专利名称：一种真菌菌种lp-18-3及其在含铅水体处理中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种能够去除水中铅离子的真菌菌种LP-18-3及其在含铅水体处理中的用途。
背景技术：
铅是环境中常见的重金属污染物之一，铅元素在自然界中分布很广。铅在土壤中的溶解度很小，停留时间长，具有很强的不可降解性和蓄积性。铅元素以及铅的化合物能够通过“三废”进入自然环境(尤其是水和土壤环境)中，造成严重的水及土壤污染以及对人体的健康危害。重金属铅污染物来源大致分为天然来源和人为来源两大类。天然来源包括岩石风化后产生的矿物；而人为来源则更为广泛和普遍，也是土壤中铅污染的主要源头。铅锌矿山矿石的大量开采，金属的冶炼加工，含铅汽油的大量使用，加工制造业等都是不可忽视 的重要的人为来源。随着人类工业化进程的不断加深，全球每年消耗铅量约为400万吨以上，而其中只有25%左右的铅被回收重新利用，其余则均以各种形式进入自然环境中成为污染物。土壤中的铅对于植物的生长产生不利的影响，抑制植物的生长发育，同时铅还能够在植物体内富集，并经由食物链进入人体。由于铅在自然环境和人类环境中的广泛存在性，人体能够通过多种途径摄入铅。过量的铅对人体尤其是儿童的中枢神经系统有严重的毒害，同时铅还对人体的血液系统有抑制作用。此外，铅对人体的肝肾、心血管、骨骼、胃肠道、内分泌等多个系统也具有毒性作用。传统的治理含铅废水的方法大都属于物理化学范畴，包括化学沉淀法、离子交换法、物理化学吸附法及液膜分离法等。但这些方法存在着产生二次污染、能耗高、成本昂贵、处理量受限等的缺点，大多应用并不广泛。目前国内外处理高浓度含铅废水多采用中和沉淀法和硫化沉淀法，但低浓度废水的处理就相对复杂的多，所使用的方法大都占地面积大，运行成本过高。近年来，国内开发了一系列对于铅污染水体的新型治理方法，如化学絮凝齐U、电化学方法、膜处理技术、吸附法等。除了传统的物理化学方法，近年来，生物方法尤其是微生物的方法在治理重金属污染领域逐步被人们所认识和接受。微生物修复法是近几十年来国内外新兴的一类治理重金属污染的方法，这类方法利用细菌或真菌的生理特性及其产生的某些化学物质与重金属发生吸附、氧化还原、沉淀、螯合等化学反应，从而从环境中去除重金属或使重金属无毒无害化。微生物方法具有成本低廉、操作运行简便、处理效率高、无二次污染、易于回收重金属等传统方法不具备的优势。目前，微生物处理技术已经成为世界各国重金属污染治理研究和应用领域的一大热点。国内对于耐受和修复土壤中铅的微生物菌种也进行了一定的研究，赵玉清等(中国专利申请第CN200710106608. 2)公开了一种肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae),周薇等(耐铅锌微生物的筛选及吸附性能的研究，四川农业大学，2009)从铅锌矿区土壤中筛选出了一株镰刀霉菌属的菌株(Fusarium sp.),夏文杰等(中国专利申请第CN201010273067. 4号)公开了一种铜绿假单胞菌，这些菌均有一定的铅污染水体处理能力，但是目前还未获得处理铅污染水体效果良好并且能够大规模应用于铅污染水体处理的菌种。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种真菌菌种(Lecanicillium sp.)。本发明的第二个目的在于提供一种包含真菌的菌剂。本发明的第三个目的在于提供菌剂的制备方法。本发明的第四个目的在于提供一种铅离子处理剂。
本发明的第五个目的在于提供一种处理含铅水体的方法。
为达此目的，本发明采用以下技术方案在第一个方面,本发明提供了一种真菌LP-18-3 (Lecanicillium sp.),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)Jia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，100101，保藏日期为2012年07月04日，其保藏号为CGMCC No. 6337。本发明的真菌可以耐受水溶液中浓度为1000mg/L以下的铅离子。本发明的真菌可以耐受水溶液中浓度为800mg/L以下、600mg/L以下、500mg/L以下、400mg/L以下、300mg/L以下、200mg/L以下、100mg/L以下、50mg/L以下的的铅离子。在第二个方面，本发明提供了一种菌剂，所述菌剂包含第一方面中所述的真菌。在第三个方面，本发明提供了如第二方面所述的菌剂的制备方法，所述方法包括a)培养皿培养将如第一方面所述的真菌的菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，20-30°C，优选22-28°C，进一步优选25°C下培养4_6天，优选4. 4-5. 5天，进一步优选5天；固体培养基具有以下组成马铃薯浸粉4-6g/L，优选4. 5-5. 