲烷硝化，形成3-硝基酪氨酸衍生物。组氨酸残基的咪唑环的修饰可以是，用二乙基焦碳酸酯(diethylpyrocarbonate) 进行N-乙酯基化，或用碘乙酸衍生物烷化。在肽合成期间掺入非天然氨基酸和衍生物的例子包括但不限于，使用4-氨基丁 酸，6-氨基己酸，4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸，4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，叔丁基甘 氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，苯基甘氨酸，鸟氨酸，肌氨酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的 D-异构体。衍生物还包括分离的融合蛋白，其包含额外的氨基酸序列如N-或C-端融合配偶 序列。融合配偶帮助鉴定和/或纯化含有该融合配偶的融合蛋白。融合配偶的众所周知的例子包括但不限于，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，Fc和人 IgG铰链区，麦芽糖结合蛋白(MBP)和六聚组氨酸(HIS6),它们都特别有用于通过亲和纯化
10分离融合蛋白。为了通过亲和纯化分离融合蛋白，相关的亲和层析基质分别是谷胱甘肽_， 直链淀粉_，和镍-或钴-偶联的树脂。多种这类基质以试剂盒(“kit”)的形式提供， QIAexpress 系统(Qiagen)可用于(HIS6)融合配偶，还有Pharmacia GST纯化系统。在有些例子中，融合配偶还有蛋白酶裂解位点，如凝血因子Xa或凝血酶，其允许相 关蛋白酶对本文所述融合蛋白进行部分消化，并因此释放本发明的蛋白。所释放的蛋白然 后可提供层析分离技术与融合配偶分离。融合配偶还包括“表位标签”，它们常常是短肽序列，有它们各自的特异性抗体。有 相应的特异性单克隆抗体的表位标签的熟知例子包括c-myc，流感病毒血凝素和FLAG标签。本发明的分离的海豚链球菌M蛋白，包括其片段、变体和衍生物，可制成重组形式 或化学合成形式。通常，重组蛋白可由本领域技术人员用本领域公知的标准方法方便地制备。不超过60-80个连续氨基酸的肽和其它蛋白片段最好用化学合成法制备。这类方 法是本领域众所周知的。海豚链球菌的M蛋白可被诱导表达，并且，在标准实验室培养基的正常培养条件 下表达时至少部分地难以控制(reftactory)。因此，M蛋白的表达可通过在细菌培养期间 包含诱导剂来促进。非限制性实例有，金属，螯合剂，血清蛋白和/或其它诱导海豚链球菌 M蛋白的细菌表达或使其最大化的添加剂。本发明一个方面还包括结合、识别和/或抗本发明的分离的蛋白，其片段、变体或 衍生物的抗体。抗体也包括抗体片段，如Fc片段，Fab和Fab，2片段，双抗体(diabodies)， Fv和scFv片段。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以在合适的生成动物如小 鼠、大鼠、兔、绵羊、小鸡或山羊中产生。备选地，抗体可以从已天然暴露于海豚链球菌或其M蛋白的鱼或其它动物分离。单克隆抗体可以用诸如CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (Eds. Coligan et al.John Wiley&Sons. 1995-2000)禾口 Harlow, Ε·&Lane, D. Antibodies :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour, Cold Spring HarbourLaboratory, 1988)等描述的标准方 法制备。这类方法通常涉及，从如上述免疫的动物获得抗体生成细胞，如脾细胞，使所述细 胞永生化，如通过与永生化的融合配偶细胞融合来实现。单克隆抗体或其抗原结合片段也可以重组产生。这样的重组方法是本领域已知 的，有多种商业来源可以制备重组抗体。如本领域已知，抗体可与选自下组的标记物偶联，所述组包括酶、荧光团、化学发 光分子、生物素、放射性同位素或其它标记。可用于本发明的合适的酶标记的例子包括，碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，萤光素 酶，半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，溶菌酶，苹果酸脱氢酶，等等。酶标记可单独使用，或者 与第二种酶一起在溶液中使用，或者与合适的色原性底物或化学发光底物一起使用。色原的例子包括，二氨基联苯胺(DAB)，永固红(permanent red)，3-乙基苯并噻 唑啉磺酸(ABTS)，5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)，氮蓝四唑(NBT)，3，3' ,5,5'-四 甲基联苯胺(TNB)和4-氯-1-萘酚(4-CN)，但不限于此。化学发光底物的非限制性例子是鲁米诺(Luminol) ，在有辣根过氧化物酶和过氧化氢存在的条件下氧化形成激发态产物(3_氨基邻苯二甲酸酯)。荧光团可以是异硫氰酸荧光素(FITC)，异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)，别 藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)，德克萨斯红(Texas Red, TR)，Cy5或R-藻红蛋白 (R-Phycoerythrin, RPE)，但不限于此。放射性同位素标记可包括125I，131I，51Cr和"Tc，但不限于此。其它可用的抗体标记包括胶体金颗粒和洋地黄毒苷(digoxigenin)。本发明还提供分离的核酸，其编码本文所述分离的M蛋白，包括所述分离的M蛋白 的片段、变体和衍生物。在具体方面，所述本发明提供分离的核酸，其含有SEQ ID NOS :8_11和39任一所 示的核苷酸序列。尤其对于SEQ ID NO :11而言，所示核苷酸序列包含由残基1-609和残基 677-1606定义的分隔开的开放读框。 术语“核酸”在本文中表示单链或双链mRNA，RNA, cRNA, RNAi，siRNA和DNA，包括 cDNA,线粒体DNA (mtDNA)和基因组DNA。“多核苷酸”是具有80个以上连续核苷酸的核酸，“寡核苷酸”则具有不到80个连
续核苷酸。寡核苷酸的非限制性实例见表1和3 (SEQ ID NOS 18-38)。本发明还提供核酸变体，包括同源的、直系同源的、以及突变的核苷酸序列。一方面，本发明提供变体核酸，其具有与本发明分离的核酸至少70 %，75 %，80 %， 85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，96%，98%或 99%的核苷酸序列同一性。本发明的变体核酸可与本发明的分离的核酸在高度严格条件下杂交。严格杂交条件是本领域众所周知的，如参见Ausubel et al. CURRENTPR0T0C0LS IN MOLECULAR BIOLOGY (John ffiley&Sons NY, 1995-2006)的章节 2. 9 和 2. 10，尤其第 2. 9. 1 至 2. 9. 20 页。通常，严格程度根据杂交和/或洗涤期间一或多个因子的浓度而有不同。所述因 子可包括，离子强度，表面活性剂类型和/或浓度，温度，变性剂类型和/或浓度，本领域对 此众所周知。适于获得本发明分离的核酸的高度严格杂交条件包括但不限于_(i)至少约31% ν/ν至至少约50% ν/ν甲酰胺和至少约0. OlM至至少约0. 15Μ 盐，在42°C杂交，以及至少约0. OlM至至少约0. 15M盐在42V洗浲；(ii) 1% BSA, ImM EDTA，0.5M NaHPO4 (pH 7. 2)，7% SDS，在 65°C 杂交，和(a) 0. Ix SSC，0. SDS ；或(b)0. 5% BSA，ImM EDTA,40mM NaHPO4 (pH 7. 2)，1 % SDS，在超过 65°C洗 涤约1小时；和(iii)0. 2x SSC，0. SDS 在 68°C或以上洗涤约 20 分钟。一般地，洗涤在Tm = 69. 3+0. 41 (G+C) % _12°C进行。一般地，错配碱基的数量每 增加1 %，双链DNA的Tm降低约1V。因此可以理解，变体、同系物和直系同源物的具体例子包括但不限于与SEQ ID NOS 8-11和39中任一个互补或至少部分互补的核酸；含有因考虑密码子序列丰度而有差 异的核苷酸序列的核酸，包括SEQ ID NOS :8-11和39任一的密码子优化变体；以及SEQ ID NOS 8-11和39任一的天然变体或等位基因变体。
