分别可生产丁酸和正丁醇的菌株、及生成正丁醇的方法
【技术领域】
[0001] 本发明关于一种利用代谢工程构建的菌株，且特别关于一种利用此技术构建而成 并可生产丁酸的菌株、与生产正丁醇的菌株。
【背景技术】
[0002] 丁酸为一种短链脂肪酸并可用于多种不同用途。举例而言，丁酸的衍生物 丁酸酯（butyrate ester)可为饮料、食品或化妆品的调味剂（参阅Armstronga and Yamazakibl986、Dwidar et al.2012)。另举例而言，丁酸与纤维素组成的聚合物可用来制 造塑料或纺织纤维（参阅Cao et al.2011、El_Shafee et al.2001)。更举例而言，丁酸具 备抗癌疗效（参阅R印haeli et al. 2000)。此外，由于丁酸为正丁醇等生物燃料的前驱物， 故其商业价值相当可观。已有文献提出触媒转化丁酸成正丁醇的方法，如微生物的生物转 化、或化学催化剂涉及的氢化反应（参阅Dwidar et al.2012、Kim et al.2011)。
[0003] 丁酸目前在商业上的制造为采用原油为原料的化学合成（参阅Cascone2008)。 然而，由于对全球暖化的关切与自然产物的需求已迫使产业重视丁酸的发酵制造。梭菌属 (Clostridium)为一种格兰氏阳性并产孢子的绝对厌氧菌。由于梭菌属具高丁酸产率与产 效，长久以来一直研究此菌的丁酸生成（参阅Zhang et al. 2009)。不过，梭菌属的发酵相 当繁琐，故须相当注意影响丁酸生成的原因（参阅Dwidar et al. 2012)。梭菌属的典型发 酵按顺序有产酸（acidogenesis)阶段与产溶剂（solventogenesis)阶段。在第一阶段，丁 酸、乙酸及氢为主要产物。接着，所产生的酸在第二阶段中的再吸收将生成丙酮、正丁醇与 乙醇，这即为所谓的"ABE 发酵（ABE fermentation)"（参阅 Jones and Woodsl986)。另外， 梭菌属的基因工具的缺乏与对其生理信息的了解的不足也妨碍利用此菌生产丁酸的发展。
[0004] 近年来，正丁醇已逐渐受到国内、外大厂的重视，此主要原因在于正丁醇具有高能 源密度与接近汽油的性质，且正丁醇还可产生较乙醇多的能量并具有低腐蚀性。于是，无须 更换现有的汽油输送管线及储存设备，便能将汽油替换为正丁醇，且正丁醇的运送亦无安 全疑虑。另外，正丁醇本身即可作为液态燃料。举例而言，85%正丁醇与汽油的混合物可直 接用于现有的汽油引擎，且燃烧后，仅排放二氧化碳，不会产生S0 X、N0X与一氧化碳等有毒 气体。倘若正丁醇的来源为生物质，则其燃烧便可完成自然界的二氧化碳循环，因此正丁醇 亦可视为环境友好的绿色能源（参阅D Uerre2007)。正丁醇的传统制造为微生物的发酵。 在公元1916年，人类便知道利用丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)生产丙酮、 正丁醇及乙醇，此为ABE发酵（参阅Lee et al. 2008)。在发酵过程中，先生产丁酸、丙酸、 乙酸与乳酸，当发酵液的pH值下降时，则会转入所谓蝴蝶（butterfly)代谢途径，以产生丙 酮、正丁醇及乙醇（参阅Jones and Woodsl986)。由此可知，各界均重视如何从生物质来制 得正丁醇。可想而知的是：生物质的利用将能大幅降低石化燃料造成的温室效应。
[0005] 大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli)易培养，且易进行基因操作，因而已广泛 用作生物材料。另一个方面，大肠杆菌的生理信息与发酵技术均已详载于许多工具书。许 多研究也已提出利用大肠杆菌制造生物质燃料与高价值的化学物质（参阅Clomburg and Gonzalez2010、Yu et al.2011)。为达成有效生产丁酸与正丁醇的目标，大肠杆菌的代谢工 程显然为一个可行的策略。