5g/L，进一步优选5g/L ;葡萄糖或者蔗糖15-25g/L，优选17-23g/L，进一步优选20g/L ;琼脂13_18g/L，优选14-17g/L，进一步优选 16g/L ;氯霉素 0. lg/L ；b) 一级种子培养将步骤a)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，20-30°C，优选22-28°C，进一步优选25°C下培养5_7天，优选地5. 5-6. 5天，更优选地6天，制得一级种子；液体培养基具有以下组成马铃薯浸粉4-6g/L，优选4. 5-5. 5g/L，进一步优选5g/L ;葡萄糖或者蔗糖15-25g/L，优选17-23g/L，进一步优选20g/L ;氯霉素0. lg/L ；c)二级种子培养按液体培养基的体积比为5-15%，优选8-12%，更优选10%的接种量，将所述一级种子接种到发酵罐中，曝气，培养5-7天，优选5. 5-6. 5天，进一步优选6天，制得二级种子；d)混合发酵培养按液体培养基的体积比为10-20%，优选12-18%，更优选15%的接种量，将二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。培养皿培养中，培养温度可以为20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25 V、26°C、27 V、28 V、29°C或30 V ；培养时间可以为4天、4. 5天、110小时、5天、130小时、5. 5天或6天；所用的固体培养基中马铃薯浸粉可以为4g/L、4. 2g/L、4. 5g/L、4. 7g/L、4. 9g/L、5g/L、5. lg/L、5. 3g/L、5. 5g/L、5. 8g/L 或 6g/L,葡萄糖或者鹿糖可以为 15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L 或 25g/L，琼脂可以为 13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L 或 18g/L。一级种子培养中，培养温度可以为 20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、26°C、27°C、28°C、29°C或30°C;培养时间可以为5天、5. 5天、140小时、6天、150小时、6. 5天或7天；所用的液体培养基中马铃薯浸粉可以为4g/L、4. 2g/L、4. 5g/L、4. 7g/L、4. 9g/L、5g/L、5. lg/L、
5.3g/L、5. 5g/L、5. 8g/L 或 6g/L,葡萄糖或者鹿糖可以为 15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、 23g/L、24g/L 或 25g/L。二级种子培养中，接种量按液体培养基的体积比可以为5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14% 或 15% ;发酵罐容积可以为 1L、1. 5L、2L、2. 5L、3L、3. 5L、4L、4. 5L 或 5L ;培养时间可以为5天、5. 5天、140小时、6天、150小时、6. 5天或7天。混合发酵培养中，接种量按液体培养基的体积比可以为10%、11%、12%、13%、14%、 15%、16%、17%、18%、19% 或 20%o在第四个方面，本发明提供了一种铅离子处理剂，所述铅离子处理剂包含如第一方面所述的真菌或如第二方面所述的菌剂，优选地，所述处理为去除或回收。在第五个方面，本发明提供了一种处理含铅水体的方法，所述方法包括将如第一方面所述的真菌、如第二方面所述的菌剂或如第四方面所述的铅离子处理剂与所述含铅水体接触。本发明的处理含铅水体的方法可包括(a)将含铅水体的pH值调节至5. 0-7. 6，优选5. 5-7. 0，进一步优选6. 0 ；(b)向水体中加入第一方面所述的真菌、如第二方面所述的菌剂或如第四方面所述的铅离子处理剂，于10-35°C，优选15-30°C，进一步优选20°C下，震荡4_8小时，优选5_7小时，进一步优选6小时，震荡速度150-220rpm，优选地160_200rpm，最优选地180rpm ；(c)静置8-16小时，优选地10-14小时，最优选地12小时。在本发明的处理含铅水体的方法中，含铅水体的pH值可以为5. 0,5. 5,5. 8,5. 9、