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本发明还涉及本发明分离的核酸的片段。“核酸片段”是指本发明分离的核酸的单链或双链核酸部分或亚序列。所述片段 可包含由本发明分离的核酸的至少1%，2%，5%，7%，10%，20%，30%，40%，50%，60%， 70 %，80 %，90 %，95 %或99 %连续核苷酸序列组成的连续核苷酸序列。所述片段可包含 由本发明分离的核酸的至少 6，10，15,20,30,50,80,100，200，300，400，500，600，700，800， 900，1000，1100，1200，1300，1400或1500个连续核苷酸组成的连续核苷酸序列。核酸片段的非限制性例子是SEQ ID NO :11的残基1-609和残基677-1606定义的 开放读框。在一些方面，核酸片段可以是弓I物或探针。“引物”常常为单链寡核苷酸，优选有9-60个连续核苷酸，能与互补的核酸“靶”退 火，而且能在DNA聚合酶如Taq聚合酶，RNA-依赖性DNA聚合酶或SEQuenase 的作用下以 模板依赖方式延伸。在具体实施方案中，引物可包含至少10，12，15，18，20，25，30，35，40，45或50个连
续核苷酸。“探针”可以是单链或双链寡核苷酸或多核苷酸，能与靶核酸上述至少部分互补于 该探针的核苷酸序列退火。探针和引物可被标记以便于检测。标记物包括放射性同位素，荧光团包括荧光供 体和受体分子，以及用于比色检测或化学发光检测的酶，如本领域熟知的那样。“靶”核酸可以是任何能被检测、被结合、或能与本发明的引物或探针退火的核酸。本发明还提供“遗传构建体”，其包含本发明的一或多种分离的核酸，片段或变体。本文中，“遗传构建体"是人工制得的核酸，其插入并且/或者有利于应用编码 本发明分离的M蛋白、其片段、变体或衍生物的分离的核酸。在具体实施方案中，所述构建体可用于重组操作，繁殖，扩增，同源重组和/或表 达所述分离的核酸。本文中，用于蛋白表达的遗传构建体称为"表达构建体"，其中，待表达的分离的 核酸在表达载体中与一或多个调控序列可操作地相连。“表达载体”可以是自我复制的染色体外载体如质粒，或者是整合到宿主基因组中 的载体。在本发明一个方面，表达载体是质粒载体。“可操作地相连”是指，所述调控核苷酸序列相对于所述核酸所处的位置能启动、 调节或控制该核酸的表达。调控核苷酸序列一般适于表达所用到的宿主细胞。针对多种宿主细胞合适的表达 载体和合适的调控序列本领域已知有多种类型。一或多种调控核苷酸序列可包括但不限于，启动子序列，前导序列或信号序列，核 糖体结合位点，转录起始和终止序列，翻译起始和终止序列，剪接供体/受体序列，以及增 强子或激活剂序列。本领域已知的组成型或诱导型启动子都可以用，包括例如四环素阻遏型、IPTG-诱 导型、醇(alcohol)-诱导型、酸-诱导型和/或金属_诱导型启动子。一方面，表达载体包含选择标记基因。选择标记可用于选择转化的细菌(如bla，kanR和tetR)或用于选择转化的哺乳动物细胞(如潮霉素，G418和嘌呤霉素)。适于表达的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，如海豚链球菌，大肠杆菌(例 如DH5)，酵母细胞，在杆状病毒表达系统中使用的SF9细胞，或多种哺乳动物或其它动物宿 主细胞中的任一种，但不限于此。将表达构建体引入合适的宿主细胞的技术包括但不限于，电穿孔，热休克，磷酸钙 沉淀，DEAE葡聚糖-介导的转染，基于脂质体的转染(如lipofectin，lipofectamine)，原 生质体融合，显微注射或显微粒子轰击，象本领域已知的那样。在具体方面，本发明提供治疗动物的海豚链球菌感染的组合物和/或方法。在一个具体方面，本发明提供治疗感染了海豚链球菌的动物的方法，所述方法包 括对所述动物施用本发明的组合物以预防性或治疗性处理所述海豚链球菌感染。在另一具体方面，本发明提供免疫动物使其抵抗海豚链球菌的方法，所述方法包 括对所述动物施用本发明的组合物以提供抗海豚链球菌的免疫。本发明海豚链球菌M蛋白或M样蛋白的一个特别的特性是，测试了 50个分离物， 所观察到的序列变异相对有限。因此，海豚链球菌M蛋白或M样蛋白可用于激发抗多种海 豚链球菌菌株的交叉保护性免疫应答。本发明的组合物和方法可用在各种易感于海豚链球菌感染的动物，包括海豚和鱼 中，但不限于此。组合物可包括分离的海豚链球菌M蛋白或其片段；结合海豚链球菌M蛋白或其片 段的抗体；编码海豚链球菌M蛋白或其片段的分离的核酸；和/或诱导表达海豚链球菌M蛋 白的减毒或灭活的海豚链球菌细菌。本发明的组合物可以用于兽医用途或医疗用途，并包括合适的载体，稀释剂或赋 形剂。在本发明一个方面，提供了“免疫治疗性组合物”，其给予动物后，提供、帮组或激 发动物抗海豚链球菌的免疫应答。所述组合物可以是疫苗的形式。任何合适的方法都可以用于制备免疫治疗性组合物和疫苗。一方面，本发明给动物提供抗海豚链球菌感染的被动或主动免疫。被动免疫通过给予有效量的本文所述抗体或抗体片段来提供。主动免疫通过给予有效量的M蛋白或其免疫原性片段来实现。分离的M蛋白及其 免疫原性片段可以为重组蛋白或化学合成肽的形式。减毒的细菌性疫苗可以给予动物，包括鱼和人类。例如，减毒的细菌可表达一或多种重组海豚链球菌M蛋白或其片段，或为减毒的、 诱导表达一或多种内源性海豚链球菌M蛋白的海豚链球菌细菌。细菌的减毒或灭活，例如通过热、化学处理等方法，是本领域已知的。本发明还提供核酸疫苗，其编码一或多种分离的海豚链球菌M蛋白或其片段。本文中，术语"核酸疫苗”包括"质粒疫苗"和“病毒疫苗”。—方面，核酸是质粒DNA疫苗。一般而言，“载体，稀释剂或赋形剂”是指，能安全地用于给予动物如鱼或人类的固 体或液体的填充剂、稀释剂或胶囊化物质。根据具体的施用途径，可以采用本领域已知的多 种载体。这些载体可选自下组，包括糖(sugar)，淀粉(starch)，纤维素及其衍生物，麦芽，
14明胶，滑石粉，硫酸钙，植物油，合成的油，多元醇，藻酸，磷酸盐缓冲液，等渗盐水，无热原的 水，三卡因(tricaine)，增湿或乳化剂，膨胀剂(bulking agent)，包衣，粘合剂(binder)， 填充剂，崩解剂(disintegrant)，稀释剂，润滑剂，pH缓冲剂。在核酸疫苗的情况下，DNA表达载体可以裸露着运送，或者可以以阳离子脂 质-DNA复合体、脂质体、磷酸钙共沉淀物、吸附在微粒子上的形式提供，但不限于此。因施用本发明的核酸疫苗而激发的免疫应答可以用其它核苷酸序列增强。所述其它核苷酸序列的非限制性例子包括，具有非甲基化CpG 二核苷酸的免疫刺 激性寡核苷酸，或编码其它抗原性蛋白或佐剂性细胞因子的核苷酸序列。所述DNA可以为 裸露形式，或可以与细胞摄取促进剂(如脂质体或阳离子脂质)一起施用。免疫治疗性组合物和疫苗可包括佐剂。合适的佐剂包括但不限于，表面活性物质如十六烷胺，十八烷胺，，十八烷基氨基 酸酯，溶血卵磷脂，双二十八烷基二甲基溴化铵，N，N-双十八烷基-N' , N'双(2-羟乙 基_丙二胺)，甲氧基十六烷基甘油，和pluronic polyols ；聚胺如吡喃，硫酸葡聚糖，多聚 IC carbopol ；肽如胞壁酰二肽及其衍生物，二甲基甘氨酸，tuftsin ；油乳液；和矿物胶如 磷酸铝，氢氧化铝或明矾；淋巴因子，QuilA和免疫刺激复合物(ISCOMS)。组合物或疫苗的有效剂量可根据受试者的个体大小、物种归属，以及根据给药模 式而有不同。最佳剂量可以由医生、兽医、或水产专家(aquaculture specialist)经过试 验和错误来确定。对于鱼类而言，疫苗可在单个剂量中包含0. 01-0. 5mg，优选0. 025-0. 25mg或更优 选约0. 05-0. 2mg蛋白。