专利名称：一种真菌菌种lp-19-3及其在含铜废水处理中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种能够去除水中铜离子的真菌菌种LP-19-3及其在含铜废水处理中的用途。
背景技术：
我国铜矿分布广泛，铜矿开采活动极为频繁，由此造成的水和土壤的污染也非常严重。除了铜矿开采以外，铜金属的冶炼和加工、电镀、印染、电子材料漂洗废水、化工、染料 生产等多种工业活动也都会产生含铜废水。目前我国相关地区对此类污染缺乏有效先进的治理措施，现有的治理措施技术落后、治理效果差强人意、成本昂贵、无法负荷全国大面积的污染以及快速出现的污染新区域。这一系列复杂多变的铜矿污染问题使得铜矿区含铜废水污染问题成为了环境污染治理领域一大亟待解决的难题。传统的治理含铜废水的方法大都属于物理化学范畴，包括化学沉淀法、电解法、物理化学吸附、离子螯合、离子交换等。但这些方法存在着产生污泥的二次污染、能耗高、成本昂贵、处理量受限等的缺点，大多应用并不广泛。近年来，生物方法尤其是微生物的方法在治理重金属污染领域逐步被人们所认识和接受。微生物方法具有成本低廉、操作运行简便、处理效率高、无二次污染、易于回收重金属等传统方法不具备的优势。目前，微生物处理技术已经成为世界各国重金属污染治理研究和应用领域的一大热点。但是到目前为止，国内外利用微生物菌种来吸附处理水中铜离子污染的专利技术还非常少见。美国US5578547 (A)-1996-11-26 (Summers, Jr. et al)公开了一种利用泥炭蘇和其他一些植物体制成小珠，将大量的小珠放入污染水体中进行对重金属离子的吸附。该发明并没有利用微生物菌种，而是一些苔藓植物；同时该发明并未针对铜离子，其处理铜离子的效果未知；而且该发明技术仅限于含重金属离子浓度较低的水体。中国200910027229. 3 (陈雁等)公开了一种利用鸭拓草及微生物菌剂混合的形式治理含铜污水。鸭拓草是目前发现的一种铜超积累植物，对铜具有耐受和积累的能力。虽然该发明涉及了微生物菌株的使用，但其中添加的菌剂(包括细菌类和真菌类)是起益生菌作用，即促进鸭拓草的生长以及鸭拓草对于铜离子的修复作用，但菌剂本身并不具有吸附处理铜离子的能力。因此，该发明实质上是利用植物修复的方法来治理含铜污水，并没有使用微生物修复技术。因此，本领域中存在对于处理含铜污水效果良好并且能够进行大规模工业应用的菌种的需要。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种真菌菌种(Peyronellaea pomorum)。本发明的第二个目的在于提供了一种包含真菌的菌剂。本发明的第三个目的在于提供了菌剂的制备方法。
本发明的第四个目的在于提供了一种铜离子处理剂。本发明的第五个目的在于提供了一种处理含铜废水的方法。为达此目的，本发明采用以下技术方案在第一个方面，本发明提供了一种真菌LP-19-3 (Peyronellaea pomorum),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，100101，保藏日期为2012年07月04日，其保藏号为CGMCC No. 6338。本发明的真菌可耐受水溶液中浓度为50mg/L以下的铜离子，优选地耐受浓度为10mg/L以下的铜离子，更优选地耐受浓度为5mg/L以下的铜离子。在第二个方面，本发明提供了一种菌剂，所述菌剂包含第一方面中所述的真菌。在第三个方面，本发明提供了如第二方面所述的菌剂的制备方法，所述方法包括a)培养皿培养将如第一方面所述的真菌的菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，20-30°C，优选22-28°C，进一步优选25°C下培养4_6天，优选4. 4-5. 5天，进一步优选5天；固体培养基具有以下组成马铃薯浸粉4-6g/L，优选4. 5-5. 5g/L，进一步优选5g/L ;葡萄糖或者蔗糖15-25g/L，优选17-23g/L，进一步优选20g/L ;琼脂13_18g/L，优选14-17g/L，进一步优选 16g/L ;氯霉素 0. lg/L ；b) 一级种子培养将步骤a)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，20-30°C，优选22-28°C，进一步优选25°C下培养5_7天，优选地5. 5-6. 5天，更优选地6天，制得一级种子；液体培养基具有以下组成马铃薯浸粉4-6g/L，优选4. 5-5. 5g/L，进一步优选5g/L ;葡萄糖或者蔗糖15-25g/L，优选17-23g/L，进一步优选20g/L ;氯霉素0. lg/L ；c)二级种子培养按液体培养基的体积比为5-15%，优选8-12%，更优选10%的接种量，将所述一级种子接种到发酵罐中，曝气，培养5-7天，优选5. 