6.0,6. 1,6. 2,6. 5,7. 0,7. 2,7. 4 或 7. 6 ;处理温度可以为 10°C、11°C、12 °C、13 °C、14 °C、15 °C、16 °C、17 °C ,18 °C >19 °C >20 °C >21 °C >22 °C >23 °C >24 °C >25 °C >26 °C >27 °C >28 °C >29 °C、30°C、31°C、32°C、33°C、34°C或35°C ;震荡时间可以为4小时、4. 5小时、5小时、5. 5小时、6小时、6. 5小时、7小时、7. 5小时或8小时；震荡速度可以为150rpm、160rpm、170rpm、180rpm、190rpm、200rpm、210rpm*220rpm ;静置时间可以为 8 小时、8. 5 小时、9 小时、9. 5 小时、10小时、10. 5小时、11小时、11. 5小时、12小时、12. 5小时、13小时、13. 5小时或14小时。在本发明的处理含铅水体的方法中，所述含铅水体中铅离子的浓度可为500mg/L 以下、优选地为 50-300mg/L,包括 60mg/L、70mg/L、80mg/L、90mg/L、100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L、140mg/L、150mg/L、200mg/L 和 250mg/L。在本发明的处理含铅水体的方法中，所述处理可为去除或回收所述含铅水体中的铅离子。在本发明的处理含铅水体的方法中，所述含铅水体可来源于电镀、冶炼、铸造、农药、采矿、染料、石油、电池、机械、印刷行业排放的工业废水或空气中含铅颗粒物在水体中的沉降。在本文中，“高密度培养”又称高密度发酵，一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长。本发明的优点本发明提供的真菌菌种LP-18-3可以耐受水溶液中高浓度的铅离子，并能够去除或回收污水中的铅离子，其成本低廉，大规模生产方便，便于实现产业化以及其他各种下游应用。
图1是真菌菌株LP-18-3在不同Pb(II)浓度下的生长速率。
具体实施例方式
下面具体实施方式
来进一步说明本发明的技术方案。实施例1真菌菌种的分离。本发明中的真菌菌种的分离包含以下步骤( I)将采自云南省曲靖市罗平县受铅锌矿污染的含有大量的二价铅锌金属离子的10克新鲜土样装入含有90毫升无菌水的三角瓶中；(2)用玻璃珠打散，搅匀，制成土壤悬液；(3)用涂布法将土壤悬液涂布在分离培养基平板上，所述分离培养基的组成为■ 无水醋酸钠0. 2406g/L,酵母抽提物0. 15g/L，琼脂15g/L，氯霉素0. lg/L,其余为去离子水，且pH=7. 0,120°C高温高压灭菌30分钟；(4)将所涂布的分离培养基在30°C的条件下培养2 4天，获得单个菌株；(5)将所述单个菌株接入新鲜的所述分离培养基中继续进行分离培养，获得纯化的菌株；(6)对步骤(5)中得到的纯化菌株重复步骤(5)的操作3 5次，以确保所得到的菌株为完全纯化的单个菌株，获得本发明的真菌菌种并且于4°C保存。实施例2菌剂的制备。本发明中的菌剂的制备包含以下步骤I) Petri Dishes培养将已经纯化的原始菌种(Lecanicillium sp.)在无菌条件下分别接种于固体培养基上，室温(25°C)条件下培养5天；固体培养基具有以下组成马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，氯霉素0. lg/L ；2)—级种子培养将步骤I)培养的菌种在无菌条件下分别接种于液体培养基，室温(25°C)条件下培养6天，制得一级种子悬液；液体培养基具有以下组成马铃薯浸粉5g/L,葡萄糖20g/L,氯霉素0. lg/L ；3) 二级种子培养按液体培养基的体积比为10%的接种量，将一级种子分别接种到2. 5L的发酵罐中，发酵罐内培养液的总体积为1. 5L，适当曝气，培养6天，制得二级种子;4)混合发酵培养按液体培养基的体积比为15%的接种量，将二级种子接种到IOL的发酵罐中，发酵罐内的培养基总体积为7L，进行高密度发酵培养，获得菌剂。实施例3真菌菌种对铅离子的耐受力测定。在AY 固体培养基中分别添加 0、50、100、200、300、400、500mg/L Pb(II)，将LP-18-3分别接种于以上不同浓度Pb (II)的培养基上，室温条件下培养25天后生长情况如图1。从图1中可以看出，LP-18-3在各个Pb(II)浓度下的生长速率均基本符合线性生长规律。在Pb(II)浓度为0-100mg/L的范围内，LP-18-3的生长几乎不受影响；而当Pb(II)浓度达到了 200mg/L时，LP-18-3最初的生长也完全没有受到抑制，只是到了约20天之后生长有一定的缓慢趋势。当Pb(II)浓度达到了 300-400mg/L时，LP-18-3的生长受到了一定程度的抑制，生长速度与Pb(II)浓度在300mg/L以下时的速度相比有所降低，但程度并不十分明显，后期的缓慢程度要更明显一些。而当Pb(II)浓度达到500mg/L时，LP-18-3的生长受到了明显的抑制，与之前的浓度梯度相比生长显著减缓，但在25天生长周期结束后也能达到约5cm的菌体直径。从上述分析可以得出，总的来说，LP-18-3的生长趋势与生长时间呈线性的关系，即菌株菌丝直径随时间的增长而增加。培养基中Pb(II)的浓度在300mg/L以下时对菌体的生长几乎没有影响，而在300-500mg/L时，菌体的生长受到一定程度的抑制，生长速率有一定趋缓。但总体上菌株LP-18-3对于铅离子具有很高的耐受能力。实施例4. pH对菌株吸附Pb2+能力的影响配制含有400mg/L Pb2+的pH值分别为5. 0、6. 0、7. 0、7. 6的溶液，溶液体积为150mL，装入250mL三角瓶中。分别在这4瓶溶液中添加等量2g的真菌菌体，反应温度为25°C，摇床震荡时间为5h，震荡速度180rpm，震荡后静置12h。将含菌体的溶液离心(11000rpm，5min)，之后取上清液，测定上清液中Pb2+的浓度。实验结果见表I表IpH对菌株吸附Pb2+能力的影响