核酸疫苗的合适剂量可以低至皮克(pictogram)或高至mg级别，但通常为 约0.01-10(^8，优选0.148-5(^8/单位剂量，更优选约lyg_25yg，最优选5yg to 10 μ g/单位剂量。由于鱼可能因接种疫苗而遭受压力(stress)，优选疫苗为只单次注射的疫苗，是 单个剂量形式。对于注射性疫苗而言，单个剂量单位以0. 025-0. 5ml，优选0. 04-0. 2ml，约 0. 05-0. Iml体积为宜。在与鱼有关的多个方面，组合物和疫苗可制成液态溶液，减毒的细菌，注射用的乳 液或悬浮液，或浸没在水中运送。也可以制成适于分散在或悬浮于液态载剂中、或与固态食 物混合后再施用的固态形式(如粉末)。所述组合物或疫苗可冻干(lyophilized)，任选地 冷冻干燥(freeze-dried)，成为用无菌稀释剂很容易重建的应用形式。例如，冻干的疫苗可 以在0.9%盐水(任选地作为包装好的疫苗产品的一个部分来提供)中重建。核酸因其分子的稳定性和长货架期而特别适于冻干。备选地，组合物或疫苗可以 作为盐水溶液来提供。疫苗的液态或重建形式可进一步稀释在少量水(如1-10个体积) 中，然后添加到围栏(pen)，水池(tank)或水浴(bath)中，通过浸没给予鱼。本发明的疫苗 组合物可以以立即释放或延迟释放的形式给予。为了在鱼中进行基于核酸的治疗或接种，可选用待接种的鱼的内源转录调控序 列。例如，可考虑内源细胞因子或肌动蛋白基因启动子，或者其它调控序列可从鱼DNA病毒 衍生得到。应用于鱼的DNA接种的非限制性实例参见美国专利5，780，448，美国专利公开号20050163795，美国专利公开号20060073167和美国专利公开号20050261227。在与治疗和/或免疫鱼有关的实施方案中，组合物还可口服给予，或者将鱼浸没 在含有免疫原性M蛋白或其免疫原性片段的稀释组合物中来给予。鱼用口服组合物包括鱼饲料和/或添加剂，可以为颗粒(pellet)，碎屑 (granule)，液体，薄片(flake)或粉末形式，含有分离的海豚链球菌M蛋白或其免疫原性片 段。与鱼有关的组合物、疫苗、治疗和/或免疫方法特别有用于养鱼场 (fishfarming)、孵鱼场(fish hatcheries)和其它商业化渔业应用。但也可理解，本发明 可在海豚链球菌感染对天然或其它野生鱼群有副作用的地区用于保护野生鱼群。在一些方面，本发明提供用于治疗除鱼以外的其它动物的海豚链球菌感染的组合 物和/或方法。在一个具体方面，本发明提供治疗人的海豚链球菌感染的组合物和/或方法。人用剂量可以根据该人的年龄、体重、性别和总体健康状况凭经验算出。仅为举例目的，蛋白剂量为0. l_lmg/70kg体重，或优选约0. 3-0. 5mg/70kg体重可 以是有效的。任何合适的给药途径都可根据本发明用于人类患者。例如，口服、直肠、胃肠外、舌 下、经颊(buccal)、静脉、关节、肌肉、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔(intraperitoneal)、脑 室内(intracerebroventricular)、经皮等等途径都可以采用。剂型可以包括，片剂、分散剂、悬浮剂、注射剂、溶液、糖浆、锭剂(troches)、胶囊、 栓剂、气溶胶、透皮贴剂等等。这些剂型还可包括注射或植入特别为此目的设计的控制释放 装置或其它经改良后在这种形式中起额外作用的植入形式。控制释放可以通过，例如，用疏 水聚合物包裹药物来实现，所述聚合物包括，丙烯酸树脂，蜡，高级脂肪醇，聚乳酸和聚乙醇 酸和一些纤维素衍生物如羟丙基甲基纤维素。此外，控制释放可通过采用其它聚合物基质、 脂质体和/或微球体来实现。本发明适于口服或胃肠外给药的组合物可以呈现为离散的单位如胶囊、小袋 (sachet)或片剂，它们每一个都含有预定量的一或多种本发明治疗剂，为粉末或碎屑，或为 水性液体、非水性液体、水包油乳液或油包水乳液中的溶液或悬浮液。适于对人给药的组合物和疫苗可按照例如New Generation Vaccines (1997， Levine et al. , Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong)所述制备，该文献仅为 举例。本发明的疫苗和组合物可以以减毒细菌疫苗的形式对人施用，其中所述细菌表 达一或多种重组海豚链球菌M蛋白或其片段。减毒细菌的非限制性实例包括，沙门氏 菌(Salmonella species),例如肠沙门氏菌鼠伤寒变种(Salmonella enterica var. Typhimurium)或伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)。备选地，其它肠道致病菌如志贺氏菌 (Shigella species)或大肠杆菌(E. coli)都可以以减毒形式使用。减毒的沙门氏菌菌株 通过灭活芳香族氨基酸生物合成途径中的基因来构建(Alderton et al. ,Avian Diseases 35 435)，通过将突变引入芳香族氨基酸生物合成途径的两个基因中(见例如美国专利 5，770,214)或引入其它基因如htrA中(见例如美国专利5，980，907)或引入编码外膜蛋白 的基因如ompR中(见例如美国专利5，851，519)来构建。
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备选地，减毒细菌疫苗可包括经诱导表达一或多种内源海豚链球菌M蛋白或其片 段的海豚链球菌细菌。人用组合物和疫苗还可包含载体。载体的非限制性实例包括，甲状腺球蛋白；清蛋白如人血清清蛋白，毒素，类毒素 或来自破伤风、白喉、百日咳、假单胞菌、大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌的毒素的任何突变的 交叉反应性物质(CRM)，聚氨基酸如聚(赖氨酸谷氨酸)，流感病毒；轮状病毒VP6，细小 病毒(Parvovirus) VPl和VP2，乙肝病毒核心蛋白，乙肝病毒重组疫苗等等。备选地，可以使 用载体蛋白或其它免疫原性蛋白的片段或表位。例如，可以使用细菌来源的毒素，类毒素或 CRM的T细胞表位。在人类中，本发明的组合物和/或疫苗可以以多价形式与生物的抗原组合施用， 所述生物包括病原性细菌流感嗜血杆菌(H. influenzae)和其它嗜血杆菌(Haemophilus species),粘膜炎微球菌(Μ. catarrhal is),淋病奈瑟氏菌(N. gonorrhoeae),大肠杆菌,月市 炎链球菌(S. pneumoniae)，等等。在其它具体方面，本发明提供检测动物中海豚链球菌感染的诊断方法。一方面，本发明提供确定动物是否正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其成分的 方法，所述方法包括，确定从所述动物获得的生物学样品是否包含分离的蛋白或其片段、变 体或衍生物的步骤，所述分离的海豚链球菌M蛋白或其片段、变体或衍生物的存在，表示所 述动物正在或已经暴露于海豚链球菌或其分子成分。另一方面，本发明提供确定动物是否正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其成分 的方法，所述方法包括，确定从所述动物获得的生物学样品是否包含本发明分离的核酸的 步骤，所述分离的核酸的存在表示所述动物正在或已经暴露于海豚链球菌或其分子成分。另一方面，本发明提供确定动物是否正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其成分 的方法，所述方法包括确定从所述动物获得的生物学样品是否包含与分离的海豚链球菌M 蛋白或片段结合的抗体或抗体片段的步骤，所述抗体或抗体片段的存在表示所述动物正在 或已经暴露于海豚链球菌或其分子成分。本发明还提供诊断试剂盒和/或诊断组合物用于检测海豚链球菌细菌，其分子成 分，或与本发明的M蛋白或其片段结合的抗体。诊断试剂盒和/或组合物可适合基于核酸或基于蛋白的检测，并包含一或多种检 测试剂，如一或多种抗体、M蛋白或其片段、核酸探针和/或引物，以便于检测生物样品中的 抗海豚链球菌M蛋白的抗体，海豚链球菌M蛋白，其编码核酸和/或片段。核酸检测可以采用本领域已知技术，包括但不限于，Northern杂交，Southern杂 交，核苷酸序列扩增，核酸阵列杂交，引物延伸产物的质谱分析，DNA测序等。检测方法还可包括对编码海豚链球菌M蛋白的核酸或其片段进行核苷酸序列扩 增的步骤。本文中，“核酸序列扩增技术"包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)链置换扩增 (SDA)；滚环复制(RCR)；基于核酸序列的扩增(NASBA)，参见例如连接酶链式反应(LCR)； Q-β复制酶扩增和依赖于解旋酶的扩增。在一个实施方案中，所述核苷酸序列扩增技术是PCR。相应地，在一个具体实施方式