5-6. 5天，进一步优选6天，制得二级种子；d)混合发酵培养按液体培养基的体积比为10-20%，优选12-18%，更优选15%的接种量，将二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。培养皿培养中，培养温度可以为20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25 V、26°C、27 V、28 V、29°C或30 V ；培养时间可以为4天、4. 5天、110小时、5天、130小时、5. 5天或6天；所用的固体培养基中马铃薯浸粉可以为4g/L、4. 2g/L、4. 5g/L、4. 7g/L、4. 9g/L、5g/L、5. lg/L、5. 3g/L、5. 5g/L、5. 8g/L 或 6g/L,葡萄糖或者鹿糖可以为 15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L 或 25g/L，琼脂可以为 13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L 或 18g/L。一级种子培养中，培养温度可以为 20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C或30°C;培养时间可以为5天、5. 5天、140小时、6天、150小时、6. 5天或7天；所用的液体培养基中马铃薯浸粉可以为4g/L、4. 2g/L、4. 5g/L、4. 7g/L、4. 9g/L、5g/L、5. lg/L、
5.3g/L、5. 5g/L、5. 8g/L 或 6g/L,葡萄糖或者鹿糖可以为 15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L 或 25g/L。二级种子培养中，接种量按液体培养基的体积比可以为5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14% 或 15% ;发酵罐容积可以为 1L、1. 5L、2L、2. 5L、3L、3. 5L、4L、4. 5L 或 5L ;培养时间可以为5天、5. 5天、140小时、6天、150小时、6. 5天或7天。
混合发酵培养中，接种量按液体培养基的体积比可以为10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19% 或 20%o在第四个方面，本发明提供了一种铜离子处理剂，所述铜离子处理剂包含如第一方面所述的真菌，优选地，所述处理为去除或回收。在第五个方面，本发明提供了一种处理含铜废水的方法，所述方法包括将如第一方面所述的真菌、如第二方面所述的菌剂或如第四方面所述的铜离子处理剂与所述含铜废水接触。
本发明的处理含铜废水的方法可包括(a)将含铜废水的pH值调节至5. 0-8. 0，优选5. 5-7. 0，进一步优选6. 0 ；(b)向水体中加入第一方面所述的真菌、如第二方面所述的菌剂或如第四方面所述的铅离子处理剂，于10-35°C，优选15-30°C，进一步优选20°C，震荡4_8小时，优选5_7小时，进一步优选6小时，震荡速度150-220rpm，优选地160_200rpm，最优选地180rpm ；(c)静置8-16小时，优选地10-14小时，最优选地12小时。在本发明的处理含铜废水的方法中，含铜废水的pH值可以为5. 0,5. 5,5. 8,5. 9、
6.0,6. 1,6. 2,6. 5,7. 0,7. 5 或 8. 0 ;处理温度可以为 10 °C、11 °C、12 °C、13 °C、14 °C、15 °C、16 °C、17 °C、18 °C >19 °C >20 °C >21 °C >22 °C >23 °C >24 °C >25 °C >26 °C >27 °C >28 °C >29 °C >30 °C、31°C、32°C、33°C、34°C*35°C ;震荡时间可以为4小时、4. 5小时、5小时、5. 5小时、6小时、6. 5小时、7小时、7. 5小时或8小时；震荡速度可以为150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190卬111、200印111、210卬111或220卬111;静置时间可以为8小时、8. 5小时、9小时、9. 5小时、10小时、10. 5小时、11小时、11. 5小时、12小时、12. 5小时、13小时、13. 5小时或14小时。在本发明的处理含铜废水的方法中，所述含铜废水中铜离子的浓度可为50mg/L以下、优选地为5_30mg/L,最优选地浓度为10_20mg/L,包括5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L、45mg/L 和 50mg/Lo在本发明的处理含铜废水的方法中，所述处理可为去除或回收所述含铜废水中的铜离子。