权利要求
1.一种真菌LP-18-3 (Lecanicillium sp.),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2012年07月04日，保藏号为CGMCC No. 6337。
2.如权利要求1所述的真菌，其特征在于，所述真菌耐受水溶液中浓度为1000mg/L以下的铅离子，优选耐受浓度为50-800mg/L的铅离子，进一步优选耐受浓度为100_600mg/ L的铅离子，还进一步优选耐受浓度为200-500mg/L的铅离子，最优选耐受浓度为 300-400mg/L的铅离子。
3.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含如权利要求1或2所述的真菌。
4.如权利要求3所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括a)培养皿培养将如权利要求1或2所述的真菌的菌种在无菌条件下分别接种于固体培养基上，20-30°C，优选22-28°C，进一步优选25°C下培养4_6天，优选4. 4-5. 5天，进一步优选5天；固体培养基具有以下组成马铃薯浸粉4-6g/L，优选4. 5-5. 5g/L，进一步优选 5g/L ;葡萄糖或者蔗糖15-25g/L，优选17-23g/L，进一步优选20g/L ;琼脂13_18g/L，优选 14-17g/L，进一步优选 16g/L ;氯霉素 O. lg/L ；b)—级种子培养将步骤a)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，20-300C，优选22-28 °C，进一步优选25°C下培养5_7天，优选地5. 5-6. 5天，更优选地6天，制得一级种子；液体培养基具有以下组成马铃薯浸粉4-6g/L，优选4. 5-5. 5g/L，进一步优选5g/L ;葡萄糖或者蔗糖15-25g/L，优选17-23g/L，进一步优选20g/L ;氯霉素O. lg/L ；c)二级种子培养按液体培养基的体积比为5-15%，优选8-12%，更优选10%的接种量， 将所述一级种子接种到发酵罐中，曝气，培养5-7天，优选5. 5-6. 5天，进一步优选6天，制得二级种子；d)混合发酵培养按液体培养基的体积比为10-20%，优选12-18%，更优选15%的接种量，将二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
5.一种铅离子处理剂，其特征在于，所述铅离子处理剂包含如权利要求1或2所述的真菌或如权利要求3所述的菌剂，优选地，所述处理为去除或回收。
6.一种处理含铅水体的方法，其特征在于，所述方法包括将如权利要求1或2所述的真菌、如权利要求3所述的菌剂或如权利要求5所述的铅离子处理剂与所述含铅水体接触。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括Ca)将含铅水体的pH值调节至5. 0-7. 6，优选5. 5-7. 0，进一步优选6. O ；(b)向水体中加入权利要求1或2所述的真菌、如权利要求3所述的菌剂或如权利要求5所述的铅离子处理剂，于10-35°C，优选15-30°C，进一步优选20°C，震荡4_8小时，优选5-7小时，进一步优选6小时，震荡速度150-220rpm，优选160_200rpm，进一步优选180rpm ；(c)静置8-16小时，优选10-14小时，进一步优选12小时。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中所述含铅水体中铅离子的浓度为1000mg/L以下、优选为600mg/L以下，进一步优选浓度为300mg/L以下。
9.如权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述处理为去除或回收所述含铅水体中的铅离子。
10.如权利要求6至9中任一项所述的方法，其中所述含铅水体来源于电镀、冶炼、铸造、农药、采矿、染料、石油、电池、机械和/或印刷行业排放的工业废水或空气中含铅颗粒物在 水体中的沉降。
全文摘要
本发明公开了一种能够去除或回收水中铅离子的真菌菌种LP-18-3及其菌剂，含有所述菌种或菌剂的铅离子处理剂以及处理含铅水体的方法。本发明提供的真菌菌种LP-18-3可以耐受水溶液中高浓度的铅离子，并能够去除或回收污水中的铅离子，其成本低廉，大规模生产方便，便于实现产业化以及其他各种下游应用。
文档编号C12N1/14GK102994394SQ20121031167
公开日2013年3月27日 申请日期2012年8月28日 优先权日2012年8月28日
发明者姚一夫, 孙璐, 宋宝华, 王昕竑, 张梅华, 黄惠, 张翔宇, 郭炜, 杨鹤峰 申请人:中节能六合天融环保科技有限公司