中，本发明提供核酸序列扩增方法，包括用热稳定的DNA聚合酶以及一或多种引物，对存在于得自动物的核酸样品中的编码海豚链球菌M蛋白 的核酸或其片段进行扩增。可用于诊断的PCR引物的非限制性实例见表1。但很容易理解，本领域技术人员可 以基于SEQ ID NOS :8-11任一所示的一或多个核苷酸序列设计并制得其它PCR引物。PCR扩增产物可以方便地用与SEQ ID NOS :8_11任一互补的带标记的DNA探针来 检测。相应地，本发明涉及诊断试剂盒，其包含(a) 一或多个单链DNA引物，其能与编码海豚链球菌M蛋白的核酸或其片段退火； 以及(b) DNA探针，其能与从编码海豚链球菌M蛋白的核酸或其片段经PCR扩增得到的 一或多种PCR扩增产物杂交。所述试剂盒还包含热稳定的DNA聚合酶。本发明还涉及对分离的海豚链球菌M蛋白进行基于蛋白的检测。基于蛋白的检测可以用本文所述抗体或抗体片段进行。可以采用合适的方法，免疫印迹，ELISA，蛋白阵列，蛋白图谱(proteinprofling)， 2D电泳，质谱，蛋白测序，放射免疫分析和放射性配体结合，但不限于此。相应地，本发明涉及诊断试剂盒，其包含(a)抗体或抗体片段，其能与分离的海豚链球菌M蛋白或其片段结合；以及(b) 一或多种检测试剂，其促进所述与分离的海豚链球菌M蛋白或其片段结合的 抗体或抗体片段的检测。检测试剂可包括带有标记的第二抗体和合适的底物，以便于比色检测、荧光检测 或化学发光检测。备选地，所述能与分离的海豚链球菌M蛋白或其片段结合的抗体或抗体片段可以 直接标记。抗体标记的非限制性实例已在前文描述。本发明还涉及检测动物对海豚链球菌感染产生反应而生成的抗体，以所述抗体作 为指示剂，指示动物是否正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其分子成分。这类抗体的存在可以用上述任一种蛋白检测方法来检测，例如用ELISA和免疫印 迹方法检测。为了诊断的目的，来自鱼或其它动物的生物样品宜为血液或活检样品如来自肾 脏、脾、心脏、脑、肌肉或其它组织。为了本发明更容易理解和付诸实施，请本领域技术人员参考以下非限制性实施 例。
实施例分离和鉴定海豚链球菌M蛋白实验方案海豚链球菌菌株和培养条件本研究使用得自受感染的鱼的海豚链球菌的兽医学实验室分离物(Lates
18calcarifer)。_80°C贮存的菌株-20%甘油液在含5%脱纤维蛋白的绵羊血的Columbia琼 脂基上37 °C过夜培养。重组DNA技术海豚链球菌基因组DNA用酶裂解法(Pruksakorn et al.，2000, J. Clin. Microbiol. 38 125)从新鲜培养的细胞提取。海豚链球菌emm-样(sim)基因的PCR扩增和克隆每个50 μ L PCR 试管含 5 μ L IOx Tth plus 缓冲液，1 μ L dNTP' s (dATP, dCTP, dGTP 禾口 dTTP 各 4x2. 5mM ;Biotech International Ltd. ,Australia), 200ng ALL MF禾口 ALL MR 引物(表 1)，0. 5U Tth plus DNA 聚合酶(Biotechlnternational Ltd. , Australia), 3μ L 25mM itUi美，M Milli-Q。 $ Eppendorf Mastercycler Gradient EPS (Eppendorf，Hamburg, Germany)中的热循环参数为，94 °C变性2分钟，接着按照 500C lmin、72°C 2min、和 94°C 15s 进行 35 个循环，最后按照 50°C Imin 和 72°C IOmin 进行 延伸循环。所得PCR产物在含0.5yL 10mg/mL溴化乙锭溶液的w/v琼脂糖凝胶上以 Ix TAE作为电泳缓冲液进行电泳后，目测观察。所需电泳带从 疑胶上切下，用 MegaSpin Agarose Gel Extraction Kit(Intron biotechnology, Korea)从凝胶中提取出来。纯化的PCR产物用购买的试剂盒(Invitrogen， Melbourne,Australia)通过TA克隆法连接至PCR4-T0P0。克隆实验中用的感受态细胞(TOP 10 ；Invitrogen, Melbourne, Australia)在补力口了 100 μ g/mL氛节青霄素的 Luria-Bertani 琼月旨(LB Agar ；Sigma, Castle Hill, Australia)上培养。将 X_gal (40 μ l，20mg/ml)涂布 在LB琼脂板上进行兰-白区分。将克隆都在37°C培养过夜。用抛弃型无菌环挑取克隆，将 其铺在LB琼脂上。这些经证实的白色克隆还用于通过直接裂解PCR进行筛选并用于贮存。对克隆进行直接裂解PCR和测序反应体积减至25 μ L，反应条件同上。质粒特异性引物SP6和Τ7(表1)的应用使 得能扩增sim基因插入序列。琼脂糖凝胶电泳能测出带有插入序列的克隆，再用购买的试 剂盒按说明书(Invitrogen，Melbourne, Australia)从这些克隆提取质粒，以便用质粒引 物SP6和T7(表1)测序。全长sim基因的测序最开始用引物SIM F(表1)促进。基因组步移(Genome Walking)和sim基因多样化sim基因上游和下游的序列按照厂家建议(Genome Walker Kit, Clontech, Mountain View，Ca.)通过基因组步移获得。sim基因上游的基因组步移所用的基因特异性 引物是SIM WR和SIM W2R(表1)和SIM WF和SIM W3F (表1)。所得PCR产物经凝胶纯化， 连接至 Τ0Ρ0 载体 PCRII (Invitrogen,Melbourne, Australia)。测序用 SP6 和 T7 引物在重 组克隆上进行。这允许将引物(PRE SIM和POST SIM;表1)设计为从其它菌株扩增sim基 因和周围间隔区(反应成分浓度同上，但退火温度为65°C，且使用校对引物STAR DNA聚合 酶(Takara，Shiga，Japan)以减少插入错误的概率)，从而检查sim基因的多样性。PRE SIM 引物位于多基因调节基因(multigene regulator gene，mgrX)中、并在扩增子中包括mgrX 基因的头36个核苷酸，POST SIM则扩增推定的亚碲酸盐(tellurite)/毒性阴离子耐受基 因(telX)的最后75个核苷酸。这些PCR产物直接用以下引物测序PRE SIM, SIM R，SIM 2R, SIM F, SIM 2F, SIM 3F, SIM W2R，和 POST SIM(表 1)。此外，用引物 M141F 和 SIM3F RC 从分离物QMA0141生成序列信息。