在本发明的处理含铜废水的方法中，所述含铜废水可来源于电镀、冶炼、铸造、农药、采矿、染料、石油、电池、机械、化工、印染、电子材料、染料行业排放的工业废水。在本文中，“高密度培养”又称高密度发酵，一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长。本发明的优点本发明利用真菌菌种处理含铜废水，因为真菌具有比苔藓等植物大得多的比表面积，因此处理效率明显提高；同时，本发明中的菌种是专门耐受高浓度铜离子的，对于铜具有专门性。
图1是真菌菌株LP-19-3在不同Cu(II)浓度下的生长速率。
具体实施例方式
下面具体实施方式
来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1真菌菌种的分离。本发明中的真菌菌种的分离包含以下步骤(I)将取自云南省曲靖市罗平县受铜矿污染的含有大量的二价铜金属离子的10克土壤样品装入含有90毫升无菌水的三角瓶中；(2)用玻璃珠打散，搅匀，制成土壤悬液；(3)用涂布法将土壤悬液涂布在分离培养基平板上，所述分离培养基的组成为■ 无水醋酸钠0. 2406g/L，酵母抽提物0. 15g/L，琼脂15g/L，氯霉素0. lg/L, Cu2+50mg/L，其余为去离子水，且pH=7. 0,120°C高温高压灭菌30分钟；(4)将所涂布的分离培养基在30°C的条件下培养2 4天，获得单个菌株；(5)将所述单个菌株接入新鲜的所述分离培养基中继续进行分离培养，获得纯化 的菌株；(6)对步骤(5)中得到的纯化菌株重复步骤(5)的操作3 5次，以确保所得到的菌株为完全纯化的单个菌株，获得本发明的真菌菌株并且于4°C保存。实施例2菌剂的制备。本发明中的菌剂的制备包含以下步骤DPetri Dishes培养将已经纯化的原始菌种(Lecanicillium sp.)在无菌条件下分别接种于固体培养基II上，室温(25°C)条件下培养5天；固体培养基II具有以下组成马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，氯霉素0. lg/L ；2)—级种子培养将步骤I)培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基II，室温(25°C)条件下培养6天，制得一级种子悬液；液体培养基II具有以下组成马铃薯浸粉5g/L,葡萄糖20g/L,氯霉素0. lg/L ；3)二级种子培养按液体培养基II的体积比为10%的接种量，将一级种子分别接种到2. 5L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为1. 5L，适当曝气，培养6天，制得二级种子;4)混合发酵培养按液体培养基II的体积比为15%的接种量，将二级种子接种到IOL的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为7L，进行高密度发酵培养，获得菌剂。实施例3真菌菌种对铜离子的耐受力测定。在AY固体培养基中分别添加 0、5、10、15、25、50、100mg/L Cu (II)，将 LP-19-3 分别接种于以上不同浓度Cu(II)的培养基上，室温条件下培养12天后生长情况如图1。从图1中可以看出，菌株的菌体生长基本呈现线性的趋势。Cu2+浓度对于菌株的生长具有非常明显的影响。当培养基中Cu2+浓度在0-5mg/L的范围内时，菌体生长正常，并未受到Cu2+的影响。但当Cu2+浓度在5-50mg/L时，菌体的生长受到了明显的抑制，速率明显降低，一直保持比较缓慢的生长趋势。但菌株仍能够耐受该浓度范围，仍能生长，在生长周期结束时有2-3cm的菌体直径。当Cu2+浓度大于100mg/L时，菌株停止生长，即对该浓度范围不耐受。从上述分析可以得出，总的来说，LP-19-3的生长趋势与生长时间呈线性的关系，即菌株菌丝直径随时间的增长而增加。培养基中Cu(II)的浓度在10mg/L以下时对菌体的生长几乎没有影响，而在10-50mg/L时，菌体的生长受到一定程度的抑制，生长速率有一定趋缓。但总体上菌株LP-19-3对于铜离子具有很高的耐受能力。
实施例4pH对菌株吸附Cu (II)能力的影响配制含有50mg/L Cu(II)的pH值分别为5. 0,6. 0,7. 0,8. 0的溶液，溶液体积为150mL,装入250mL三角瓶中。分别在这4瓶溶液中添加等量2g的真菌菌体，摇床震荡时间为5h，震荡速度180rpm，震荡后静置12h。将含菌体的溶液离心(llOOOrpm，5min)，之后取上清液，测定上清液中Cu(II)的浓度。结果见表I。表I pH对菌 株吸附Cu (II)能力的影响
