右，而L2菌株产酸量明显减少，pH 值下降缓慢，36h以后，菌体几乎不再产酸，pH趋于稳定，维持在3. 7左右。
[0062] 5.优势菌株体外抑菌活性的测定：
[0063] 将标准大肠杆菌菌株ATCC25922和肠炎沙门氏菌分别接种于营养肉汤，200r/min 摇床过夜培养后，用麦氏比浊仪将菌液浓度稀释至1. 〇X108cfu/ml，取100ul均匀涂布于 LB琼脂平板上，37°C干燥30min后，在平板上均匀放置3个灭菌牛津杯，将培养16h的优势 乳酸杆菌菌悬液加入牛津杯至刚满，置于37°C恒温培养箱培养12后，测量抑菌圈的直径， 用无菌MRS作为对照。结果如图9、图10、图11所示。
[0064] 抑菌活性判定标准：抑菌圈直径< 5mm为抑菌性弱；抑菌圈直径5~10mm为抑菌 性较弱，抑菌圈直径10~15mm为抑菌性较强，抑菌圈直径多15mm为抑菌性强。
[0065] 实验结果显示，乳酸杆菌优势菌株L2、L4、L10对大肠杆菌ATCC25922形成抑菌圈 的直径分别为18mm、9mm、8mm，对肠炎沙门氏菌形成抑菌圈的直径分别为6mm、0mm、8mm。由 抑菌试验可知，L2菌株对大肠杆菌ATCC25922具有较强的抑制作用，而L4、L10菌株对大肠 杆菌也有一定程度的抑制作用，但抑菌作用较弱；三株菌对肠炎沙门氏菌的抑制效果均不 如对大肠杆菌ATCC25922的抑菌效果，其中L2、L10对肠炎沙门氏菌的抑菌作用较弱，而L4 对肠炎沙门氏菌几乎无抑菌作用。故筛选出乳酸杆菌L2菌株。
[0066] 6. 16S rRNA鉴定及系统进化树：
[0067]用 16S rRNA 通用引物 16S 27f(AGAGITTGATCCTGGCTCAG，如 SEQ ID No. 1 所示） 和 16S 1525r (AAGGAGGTGATCCAGCCGCA，如 SEQ ID No. 2 所示）扩增乳酸杆菌 L2 菌株的 16S rRNA 片段；PCR 反应使用 10yl 体系：2Xpfu Mix 5uL，16S 27f(10ymol/L)0.2yl，16S 1525r (10 y mol/L) 0? 2 y 1，菌液 1 y 1，无菌水 3. 6 y 1。PCR 反应程序为：95°C预变性 lOmin ; 95°〇变性3〇8,56.2°0退火3〇8,721：延伸3〇8,30个循环；721：延伸1〇111111。？0?产物用1% 的琼脂糖凝胶电泳，DNA Green染色，检测PCR产物大小。
[0068] DNA胶回收试剂盒对菌液PCR产物进行纯化，用微量紫外分光度计检测纯化产物 浓度后，将纯化产物与PGEM-T载体连接，随后转入大肠杆菌DH5 a感受态，蓝白斑筛选后， 挑阳性克隆菌用通用引物 M13(M13f :TGTAAAACGACGGCCAGT，如 SEQ ID No. 3 所示；M13r : CAGGAAACAGCTATGACC，如SEQ ID No. 4所示）进行PCR扩增，并选取阳性克隆进行测序。
[0069] 经PCR扩增的序列全长约为1500bp，L2菌株的16S rRNA PCR产物经测序后，在 NCBI中的GeneBank核酸序列数据库中进行Blast序列比较，结果显示，L2菌株与唾液乳酸 杆菌（Lactobacillus salivarius)16S rRNA序列的同源性达到99%。结合形态学特征，可 判定为同种。L2菌株的16SrRNA序列全长为1475bp (图12)，具体分析如SEQ ID No. 5所 示。进化树（图13)表明来自人、鸡、猪胃肠道的唾液乳酸杆菌具有很高的同源性。
[0070] 研宄报道，乳酸菌在提高机体生长性能的同时（ROBINSONA P H，ERASMUS L J.Effects of analyzable diet components on responses of lactating dairy cows to Saccharomyces cerevisiae based yeast products:A systematic review of the literature [J].Anim Feed Sci Technol, 2009, 149:185-198)，对肠杆菌科细菌在肠道各 部位的定植水平有明显降低作用，如Van Schie报道，乳酸杆菌代谢产生的乳酸和挥发性 脂肪酸能够降低沙门氏菌在肠道的定植水平（Magnusson J, Strum K，Roos S，et al. Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria [J] ? FEMS Microbiol Lett, 2003, 219:129-135)，进而影响到肠道微生物区系的 平衡。乳酸菌素、乳酸、丙酸等代谢产物是乳酸菌在代谢过程中分泌产生的，目前对乳酸菌 拮抗致病菌机理的研宄较多的乳酸菌素及其产生的酸性物质。与L4、L10菌株相比，乳酸杆 菌L2菌株对大肠杆菌ATCC25922具有较强抑制作用的作用机制与其较强的产酸能力有关。 Pediocin为乳酸菌产生的细菌素的一种，对其三维结构研宄发现，其N端中部形成独特的 YGNGVxCxxXXCXV氨基酸序列，C端a螺旋则与其抗菌活性密切相关。
【主权项】