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表达M样蛋白M# 胃白 M Champion pET % 统(pET101/D-T0P0 ； Invitrogen, Melbourne, Australia), 在大肠 If 菌 BL21Star(DE3)One Shot chemically competent cells (Invitrogen,Melbourne, Australia)中按厂家建议进行表达。有记录的不同sim序 列变种(sequevars)的代表按厂家建议进行表达。不同sim基因的代表性分离物QMA0072， QMA0076，和QMA0141表达为蛋白。血纤蛋白原结合实验Λ .S S HC (Sigma, Castle Hill, Australia) M EZ-Link Sulfo-NHSBiotinylation Kit (Pierce, Rockford, II.)标记。未掺入的生物素用 Micro-SpinG-25 柱(GE Healthcare Biosciences, North Ryde, Australia)除去。将 IPTG-诱导的细胞裂解物的SDS-PAGE分离结果印迹到PVDF膜上，用链亲和素-碱性磷酸酶 (Pierce, Rockford, II.)检测，用 I-St印 NBT-BCIP(Pierce, Rockford II.)显色。分离前肾(head kidney)和腹膜细胞从受酪蛋白刺激的腹腔收获巨噬细胞，如前文所述进行纯化并维持(DoVale et al.，2002)。简言之，为刺激腹膜，将尖吻鲈(Lates calcarifer) (300g)用 Aqui-S (Aquatic Diagnostic Services, ffilston, Australia)按厂家建议麻醉，在其腹腔中注射 Iml 12% 酪蛋白(无菌，在磷酸盐缓冲液(PBS)中)，24小时后收集巨噬细胞。在分离腹腔巨噬细胞 之前，鱼用过量Aqui-S实施安乐死，再切断腹部大动脉进行放血。将含2%胎牛血清(FBS， Invitrogen, Melbourne, Australia)、1%青霉素 / 链霉素(P/S) (Invitrogen, Melbourne, Australia)、和 10 μ g. πιΓ1 肝素(Sigma，Castle Hill, Australia)的一份(5ml)L_15 培养 基用配有25G针头的注射器准确注射到腹腔中。之后按摩体腔30秒，使培养基散开，用19G 注射器非常小心地抽取含有白细胞的灌洗液，防止出血。再将腹膜细胞悬浮液层叠在不连 续的(34%/51%)Percoll密度梯度上，4°C 450g离心25min。收集界面处的带，用含 FBS和青霉素/链霉素(P/S)的L-15培养基洗两次。活细胞浓度用台盼蓝排除法确 定。将细胞以IO7细胞πιΓ1在含FBS和P/S的L-15培养基中的浓度接种到微滴板 上。使细胞群体在28°C贴壁2小时，再用L-15培养基洗去未贴壁的细胞。贴壁细胞在含
FBS和P/S的L-15中28°C维持。本实验使用24小时的培养物。诱导经鲁米诺放大的化学发光本实验使用海豚链球菌菌株QMA0072、QMA0076、和QMA0141。每种菌株在0D_ 1. 5 时与 PBS,5 μ g mUSA-PBS、或 5 μ g πιΓ1 血纤蛋白原-PBS 37°C 预保温 30 分钟(Welch, 1980)。这些细胞然后用HBSS洗两次，重悬于HBSS中。胞吞后前肾细胞的呼吸爆发活性用前文所述方法作一些改良后测定 (Nikoskelainen et al.，2005)。简言之，1日龄前肾细胞用未经处理或经过处理的海豚链 球菌以感染复数(MOI) 100 (细菌/巨噬细胞比1 100)进行刺激。呼吸爆发活性通过将 30 μ 1所需细菌悬液添加到微滴板上的巨噬细胞中(IxlO5细胞/孔)来启动。还向每孔中 添加10 μ 1 IOmM鲁米诺的0. 2Μ硼酸缓冲液ρΗ 9. O和280 μ 1 HBSS ρΗ 7. 4，使终体积为 300 μ 1。吞噬细胞发出的化学发光(CL)在冷光仪(Iuminometer)/荧光计(fluorometer) (BMG Fluostar Optima, BMG Labtech, Offenberg, Germany)中测量，在 27°C，每 3 分钟测 一次，共测3小时。
结果图1显示编码海豚链球菌菌株QMA72的M蛋白的核苷酸序列(SEQ IDNO 8)。图2显示编码海豚链球菌菌株QMA76的M蛋白的核苷酸序列(SEQ IDNO 9)。图3显示编码海豚链球菌菌株QMA141的M蛋白的核苷酸序列(SEQID NO 10)。图4显示编码海豚链球菌菌株QMA136的M蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO=Il), N-端片段氨基酸序列(SEQ ID NO 6)和C-端片段氨基酸序列(SEQ ID NO :7)。QMA72的M蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO 3), QMA76的M蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO 4)和QMA141的M蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO 5)的比对见图5。与demA基因产物的比对见图6。图7显示海豚链球菌SimA基因序列(SEQ ID NO 39)，包括5’和3’非翻译核苷 酸序列和编码的M蛋白。用ALL M引物对(表1)使得能够全长测序simA(Sti^ptococcus iniaeemm-样)基 因。设计基因组步移引物以确定最5’和3’端核苷酸的真正基因序列，因为ALL M引物对在 最初推导的序列中引入了人工核苷酸(间隔区和5 ’端的编码氨基酸MA和3 ’的KRKEEN (SEQ ID NO :13))。在多数菌株中，全长simA基因为1566bp，编码一种有521个氨基酸的蛋白(图 4)，但分离物QMA0072的该蛋白有一个氨基酸插入，而分离物QMAOHlsim基因(由simB编 码)有579个氨基酸(表2)。分离物QMA0072、QMA0076、和QMA0141的所述蛋白(带信号 肽)的分子量分别为57589、57467、和63667Da。成熟蛋白的分子量分别为53416，53303、和 59446Da。编码KRKEEE (SEQ IDNO 14)的核苷酸序列3，的氨基酸序列发生改变。在SimA基因转录起始点上游11个碱基处发现可能的核糖体结合位点，序列为 AAGGAG(SEQ ID NO 15)(图7)。长度为45核苷酸的推定的Mgx结合位点被发现有识别位 点非常类似于GAS的emm和scpA基因的启动子区中发现的识别位点(图7)。海豚链球菌Sim基因的多样性测序QMA0076菌株的sim基因，发现它不同于来自酿脓链球菌(S. pyogenes)、 猪链球菌(S. suis)、马链球菌马亚种(S. equi subsp. Equi)、停乳链球菌和乳房链球菌 (S. uberis)的其它已知M和M样蛋白类型。将不同类型的海豚链球菌sim基因产物与它们 的最匹配的配对物停乳链球菌demA基因产物进行序列比对，见图6。用PRE SIM和POST SIM引物对产生预期的2048bp PCR产物。这是所测试的50 个分离物中绝大多数都有的最常见PCR产物。分离物QMA0072在simA基因中有插入，从 该分离物得到2051bp的PCR产物。QMA0141得到更大的2180bp产物。分离物QMA0076和 QMA0072的核苷酸序列和氨基酸序列除了插入三个核苷酸(1个氨基酸残基)以外都相同。 所有分离物中，位于simA基因任一侧的基因间间隔区的长度都相同。分离物QMA0141的基 因序列最具多样性，头35个残基有100%的氨基酸残基同一性，头41个残基有100%相似 性。这也证实了理论推测的切割信号序列产生成熟M蛋白的位置(图7)。该基因比simA 基因大10%，因此称simB。如此一来，所测试的所有分离物都表现出同样的基因排列。M蛋白序列分析分离物QMA0076的主要M蛋白类型的N-端在氨基酸41和42之间有一个可能的 信号序列切割位点，其产生480个氨基酸的成熟蛋白，分子量为 53kDa(图6)。分离物 QMA0141的信号肽切割位点也位于残基41和42之间，其产生538个残基的成熟蛋白，分子量 59kDa(图6)。所有M蛋白的C末端是保守的革兰氏阳性细胞壁锚着基序LPSTG(SEQ ID NO 16 ；Vasiet al.，2000，Infect. Immun. 68 294)。所述 M 蛋白类型的 N-端区域有非 常相似的信号肽，但成熟蛋白的第一个残基明显不同，而这些蛋白的C末端高度保守。这表 明，该蛋白暴露的N端承受了选择压力。用Garnier 算法(Garnier et al.，1978，J Mol Biol 120 97)分析分离物 QMA0076,预测该蛋白的77. 