权利要求
1.一种真菌LP-19-3 (Peyronellaea pomorum),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2012年07月04日，保藏号为CGMCC No. 6338。
2.如权利要求1所述的真菌，其特征在于，所述真菌耐受水溶液中浓度为50mg/L以下的铜离子，优选地耐受浓度为10mg/L以下的铜离子，更优选地耐受浓度为5mg/L以下的铜离子。
3.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含如权利要求1或2所述的真菌。
4.如权利要求3所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括a)培养皿培养将如权利要求1或2所述的真菌的菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，20-30°C，优选22-28°C，进一步优选25°C下培养4_6天，优选4. 4-5. 5天，进一步优选5天；固体培养基具有以下组成马铃薯浸粉4-6g/L，优选4. 5-5. 5g/L，进一步优选 5g/L ;葡萄糖或者蔗糖15-25g/L，优选17-23g/L，进一步优选20g/L ;琼脂13_18g/L，优选 14-17g/L，进一步优选 16g/L ;氯霉素 O. lg/L ；b)—级种子培养将步骤a)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，20-300C，优选22-28 °C，进一步优选25°C下培养5_7天，优选地5. 5-6. 5天，更优选地6天，制得一级种子；液体培养基具有以下组成马铃薯浸粉4-6g/L，优选4. 5-5. 5g/L，进一步优选5g/L ;葡萄糖或者蔗糖15-25g/L，优选17-23g/L，进一步优选20g/L ;氯霉素O. lg/L ；c)二级种子培养按液体培养基的体积比为5-15%，优选8-12%，更优选10%的接种量， 将所述一级种子接种到发酵罐中，曝气，培养5-7天，优选5. 5-6. 5天，进一步优选6天，制得二级种子；d)混合发酵培养按液体培养基的体积比为10-20%，优选12-18%，更优选15%的接种量，将二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
5.一种铜离子处理剂，其特征在于，所述铜离子处理剂包含如权利要求1所述的真菌， 优选地，所述处理为去除或回收。
6.一种处理含铜废水的方法，其特征在于，所述方法包括将如权利要求1或2所述的真菌、如权利要求3所述的菌剂或如权利要求5所述的铜离子处理剂与所述含铜废水接触。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括Ca)将含铜废水的pH值调节至5. 0-8. 0，优选5. 5_7，进一步优选6. O ；(b)向水体中加入权利要求1或2所述的真菌、如权利要求3所述的菌剂或如权利要求5所述的铜离子处理剂，于10-35°C，优选15-30°C，进一步优选20°C，震荡4_8小时，优选 5-7小时，进一步优选6小时，震荡速度150-220rpm，优选160_200rpm，进一步优选180rpm ；(c)静置8-16小时，优选10-14小时，进一步优选12小时。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述含铜废水中铜离子的浓度为50mg/L以下、 优选为5-30mg/L,最优选浓度为10-20mg/L。
9.如权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述处理为去除或回收所述含铜废水中的铜离子。
10.如权利要求6至9中任一项所述的方法，其中所述含铜废水来源于电镀、冶炼、铸造、农药、采矿、染料、石油、电池、机械、化工、印染、电子材料和/或染料行业排放的工业废水。
全文摘要
本发明公开了一种能够去除或回收水中铜离子的真菌菌种LP-19-3及其菌剂，含有所述菌种或菌剂的铜离子处理剂以及处理含铜废水的方法。本发明真菌菌种LP-19-3具有比苔藓等植物大得多的比表面积，因此对含铜废水的处理效率明显提高；同时，本发明中的菌种是专门耐受高浓度铜离子的，对于铜具有专门性。
文档编号C12R1/645GK102994393SQ201210311648
公开日2013年3月27日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者孙璐, 姚一夫, 朱彤, 宋宝华, 王俩, 张梅华, 黄惠, 李 雨, 丛海扬, 张翔宇 申请人:中节能六合天融环保科技有限公司