[0006] 迄今仅有少数的利用大肠杆菌制造丁酸的研究。一个研究使用菌株脂肪酸逆向 3氧化反应（reverse 0-oxidation)，此未涉及任何外源基因，且于48小时发酵后，菌株 可将30g/L葡萄糖反应成1. 3g/L 丁酸（参阅Seregina et al. 2010)。另一个研究通过梭 菌属途径来导入丁酸合成途径至大肠杆菌内，从而还原乙酰乙酰辅酶A (acetoacetyl-CoA) 成丁酰辅酶A(butyryl-CoA)，并导入内源tesB基因，从而转化丁酰辅酶A成丁酸（参阅 Lim et al.2013)，此研究结果显示丁酸/乙酸重量比值（B/A比值）为41。为改进Lim等 人提出的丁酸制备，近期的研究采取合成支架的方法，以结合途径中的hbd基因、crt基因 与ter基因等外源基因，而其菌株于葡萄糖馈料批式供应48小时下，可将19g/L葡萄糖转 化为7. 2g/L 丁酸（参阅Back et al. 2013)。尽管Back等人的技术可达到高丁酸产量，但 同时伴随生产4g/L乙酸（亦即，B/A比值约为1.8)。一般而言，B/A比值（或称"丁酸选 择率（butyrate selectivity)"）越低，后续须耗费更多金钱、时间或人力等成本来纯化丁 酸，故B/A比值为一个衡量梭菌属发酵表现的指标（参阅Zhang et al. 2009)。即使不活化 乙酸合成途径，酪丁酸梭菌（C. tyrobutyricum)依然具有为介于5~7的B/A比值（参阅 Liu et al. 2006)。最新的研究指出，重新构建困难梭菌（C. difficile)的丁酸合成途径于 大肠杆菌内，所构建的菌株的丁酸产率为〇. 27g/L，且同时仅会产生相当微量的乙酸（参阅 Aboulnaga et al. 2013)〇
【发明内容】
[0007] 本发明的第一方案提出一种可生产丁酸的菌株，其为大肠杆菌，且包含A噬菌体 Pt启动子、齿垢密螺旋体（Treponema denticola)的ter基因、丙酮丁醇梭菌的crt基因、 钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator)的phaA基因、及丙酮丁醇梭菌的hbd基因。X噬菌 体启动子镶嵌于菌株的染色体，以调控染色体上atoDA基因操纵子的表达，而ter基因、 crt基因、phaA基因、及hbd基因镶嵌于菌株的染色体，且菌株缺少adhE基因、frdA基因、 及ldhA基因。
[0008] 在本方案的实施方式中，A噬菌体匕启动子为镶嵌于染色体上atoDA基因操纵子 的上游区域，而较佳地为取代染色体上atoDA基因操纵子的启动子。
[0009] 在本方案的实施方式中，ter基因、crt基因、phaA基因、及hbd基因的表达受另一 个入噬菌体启动子调控。
[0010] 在本方案的实施方式中，菌株为大肠杆菌BL21的衍生品系，而较佳地为BL-A1。
[0011] 本发明的第二方案提出一种可生产丁酸的菌株，其为大肠杆菌并培养于外加乙酸 的培养液中，以利用乙酸来生成丁酸，且包含A噬菌体匕启动子、齿垢密螺旋体的ter基 因、丙丽丁醇梭囷的crt基因、钩虫贪铜囷的phaA基因、及丙丽丁醇梭囷的hbd基因。X喔 菌体启动子镶嵌于菌株的染色体，以调控染色体上atoDA基因操纵子的表达，而ter基 因、crt基因、phaA基因、及hbd基因为镶嵌于菌株的染色体，且菌株缺少adhE基因、frdA 基因、ldhA基因、及pta基因。
[0012] 在本方案的实施方式中，A噬菌体匕启动子镶嵌于染色体上atoDA基因操纵子的 上游区域，而较佳地为取代染色体上atoDA基因操纵子的启动子。
[0013] 在本方案的实施方式中，ter基因、crt基因、phaA基因、及hbd基因的表达为受另 一个入噬菌体启动子调控。
[0014] 在本方案的实施方式中，菌株为大肠杆菌BL21的衍生品系，而较佳地为BL-A1。
[0015] 本发明的第三方案提出一种可生产正丁醇的菌株，其为大肠杆菌，且包含A噬菌 体启动子、及丙酮丁醇梭菌的adhE2基因。A噬菌体匕启动子镶嵌于菌株的染色体，以 调控染色体上atoDA基因操纵子的表现，而adhE2基因镶嵌于菌株的染色体，且菌株缺少 adhE基因、frdA基因、ldhA基因、及pta基因。
[0016] 在本方案的实施方式中，A噬菌体匕启动子镶嵌于染色体上atoDA基因操纵子的 上游区域，而较佳地为取代染色体上atoDA基因操纵子的启动子。
[0017] 在本方案的实施方式中，adhE2基因的表达受另一个入噬菌体启动子调控。
[0018] 在本方案的实施方式中