2%为alpha-螺旋。分离物QMA0072和QMA0141的M蛋白的预 测值分别为77. 和77.4%。用 COIL 程序(Lupas et al. , 1991, Science 252 1162 ；Lupas, 1996, MethodsEnzymol 266 513)以窗口长度28来分析，预测分离物QMA0076的蛋白(带信号序 列)在残基79-174和181-454处有两个卷曲螺旋节段，每个节段的概率为1. 00。这与Vasi et al.，同上的结果相似，后者鉴定出停乳链球菌的M样蛋白。将七残基重复序列(h印tad repeats)中的第一和第四个残基加权，得到残基91-449的概率为1. 00。同样，预测分离物 QMA0072在残基79-174和196-455有两个卷曲螺旋节段，每个节段的概率为1. 00。将七残基重复序列中的第一和第四个残基加权，预测残基91-186和213-450两个 节段的概率为1.00。分离物MA0141的M蛋白显示概率1. 00，在残基154-512有带加权七残基 (weighted heptad)的卷曲螺旋结构，当使用未加权的七残基时，在残基151-231和 238-512处有卷曲螺旋。表达的M蛋白和M蛋白片段的PAGE分析非还原的表达蛋白的SDS-PAGE分析(图8)显示，有不同于对照大肠杆菌裂解物 的电泳带。分离物QMA072和QMA076的主要蛋白带出现在 230kDa，但分离物QMA0141的 不是。用Western印迹法检测这些裂解物的血纤蛋白原结合蛋白。表达的M蛋白的血纤蛋白原结合将大肠杆菌裂解物中表达蛋白的Western印迹先结合生物素化血纤蛋白原，再用 链亲和素检测，结果发现，分离物QMA0072和QMA0076的M蛋白象预计的那样，在 230kDa 和 57kDa表现为单体和四聚物(仅QMA0072和QMA0076)。四聚物的形成已见于其它物种 的 M 蛋白(Meehanet al. , 1998,Microbiology 144 993)。分离物 QMA0141 在 64kDa 的 M 蛋白看来并不象分离物QMA0072和QMA0076的蛋白一样强有力地结合血纤蛋白原(图8)。分离物QMA0136表达的两种肽(202氨基酸SEQ ID NO :6和309氨基酸SEQ ID NO 7)不结合血纤蛋白原(数据未显示)。可能结合血纤蛋白原的区位于两种基因型(72 和136)与分离物QMA76相比具有它们各自的插入序列的区域(见图5)。这些插入出现在 该蛋白的氨基酸残基190-220之间。血纤蛋白原结合对活化尖吻鲈腹腔白细胞的影响为研究海豚链球菌M蛋白的血纤蛋白原结合的作用，调查了将海豚链球菌 QMA0072与血纤蛋白原一起预保温对腹腔白细胞(peritonealleucocytes)的胞吞作用和 呼吸爆发的影响。QMA0072的血纤蛋白原结合显著降低随后尖吻鲈腹腔白细胞经胞吞作 用诱导的呼吸爆发，与之相比的对照是用相同浓度的BSA预保温或在单独的PBS中预保温 (图 9)。讨论
这里述及海豚链球菌Sim基因和邻近的基因。根据大肠杆菌中重组表达的海豚链 球菌M蛋白的Western印迹分析结果，分离物QMA0076的M蛋白表现出结合最多的血纤蛋 白原，而分离物QMA0072(有一个氨基酸插入)结合略少的血纤蛋白原。分离物QMA0141的 M蛋白在转移到PVDF膜之后结合非常少的血纤蛋白原。分离物QMA0072表达的蛋白结合的 血纤蛋白原比分离物QMA0076略少可能是由于，在螺旋之间的区域插入一个残基(在第二 个螺旋区)破坏了这些螺旋的最佳结合。有趣的是，我们注意到，所有海豚链球菌M蛋白序 列(除QMA136C-端片段以外)，不管大小如何或多样性如何，都含有肽序列HEAIRSAGLE (SEQ ID NO :17)将两个螺旋连接。因此，血纤蛋白原结合能力的差异可能是由于该肽序列任一 侧的螺旋区中的序列差异。该肽的保守表明，其很有可能在对血液成分如免疫球蛋白的结 合中起关键作用(Geyer et al.，1999，FEMS Immunol Med Microbiol 26 11)。该肽序列 在血纤蛋白原和其它血液成分的结合中的作用需要进一步研究。形成四聚物的能力也可能是由于螺旋区彼此相互作用，因为表观分子量 230kDa 也已见于马链球菌马亚种的血纤蛋白原结合蛋白(Meehan et al.，1998，同上)。有趣的是， 我们注意到，分离物QMA0141的M蛋白(分子量大很多)并不象该主要类型一样有效地结 合血纤蛋白原或形成聚合物。鉴于其它M和M样蛋白能结合其它血液蛋白，这些蛋白结合 它们的能力也不能被低估。已显示，M蛋白家族成员负责链球菌的毒力，能结合除血纤蛋白原以外的血液成 分，且在耐受胞吞方面起作用(Podbielski et al.，1996，MolMicrobiol 19 429 ；Meehan et al.，1998，同上；Thern et al.，1998，J Immunol 160860 ；Meehan et al.，2000a，FEMS Microbiol Lett 190 317;· Meehan et al. ,2000b, Microbiology 146 1187 ；Meehan et al.,2001,Microbiology 147 3311 ；Courtney et al.,2006,Mol Microbiol 59 :936)。本 研究支持了这一发现，表明海豚链球菌对血纤蛋白原的结合在鱼巨噬细胞中减弱了胞吞作 用和随后的呼吸爆发活性。而且，较早期的一项研究表明，具有与本研究报道相似的表观分 子量的蛋白能反向结合(即通过Fc区结合)鳟鱼免疫球蛋白(Barnes etal.，2003，Fish Shellfish Immunol. 15 425)。M蛋白是GAS中的主要毒力因子和疫苗候选物(Hu et al.， 2002,Infect Immun 702 171 ；Batzloff et al.，2006，Immunol Res 35 233 ；Olive,2007, Curr Opin Mol Ther 9 25 ；Shaila et al.，2007，Vaccine 25 3567)，将来的工作是，基于 这些令人感兴趣的蛋白，调查抗海豚链球菌感染的疫苗在养殖的鱼中的潜力。用重组海豚链球菌M蛋白和DNA疫苗构建体接种实验方案实验动物和管理年幼(Juvenile)尖吻鲈平均重12g，得自 Ecofish Pty Ltd, Caloundra, Queensland.将鱼放养在5个300升食品级环状塑料槽(tank)中，每槽80条鱼，每槽中 有250L用海盐(Ocean Nature, Aquasonic, NSW)和RO过滤水制成的有盐味的(brackish) 水(5ppt)。将8个槽连起来，组成一个大的再循环系统，其有两个500L污水池(sumps)，带 生物过滤装置(biofiltration)和分隔开的蛋白脱脂装置(skimmer)。用压缩机给每个槽 通气，这些压缩机的电源与驱动再循环泵的电源是彼此独立的(图1)。水以1800L/小时 进行再循环，生物过滤器在放养鱼的4周前装好。在接种的14天前将鱼集中，每天在早6 点和晚6点用购买的颗粒饲料喂两次(尖吻鲈4mm漂浮物，Ridley AquaFeeds, Narangba,