1. 一种耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株，其特征在于：所述菌株为唾液乳酸杆菌 (Lactobacillussalivarius)L2,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2014614。
2. 根据权利要求1所述的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株，其特征在于：所述菌株是从家禽 肠道内容物中筛选出的。
3. -种如权利要求1所述的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：包括 下列步骤： 1) 菌株分离纯化：取健康家禽肠道内容物，用无菌水稀释后，涂布在乳酸杆菌选择性 培养基上进行厌氧培养，分离出具有溶钙圈的单菌落，反复划线纯化，得纯化菌； 2) 取步骤1)所得纯化菌制成菌液，分别置于酸性的MRS培养基、含有牛胆盐的MRS培 养基中进行厌氧培养，得优势菌株； 3) 检测步骤2)所得优势菌株对大肠杆菌和沙门氏菌的体外抑菌活性，得具有抗大肠 杆菌、沙门氏菌活性的乳酸杆菌。
4. 根据权利要求3所述的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：步骤1) 中，IL所述的乳酸杆菌选择性培养基包含以下组分：蛋白胨10g、牛肉浸粉10g、酵母浸粉 2g、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、枸橼酸三铵2g、硫酸镁0. 2g、硫酸锰0. 05g、吐温801g、葡萄 糖20g、碳酸钙5g、琼脂25g。
5. 根据权利要求3所述的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：步骤1) 所得纯化菌在所述乳酸杆菌选择性培养基上形成边缘整齐、表面光滑、有溶钙圈、整齐度均 一的乳白色圆形菌落；将该纯化菌菌株进行革兰氏染色，油镜下观察为杆状的革兰氏阳性 菌，单个或呈短链状排列。
6. 根据权利要求3所述的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：步骤 2)中，IL所述的MRS培养基包含以下组分：牛肉浸出物10g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、 葡萄糖20g、醋酸钠5g、柠檬酸二铵2g、吐温800.lg、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0. 58g、硫酸锰 0. 28g〇
7. 根据权利要求6所述的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：步骤2) 中，所述的含有牛胆盐的MRS培养基中，牛胆盐的浓度为3. 0g/L。
8. 根据权利要求6或7所述的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：步 骤2)中，所述菌液中乳酸杆菌的浓度为2. 0X108cfu/ml;300y1菌液对应加入5.Oml的含 有牛胆盐的MRS培养基中。
9. 根据权利要求3所述的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株的筛选方法，其特征在于：步骤3) 中，所述大肠杆菌为标准大肠杆菌菌株ATCC25922 ;所述沙门氏菌为肠炎沙门氏菌。
10. -种如权利要求1所述的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株在制备用于防治家禽细菌性消 化道疾病的微生态制剂方面的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株及其筛选方法和应用，所述菌株为唾液乳酸杆菌(Lactobacillus salivarius)L2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2014614。本发明的耐酸耐胆盐乳酸杆菌菌株，分离自健康鸡肠道内容物，在模拟胃肠道环境中能够耐受酸度pH3.0和3g/L胆盐浓度；对数生长期较长，产酸能力较强；体外抑菌试验表明，L2菌株对大肠杆菌具有较强的抑制作用，在一定程度上也可抑制肠炎沙门氏菌的生长；该菌株具有耐酸耐胆盐的特性且具有较高的抗大肠杆菌、沙门氏菌活性，生长迅速、产酸能力强，可用于制备适宜于禽用的微生态制剂。CCTCC NO: M 201461420141202
【IPC分类】C12Q1-04, A61P31-04, A61K35-744, C12R1-225, C12N1-20
【公开号】CN104789497
【申请号】CN201510156069
【发明人】王彦彬, 冯会贤, 康相涛, 刘小军, 田亚东, 郭克豹, 孙桂荣, 韩瑞丽, 蒋瑞瑞, 李国喜, 闫峰宾, 李转见
【申请人】河南农业大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月2日