23Qld)。根据需要换水(200L)，约每周两次。试验期间维持12小时白昼周期。每天记录水 温，通过水族室空调将水温维持在29°C 士 1°C。氨、亚硝酸盐和硝酸盐每天用购买的试剂盒 (Aquasonic, NSW)进行分析，记录pH，方法是，取5ml水样，记录实验室pH计上的读数。制备疫苗考查了两种疫苗一种重组疫苗，另一种是DNA疫苗。每种疫苗中用的基因都是海 豚链球菌simA，其编码SiM蛋白，是毒力因子，见Baiano etal.，2008。simA从海豚链球菌 菌株QMA0076经PCR扩增，该菌株带有从海豚链球菌全球普查中发现的显性sim基因类型， 且用于制备所述两种疫苗。重组蛋白疫苗制备重组SiM蛋白用于接种尖吻鲈，方法是，用引物ESIM 20F和ESIM1542R(表 3)产生 simA 基因，将其克隆后，用 Champion pET 系统(pET101/D-T0P0 ；Invitrogen, Melbourne, Australia)在大肠杆菌13121 Star(DE3)One Shot chemically competent cells (Invitrogen, Melbourne, Australia)中按厂家建议进行表达。简言之，含有按正确 方向插入的序列的克隆在IOmL LB肉汤+ΙΟΟμ g/mL氨苄青霉素中37°C过夜培养。取ImL 接种到IOOmL LB肉汤+100 μ g/mL氨苄青霉素中，在37°C以180rpm振荡培养4小时，再用 ImM IPTG(终浓度)在相同条件诱导3h。细胞在4°C收获，固定在0. 5% (ν/ν)终浓度福尔 马林(37% )冰浴中，4°C保温24h。将细胞沉淀，在PBS中洗两次，然后重悬在PBS中以备 IP注射。对照疫苗用相同方法制备，不同的是用未经转化的BL21细胞。DNA 疫苗将主要类型的sim基因用引物VF和VR插入DNA疫苗载体，所述引物含有用于直接 克隆到该DNA载体中的限制性位点。载体和PCR产物都用BamHI和SalI消化。构建体连接 后转化至T0P10细胞(Invitrogen，Melbourne, Australia)。带有按正确方向插入的序列 的克隆(经测序确定)在400mL LB肉汤+50 μ g/mL卡那霉素中37°C过夜培养，以150rpm 振荡。收获细胞，用QIAGEN HiSpeed Plasmid Maxi Kit提取质粒。福尔马林灭活的菌苗阳性对照疫苗用菌株QMA0155制备。该分离物从储藏罐取出，在血琼脂上25°C 过夜培养。挑一个单菌落在ImL植物蛋白胨肉汤(vegetabl印印tone broth, VPB, Oxoid, Thebarton, Vic)中乳化，取 500 μ L 接种 250mLErlenmeyer 烧瓶中的 50mL VPB。将培养物 在25°C振荡(130rpm)保温18小时。所得培养物马上在冰上冷却到4°C，接着用福尔马林 (37% )在0. 5mL/100mL的浓度灭活，使终浓度为0. 2%。培养物在4°C灭活后，取一份样品 在血琼脂上培养24h和48h后，检查灭活情况。鱼的接种鱼在接种前禁食24小时。将鱼(每次接种80条)在含0. 01 % MS222的干净养 鱼水中麻醉，经腹腔注射100 μ L疫苗制剂(重组疫苗和对照)或尾前肌肉注射5 μ g DNA 疫苗或载体对照在50 μ L无菌PBS中的溶液进行接种。允许鱼在回到它们的槽之前恢复。 疫苗组和对照组维持在不同的槽中，以便能产生免疫应答。接种的第二天开始恢复喂食，在 29°C维持4周再进行攻击。接种疫苗的24h和48h后，DNA接种组有2条鱼被实施安乐死， 从注射部位取约5立方毫米肌肉。RNA用购买的试剂盒(Qiagen)分离，DNA通过用DNase 消化而除去。RNA用superscript III逆转录酶进行逆转录，PCR用针对emm基因的引物进
24行以检查表达。用质粒引物检查该RNA被质粒DNA污染的情况，以确认emm基因被表达。制备攻击接种物海豚链球菌菌株QMA00155从再循环的尖吻鲈养殖场，New Southffales, Australia, 2006分离得到，选它进行本研究。该分离物从储存罐(-80°C，20%甘油-VPB) 取出，在含5%脱纤维蛋白的绵羊血的Columbia琼脂基上25°C过夜培养。按照前述进行 乳酸氧化酶基因的PCR来确认同一性。为制备攻击接种物，从经过确认的琼脂过夜培养物 选取单菌落，将其悬浮在Iml无菌胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptone soya broth, TSB, Oxoid, Thebarton，Vic)中。用200 μ 1等份试样接种50mL烧瓶中的20mL TSB，在25°C温和搅拌 (130rpm) ISh0这些指数期晚期培养物在无菌PBS中洗过后，重悬直至600nm的光密度为 1.2，之前估计该光密度等同于约5xl09cfu mL—1。然后将该悬液在PBS中稀释10倍，马上用 于攻击模型。注射攻击模型用手网(hand net)从槽中捞鱼，将它们在含0. 01% MS222的干净养鱼水中麻醉。 每条鱼用配有25G针头的ImL结核菌素注射器腹腔注射100 μ L(5x IO7CFU)。用饱和阿辛兰 (Alcian blue)的无菌PBS溶液经PanJet给鱼标上它们的疫苗或对照组(表4)。每个疫 苗组或对照组8条鱼被分配至160L塑料槽中，所述槽连接另一隔离水族室中独立的EHEIM 泵滤器，从而每个疫苗/对照组在每个槽中都有代表。死亡或垂死的鱼一经发现就除去，前 肾取样至TSA上。在TSA板上过夜培养，随后取样进行Iox基因的直接裂解PCR，以证实死 亡原因。分析结果死亡率数据用Kaplan-Meyer存活分析法进行分析，使用Prism第4版， Macintosh(GraphPad Ltd, California)。结果该试验进行到26天，也就是预计要攻击的18小时之前，由于主电源断电使再循环 泵停止工作，不再供气，导致很多鱼因窒息死亡。在电力恢复前一直给槽中供氧。组1(DNA 疫苗)有8条鱼幸存，组2 (B21重组对照)有18条，组3 (BL2IsimA重组疫苗)有19条，组 4 (NAV载体对照)有20条。组5即福尔马林灭活的同源菌苗试验组无一幸存。待幸存的鱼 从这种不利条件中恢复一段时间并重新开始喂食后，在减小的规模上进行攻击。疫苗效力每个幸存组选8条鱼接受攻击，作好标记，将它们放入单独的槽中。在有可能的情 况下，每组剩余的幸存者也接受攻击，标记，并分配到第二个槽中，作为平行试验。因此用了 两个槽，槽A有32条鱼(4个组每组8条)，槽B有23条鱼(组2和4各有8条，组3有7 条)。所有鱼从麻醉中恢复，并在攻击的12小时后表现为健康。第1波死亡出现在攻击后 的24h，多数病例沿腹部表面有明显的红色损伤。死亡持续直至攻击后的72小时。之后未 记录到进一步的死亡。死亡率为0-75%，见图10。最大死亡率在BL21重组对照组，最小死 亡率在BL2IsimA重组疫苗组(0% (0/7)和25% (2/8)，在2个平行试验中)。算出DNA疫 苗 pUK21A2-simA 的相对百分比存活(Relative percent survival, RPS)为 7. 76%，大肠 杆菌中表达的重组疫苗的RPS为83. 3% (图11)。讨论
尽管在攻击前夜失去了多条鱼，但有些鱼得救了，因此实验规模缩小但得到了数 据。DNA疫苗和重组蛋白疫苗经证实都有保护作用，但重组蛋白疫苗的作用更强。攻击模型 在对照组中导致75%的死亡率，可能反映了进入指数期的接种物在25°C的肉汤中制备而 不是在37°C的平板上生长。毒力决定簇，包括荚膜和M蛋白可能都是依赖于温度的且在不 同生长期有差异。由于疫苗和对照在同一个槽中一起接受攻击，对照组的再现性很高，重组 疫苗的表现很好，只有非常少的平行实验中途退出。重组蛋白疫苗的RPS显示为83.3%。 数条经DNA接种的鱼在接种的24h和48h后显示表达(图4)。本发明已在本文中作相应描述，但不应理解为限于本文描述的任一方面。可以对 本文描述和举例的各个方面进行各种改动而不背离本发明的精神和范畴。本文引用的所有专利文献和科技文献，计算机程序和算法，都以其全部内容引入 本文作为参考。表1.引物§ 引
序列(5，-3，)
标识符
ALL MFGGGGGGGGATCCATAAGGAGCATAAAAATGGCT
ALL MRGGGGGGGAATTCAGCTTAGTTTTCTTCTTTGCG
SP6GCTATTTAGGTGACACTATAGAAT
T7GTAATACGACTCACTATAGGG
SIM FAATTAATGAAGCTGGAGTGCTCT
SIM WFGGGAGGCTTCGCTGACATTTATTTCC
SIM W3FTACGGCCGTAAACGCAAAGAGGAAGAA
SIM RGCTTCCACAAGTTTTTCTTTGTCA
SIM 2RGTAGATAGGCTTTGATTTTCACTA
SIM 2FGATACGCTTCAAAGTTCTTACTAT
SIM 3 FGCTGCTAAGATCAACATGCC
SIM WRACCTATAATCAGGTTCTAAATTCGTGGC
SIM W2RGGAAGATGTGTCCATTGTTTGATGAGATG
PRE SIMTTGTTGGGTGGAAAAAAGATC
POST SIMAAACTCAGGGACCAAAAAATTG
SIM3F RCGGCATGTTGATCTTAGCAGC
M141 FC AAA ATGATC AC ATCAGC
ESIM 20FCACCATGGCTAAACAAATCAAAGC
ESIM 1542RTTCTTCCTCTTTGCGTTTACGG
SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19 SEQ ID N0:20 SEQIDNO:21 SEQ ID NO:22 SEQ ID NO:23 SEQ ID NO:24 SEQ BD NO:25 SEQ ID NO:26 SEQ ID NO:27 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:29 SEQ ID N0:30 SEQIDNO:31 SEQ ID NO:32 SEQEDNO:33 SEQ ID NO:34 SEQIDNO:35 SEQ ID NO:36 表4.疫苗组和攻击时的槽分配
组疫苗标记槽A槽B
1pUK21A2simA(5y g)喉8 0
2BL21 star前胸(Pre-pectoral)8 8
3BL21 star pET-simA后胸(Post-pectoral)8 7
4pUK21A2(5y g)肛门8 8
5QMAO165 灭活n/a0 0
权利要求
海豚链球菌的分离的M蛋白或M样蛋白。
2.权利要求1的分离的M蛋白或M样蛋白，包含选自下组的氨基酸序列 RLTLEEKMEALRKVVT(SEQ ID NO 1)和 KMAEIQEEANKKIAA(SEQID NO :2)。
3.权利要求1的分离的M蛋白或M样蛋白，包含氨基酸序列SEQIDNO :3或SEQ ID NO4。
4.对血纤蛋白原的结合比权利要求3的分离的蛋白减小或降低的分离的蛋白，其 含有海豚链球菌M蛋白或M样蛋白的氨基酸序列，但不含有选自下组的氨基酸序列 RLTLEEKMEALRKVVT (SEQ ID NO 1) ；KMAEIQEEANKKIAA (SEQ ID NO 2)；以及，SEQ ID NO 3 或SEQ ID NO 4的残基190-220的一或多个残基。
5.权利要求4的分离的蛋白，包含选自下组的氨基酸序列SEQID NO 5 ；SEQ ID NO 6 禾口 SEQ ID NO :7ο
6.分离的蛋白，包含选自下组的氨基酸序列SEQID NO 1 ；SEQ IDNO 2 ;SEQ ID NO: 3 ；SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO 5 ；SEQ ID NO 6 ；禾口 SEQ IDNO :7。
7.权利要求1-6之一的分离的蛋白的片段、变体或衍生物。
8.权利要求7的片段，其具有免疫原性并包含选自下组的氨基酸序列的20-200个连 续氨基酸SEQ ID NO 1 ；SEQ ID NO 2 ；SEQ ID NO 3 ；SEQ IDNO 4 ；SEQ ID NO 5 ；SEQ ID NO 6 ；和 SEQ ID NO :7。
9.权利要求7的变体，其包含与选自下组的氨基酸序列至少75%相同的氨基酸序列 SEQ ID NO1 ；SEQ ID NO2 ；SEQ ID NO3 ；SEQ ID NO 4 ；SEQ ID NO5 ；SEQ ID NO 6 ；和 SEQ ID NO :7。
10.抗体或抗体片段，与权利要求1-6之一的分离的蛋白，或权利要求7-9之一的片段、 变体或衍生物结合。
11.分离的核酸，编码权利要求1-6之一的分离的蛋白，或权利要求7-9之一的片段、变 体或衍生物。
12.权利要求11的分离的核酸，包含选自下组的核苷酸序列SEQIDNO 8 ；SEQ ID NO 9 ；SEQ ID NO 10 ；SEQ ID NO 11 ；和 SEQ ID NO :39。
13.遗传构建体，包含权利要求11或12的分离的核酸。
14.权利要求13的遗传构建体，适于进行海豚链球菌重组M蛋白的细菌性表达。
15.权利要求13的遗传构建体，适于进行鱼的DNA接种。
16.宿主细胞，含有权利要求13-15之一的遗传构建体。
17.权利要求16的宿主细胞，是细菌细胞。
18.权利要求16的宿主细胞，是鱼的细胞。
19.组合物，含有至少一种根据权利要求1-6之一的分离的蛋白；根据权利要求7-9之 一的片段、变体或衍生物；根据权利要求10的抗体或抗体片段；根据权利要求11或12的分 离的核酸；或根据权利要求13的遗传构建体；以及可接受的载体，稀释剂或赋形剂。
20.权利要求19的组合物，是能在动物体内激发抗海豚链球菌的保护性免疫应答的疫 苗的形式。
21.权利要求20的组合物，其中所述动物是鱼。
22.权利要求20的组合物，其中所述动物是人。
23.治疗动物的海豚链球菌感染的方法，所述方法包括对所述动物施用权利要求19的 组合物、从而治疗所述海豚链球菌感染的步骤。
24.权利要求23的方法，其中所述动物是鱼。
25.权利要求23的方法，其中所述动物是人。
26.免疫动物以抵抗海豚链球菌感染的方法，所述方法包括对所述动物施用权利要求 20的组合物、从而免疫所述动物抵抗海豚链球菌感染的步骤。
27.权利要求26的方法，其中所述动物是鱼。
28.权利要求26的方法，其中所述动物是人。
29.至少一种根据权利要求1-6之一的分离的蛋白；根据权利要求7-9之一的片段、变 体或衍生物；根据权利要求10的抗体或抗体片段；根据权利要求11或12的分离的核酸； 或者，根据权利要求13的遗传构建体用于治疗动物的海豚链球菌感染的用途。
30.权利要求29的用途，其中所述动物是鱼。
31.权利要求29的用途，其中所述动物是人。
32.确定动物是否正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其成分的方法，所述方法包括， 确定从所述动物获得的生物学样品是否包含根据权利要求1-6之一的分离的蛋白或根据 权利要求7-9之一的片段、变体或衍生物的步骤，所述蛋白或其片段、变体或衍生物的存 在，表示所述动物正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其成分。
33.确定动物是否正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其成分的方法，所述方法包括， 确定从所述动物获得的生物学样品是否包含根据权利要求11或12的分离的核酸的步骤， 所述核酸的存在表示所述动物正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其成分。
34.确定动物是否正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其成分的方法，所述方法包括 确定从所述动物获得的生物学样品是否包含根据权利要求10的抗体或抗体片段的步骤， 所述抗体或抗体片段的存在表示所述动物正在或已经暴露于海豚链球菌细菌或其成分。
35.权利要求32-34之一的方法，其中所述动物是鱼。
36.权利要求32-34之一的方法，其中所述动物是人。
37.诊断试剂盒或组合物，用于检测海豚链球菌细菌、其一或多种分子成分和/或其抗 体，所述试剂盒或组合物包含一或多种选自下组的检测试剂从动物获得的生物样品中的 根据权利要求1-6之一的分离的蛋白；根据权利要求7-9之一的片段、变体或衍生物；根据 权利要求10的抗体或抗体片段；和/或根据权利要求11或12的分离的核酸。
38.权利要求37的诊断试剂盒或组合物，还包含一或多种检测试剂。
全文摘要
本发明提供了海豚链球菌的分离的M蛋白或M样蛋白，编码核酸，遗传构建物以及与分离的M蛋白结合的抗体。本发明还提供了所述M蛋白或M样蛋白的血纤蛋白原结合减弱的同工型和/或片段。分离的M蛋白、抗体和编码核酸可用于诊断、免疫和/或治疗诸如鱼和人等动物的海豚链球菌感染。
文档编号A61P31/00GK101918435SQ200880113271
公开日2010年12月15日 申请日期2008年10月24日 优先权日2007年10月25日
发明者安德鲁·巴恩斯, 贾斯蒂斯·贝亚诺 申请人:昆士兰大学